第九章基因诊断

1、一、基本概念一、基本概念probeprobelsouthern 印记杂交lnorthern 印记杂交l斑点杂交l原位杂交southern blot是最经典的基因分析方法，不但能检出特异是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的的dnadna片段，而且能进行定量和测定分子片段，而且能进行定量和测定分子量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。分析等。northern杂交l直接采用pcr进行基因诊断l采用pcr产物的限制性片段长度多态性分析（pcr-rflps）进行基因诊断l采用pcr结合等位基因特异性寡核苷酸探针（aso）斑点杂交进行基因诊断 *l通过pc

2、r产物的反相点杂交(rbd)进行基因诊断l采用pcr产物的单链构象多态性(sscp)分析进行基因诊断l采用pcr技术对靶核酸进行定量分析寡核苷酸杂交分析寡核苷酸杂交分析snp和等位基因特和等位基因特异寡核苷酸杂交异寡核苷酸杂交 （aso）# dna序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法，可以确定突变的部位，突变的性质。 应用dna芯片，可以检测基因的结构及其突变多态性，对基因表达的情况进行分析。一、概述 l人类的遗传病达数千种地中海贫血在意大利等国家发病率达10镰状细胞贫血在美国黑人中发病率达14l我国常见的遗传性疾病有地中海贫血、异常血红蛋白病和血友病。l有效治疗难；通过基因诊断进

3、行携带者筛查，产前早期诊断，降低发病率。二、镰状细胞贫血l血红蛋白病（异常血红蛋白病）l红细胞呈镰刀状，寿命短，引起溶血性贫血。l患者多在成年以前死亡mst酶切位点酶切位点(cctnagg)5 3 正常基因正常基因5 3 突变基因突变基因1.15kb1.35kb（一）镰状红细胞贫血分子机制（一）镰状红细胞贫血分子机制5 67-pro gluglu-cct gag gag-5 67-pro alaglu-cct gtg gag-（二）镰状细胞贫血的基因诊断方法采集制备血液dna0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红

4、细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状细胞贫血的基因诊断方法引物引物1cct gag gagcct gtg gag引物引物1引物引物2引物引物2294bp103bp191bpmst酶切位点酶切位点(cctnagg)103bp191bp294bp正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者镰状红细胞贫血患者pcr产物的限制性酶切分析产物的限制性酶切分析lrt-pcr/序列分析采集制备血液rnart-pcr产物测序推测氨基酸序列进行诊断镰状细胞贫血的基因诊断方法二、0（一） （二） lpcr/aso斑点杂交法合成2对pcr引物（扩增区段700bp和580bp，分别包含14种和1种可能

5、突变）合成等位特异寡核苷酸(aso)探针（46对，分别标记）制备dna样品pcr扩增斑点印迹杂交lrflp分析法三ac左侧缺失左侧缺失4.2kb右侧缺失右侧缺失3.7kbbbba2112n端端1c端端正常基正常基因序列因序列pcr扩增法定性分析左侧缺失型左侧缺失型基因序列基因序列右侧缺失型右侧缺失型基因序列基因序列ac扩增0.4kbab无扩增片段ab扩增1.2kb0.4kb1.2kb正常人正常人右侧缺右侧缺失患者失患者地中海贫血患者基因组的地中海贫血患者基因组的pcr分析分析左侧缺左侧缺失患者失患者四、杜氏肌营养不良症（四、杜氏肌营养不良症（dmd） 1. dmd是常见的性连锁隐性遗传病，是常

6、见的性连锁隐性遗传病， 2. 主要特征是进行性肌萎缩和肠肌假性主要特征是进行性肌萎缩和肠肌假性肥大，肥大，xp21.2121.3区抗肌萎缩蛋白基区抗肌萎缩蛋白基因突变形式不同。因突变形式不同。dmd多在多在5岁发病，岁发病，10岁左右瘫痪，岁左右瘫痪，在在20岁左右由于心力和呼吸衰竭而死亡，岁左右由于心力和呼吸衰竭而死亡，其发病率为活产男婴的其发病率为活产男婴的1/3500。 苯丙氨酸苯丙氨酸羟化酶羟化酶（肝）（肝）五、苯丙酮尿症（五、苯丙酮尿症（pku）（一 ） （二）（二）pku的的dna诊断诊断l先合成asol如：正常探针：tccattaacagtaagaattt突变探针： tccatt

7、aacaataagaatttl 健康男性健康男性 男性携带者男性携带者男性患者男性患者 健康女性健康女性 女性携带者女性携带者女性患者女性患者正常探针突变探针慢粒：（染色体易位）费城染色体pcr检测融合基因着丝粒着丝粒 染色体染色体 22 bcr genec- abl gene 染色体染色体 9 bcr-mrna bcr-abl mrna 染色体染色体 9, 22 bcr-abl 融合蛋白（具融合蛋白（具ptk活性）活性） 慢性骨髓白血病慢性骨髓白血病 引物a 引物 b特点l简便、特异、快捷l能检测出潜在的病原体l可对病原体进行分类、分型鉴定l不能得知病原体进入体内后机体的反应二、基因诊断的感

8、染性疾病（一）、病毒特点：病毒核酸分析技术hbv包含4个开放阅读框，s、c、p、xpcrpcr/限制性内切酶谱分析pcr/点杂交,pcr/southern blot基因芯片目的基因 引物序列扩增片段c5actgttcaagcctccaagct3 425 bp5agtgcgaatccacactc3 ltr gag pol env tat，rev ltr调节蛋白基因调节蛋白基因* *hivhiv病毒基因组结构病毒基因组结构目的基因 引物序列扩增片段env5acaattattgtctggtatag3135 bp5aggtatctttccacagccag3 hiv-1probe tgagttgcaacagatgctgttgcgcctcaatagccctcagpcr/核酸杂交诊断艾滋病sarsrtpcr 多重pcr 荧光定量pcr（二）、细菌细菌性痢疾志贺菌，侵袭性大肠杆菌，大质粒；pcr结核病pcr （三）、寄生虫 重复序列探针法、寡核苷酸探针法、基因组探针法、pcr l一些多基因、多因素疾病，不仅涉及多个基因还涉及一些环境因素及其与基因的相互作用。l表型克隆从分析正常与异常基因组的相同或差异，找到正常人与疾病患者之间的差异序列和相同序列，进而分离、鉴定与疾病相关的多个基因，确定导