作物学实验：实验四 植物组织总DNA的提取、扩增及电泳检测

1、实验四实验四 植物组织总植物组织总DNA的提取、的提取、扩增及电泳检测扩增及电泳检测 掌握用掌握用CTAB法提取植物总法提取植物总DNA的方法和基本原理，的方法和基本原理，熟悉从高等植物中提取基因组熟悉从高等植物中提取基因组DNA的技术流程。的技术流程。 掌握分子生物学实验操作过程中常见仪器的使用。掌握分子生物学实验操作过程中常见仪器的使用。一、实验目的一、实验目的第一部分 植物基因组DNA的提取（ CTAB法原理，植物法原理，植物DNA提取经典方法）提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污

2、剂，可溶解细胞膜基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来，得以游离出来，并与核酸形成复合物。并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。醇沉淀即可使核酸分离出来。注：注：CTAB溶液在低于溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且

3、离心时温度不要低于植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。二、实验原理二、实验原理 2CTAB提取缓冲液提取缓冲液 组份组份 Tris-HCl (pH8.0)EDTA (pH8.0) NaCl CTAB 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分

4、离；溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； 通常采用通常采用机械研磨机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，的方法破碎植物的组织和细胞，在在液氮中研磨液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。种酶类的作用。 再加入氯仿等有机溶剂，能使再加入氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性蛋白质变性，并使抽提液，并使抽提液分相，因核酸分相，因核酸(DNA(DNA、RNA)RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液上清液中加入中加入异丙醇使异丙醇使DNADNA沉淀沉淀，沉淀

5、，沉淀DNADNA溶于双蒸水或溶于双蒸水或TETE溶液中，即得植物总溶液中，即得植物总DNADNA溶液。溶液。幼嫩的水稻幼苗幼嫩的水稻幼苗三、实验材料三、实验材料四、实验器具、药品试剂四、实验器具、药品试剂微量移液器，台式离心机，微量移液器，台式离心机，60水浴锅，枪头，离水浴锅，枪头，离心管，液氮，木筷，心管，液氮，木筷，37恒温箱等。恒温箱等。 2 CTAB抽提溶液、氯仿、异丙醇、抽提溶液、氯仿、异丙醇、 70%乙醇、乙醇、双蒸水（双蒸水（ddH2O)等等 CTAB法流程图法流程图植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨氯仿抽提氯仿抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解离

6、心洗涤离心洗涤异丙醇沉淀异丙醇沉淀DNA溶液溶液1、取水稻幼苗置于2ml 离心管中，加液氮研磨成粉末，加入750 l DNA提取液（2XCTAB）混匀，60水浴，30分钟（每隔10min轻轻混匀一次）。2、加等体积（750l）的氯仿，充分振荡，10000rpm离心,10min。3、取500l上清液于另一1.5ml离心管中，加入1.0倍（500l）的异丙醇，缓慢摇动,并静置5min，使DNA沉淀，10000rpm离心,5min。4、用移液器吸出1ml上清液，加500l 70%乙醇洗涤DNA沉淀,用移液器吸出500l 70%乙醇。5、打开离心管盖，将离心管平放在37 烘箱内，烘干沉淀。6、加入30

7、l的ddH2O溶解DNA。7、用1.0%琼脂糖凝胶的电泳检测。五、实验方法五、实验方法（1）叶片磨得）叶片磨得越细越好越细越好。（2）由于植物细胞中含有大量的）由于植物细胞中含有大量的DNA酶酶，因此，除，因此，除在抽提液中加入在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操抑制酶的活性外，第一步的操作应作应迅速迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使酶，使DNA降解。降解。（3）移液器的使用。）移液器的使用。六、注意事项六、注意事项1. 1.移液器移液器规范操作步骤规范操作步骤第一步第一步 设定移液体积设定移液体积 从大体积调节至小体积时，为正

8、常调节方法，逆时针旋转刻度即可，从小体积调节至大体积时，可先顺时针调至超过设定体积的刻度，再回调至设定体积，可保证最佳的精确度。七、移液器的使用七、移液器的使用第二步第二步 装配装配移液器移液器吸头：吸头：将移液器端垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可；特别提示：特别提示：用移液器反复撞击吸头来上紧的方法是非常不可取的，长期这样操作，会导致移液器中的零部件因强烈撞击而松散，甚至会导致调节刻度的旋钮卡住。第三步第三步 吸液和放液吸液和放液吸液吸头尖端需浸入液面3 mm 以下慢吸慢放，控制好弹簧的伸缩速度放液时吸头尖端靠在容器内壁 正向吸液与反向吸液正向吸液与反向吸液正向吸液正向吸液是指正常的吸液

9、方式，操作时吸液可将按钮按到第一档 吸液，释放按钮。放液时先按下第一档，打出大部分液体，再按下第二档， 将余液排出。反向吸液反向吸液是指吸液时将按钮直接按到第二档再释放，这样会多吸入一些液体，打出液体时只要按到第一档即可。多吸入的液体可以补偿吸头内部的表面吸附，反向吸液一般与预润湿吸液方式结合使用，适用于粘稠液体和易挥发液体。错误的操作方式错误的操作方式错误： 装配吸头时用移液器反复撞击吸头，以上紧正确： 插入吸头，左右轻转旋转上紧吸头错误： 吸头与移液器不匹配， 影响气密性正确： 选用与移液器匹配的，有质量保证的吸头错误： 吸液时，移液器倾斜吸液正确： 垂直吸液 错误： 吸头内含有未打出的液

10、体时，移液器平置于桌面正确： 将移液器垂直挂在移液器支架上错误： 用大量程的移液器移取小体积的液体正确： 移液体积需保证在移液器所提供的量程范围之 内才符合不准确度和不精确度的要求错误： 吸液速度和放液速度过快正确： 慢吸慢放 A, 保持微量移液器垂直，将按钮压至第一段；B, 微量移液器头尖端浸入溶液，缓慢释放按钮；C, 保持微量移液器垂直，将微量移液器头与容器壁接触，慢慢压下按钮至第一段；D, 压至第二段把溶液完全释放出；E, 释放按钮回原状。 使用完毕，可以将其竖直挂在移液枪架上，但要小心别掉下来。 如不使用，要把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧。台式离心机的使用

11、按离心机后方开关键打开离心机电源开关；按离心机后方开关键打开离心机电源开关；平衡对称放置离心管；平衡对称放置离心管；设置离心参数：设置离心参数：调节速度设置按钮，设定所需离心速度，本实验中设定为调节速度设置按钮，设定所需离心速度，本实验中设定为10000rpm；揿分揿分/秒选择按钮，确定使用秒选择按钮，确定使用“分分”或或“秒秒”计计 时，再调节时，再调节时间设置按钮，设置离心时间；时间设置按钮，设置离心时间；盖上转头盖和离心机盖盖上转头盖和离心机盖 ，按，按“start”键，离心机工作；键，离心机工作；如发现有不平衡或其他异常情况，按如发现有不平衡或其他异常情况，按“stop”键立即停键立即

12、停止离心；止离心；使用完毕，擦干离心机，打开盖子，做好使用记录。使用完毕，擦干离心机，打开盖子，做好使用记录。注意： A离心管必须平衡，才能启动离心机。 B最大离心速度不得超过13000rpm。聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase chain Reaction，PCR)可以体外快速扩增可以体外快速扩增DNA。美国美国Mullis(1986)发明发明，是现代生物学发展史上的是现代生物学发展史上的一个一个里程碑里程碑。PCRPCR反应三个步聚反应三个步聚( (一个循环一个循环) )：1. 1. 变性变性：9494使模板使模板DNADNA双链变成单链；双链变成单链；2. 2. 复性复性

13、：50655065下，引物分别与互补的下，引物分别与互补的DNADNA单链互补单链互补配对；配对；3. 3. 延伸延伸：在引物的引导和在引物的引导和TaqTaq酶作用下，于酶作用下，于72 72 下合成下合成模板模板DNADNA的互补链。的互补链。第二部分第二部分 PCR扩增扩增 PCR反应体系反应体系 DNA模板模板 dNTP Taq DNA聚合酶聚合酶 引物引物 Mg2+ 缓冲液缓冲液PCR反应程序反应程序预变性预变性 94 35min35循环：循环： 变性变性 94 30s1min 退火退火 5065 3060s 延伸延伸 72 12min 后延伸后延伸 72 510minPCR产物电泳

14、检测结果产物电泳检测结果第三部分第三部分 DNA检测检测 电荷效应：电荷效应：DNADNA分子在高于其等电点的分子在高于其等电点的pHpH溶溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。液中带负电荷，在电场中向正极移动。一、实验目的一、实验目的 通过此实验操作，掌握琼脂糖凝胶电通过此实验操作，掌握琼脂糖凝胶电泳技术、泳技术、DNADNA的分离鉴定。的分离鉴定。二、实验材料、仪器和试剂二、实验材料、仪器和试剂材料：材料：DNA样品样品仪器：电泳液、水平凝胶电泳槽、移液器、紫外透射仪、仪器：电泳液、水平凝胶电泳槽、移液器、紫外透射仪、Tip头头试剂试剂 电泳缓冲液电泳缓冲液(1TAE)：0.04mol/L三

15、羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷-乙酸乙酸(Tris-Acetic acid)，0.01mol/L乙二胺四乙酸二钠乙二胺四乙酸二钠(EDTA) 溴化乙锭溴化乙锭(EB 10mg/ml)：100ml灭菌双蒸水中加入灭菌双蒸水中加入1g EB 1.0%琼脂糖：琼脂糖：100ml 1TAE加入加入1.0g琼脂糖琼脂糖 上样缓冲液上样缓冲液(溴酚蓝溴酚蓝-甘油溶液甘油溶液)：先配制：先配制1%的溴酚蓝水溶的溴酚蓝水溶液与等体积的甘油即可液与等体积的甘油即可三、实验步骤三、实验步骤( (一一) )制胶制胶1.将将1.0g琼脂糖加至琼脂糖加至100 ml 1TAE缓冲液中，配成缓冲液中，配成1%琼脂糖。琼脂

16、糖在微琼脂糖。琼脂糖在微波炉中加热熔化。灌胶前将琼脂糖冷却至波炉中加热熔化。灌胶前将琼脂糖冷却至60左右（不烫手）。左右（不烫手）。2.加入10ul GoldView I 至熔化的琼脂糖液中混匀，但避免出现气泡。3.准备好凝胶成型器。准备好凝胶成型器。4.在凝胶一侧放入成型梳，将梳子置在胶上方的桥上，并保证梳齿在塑料板在凝胶一侧放入成型梳，将梳子置在胶上方的桥上，并保证梳齿在塑料板稍上一点，但不要接触塑料板。稍上一点，但不要接触塑料板。 5.将冷却的琼脂糖倾入用凝胶成型器，制备凝胶（胶厚度宜不超过将冷却的琼脂糖倾入用凝胶成型器，制备凝胶（胶厚度宜不超过0.5cm)。6.待胶完全凝固，呈乳白状且

17、不透明（约待胶完全凝固，呈乳白状且不透明（约20分钟），轻轻去除梳子。配制分钟），轻轻去除梳子。配制2L 1TAE缓冲液。将缓冲液到入洁净的凝胶槽。缓冲液。将缓冲液到入洁净的凝胶槽。（二）电泳（二）电泳1.将凝胶塑料板水平放置在电泳槽中。将凝胶塑料板水平放置在电泳槽中。2.凝胶应完全浸入缓冲液，但覆盖的缓冲液不要超过凝胶应完全浸入缓冲液，但覆盖的缓冲液不要超过1cm。3.取取25ul样品加入上样缓冲液，小心的将样品加入每一样品槽内样品加入上样缓冲液，小心的将样品加入每一样品槽内4.接通电源，电压接通电源，电压100V，DNA从负极移到正极。时间从负极移到正极。时间30-40分钟。分钟。5.关掉电源，结束电泳。关掉电源，结束电泳。6.将凝胶放紫外灯下观察。将凝胶放紫外灯下观察。1. 将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于自动成像系统的平台中间将