细胞生物学实验：实验六－动物细胞原代培养

1、上次实验总结上次实验总结 实验名称实验名称：实验五 聚乙二醇诱导鸡血细胞融合 实验结果实验结果：李燕淑实验结果李燕淑实验结果实验六实验六 动物细胞原代培养动物细胞原代培养指导教师：何春梅 林建中1 实验目的实验目的(1) 学习动物细胞原代培养的一般方法与步骤。(2) 学习培养细胞的观察方法。(3) 掌握无菌操作技术。2 实验原理实验原理 细胞培养是把生物体内的细胞取出，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使其生存、生长，繁殖，借以观察研究细胞的各种生命现象。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求： 一是供给细胞存活所必

2、需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。 二是严格控制无菌条件。 细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）是指直接从有机体获取细胞立即进行培养。任何动物细胞的培养均需从原代细胞培养做起。动物很多组织的细胞，如动物的肾、肺、卵巢、精巢等组织的细胞较易培养，而神经细胞等较难培养。 传代培养（subculture）是指当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发

3、生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。3 实验材料实验材料,仪器和试剂仪器和试剂3.1 实验材料：实验材料：孕鼠或新生乳鼠孕鼠或新生乳鼠孕鼠孕鼠新生乳鼠新生乳鼠3.2 实验仪器实验仪器： 超净工作台，眼科剪，眼科镊，平养皿，试管，培养方瓶，滴管，橡皮头，橡皮塞，恒温箱，倒置显微镜。超净工作台超净工作台倒置显微镜倒置显微镜高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅CO2培养箱培养箱3.3 实验药品和试剂实验药品和试剂1640培养基；青霉素溶液100单位mL；0.25胰酶溶液;Hanks液;

4、75酒精 1640培养基4 实验步骤实验步骤4.1 组织块的获取和细胞培养组织块的获取和细胞培养 取材：取新生乳鼠一只，浸入75酒精中浸泡5秒钟左右，携入超净工作台内，置于消毒培养皿中，用Hanks液洗涤2次，再剖开胸腹腔，剪取黄豆大小的肺、肾、心、肝、皮肤等组织，分别置于无菌平皿中。 清洗：用含双抗的Hanks液洗涤二次，并剔除脂肪、血液等。 剪切：组织块移入无菌短试管或青霉素瓶中，用眼科剪将组织块剪成1 mm3大小的碎块，再用Hanks液洗涤2次，自然沉淀，弃去带血的上清液。(以下视频由2009级周泉同学提供) 消化：加入0.25胰蛋白酶液0.2ml，消化5-10分钟，吸去消化液，用Han

5、ks液洗一次；再用培养液洗一次。 接种：用吸管将组织块吸入方形培养瓶内，均匀分散于底壁上，将此面(有标本的面)朝上，加入2-3ml培养液，塞好瓶塞，做好标记，置37 温箱中培养。培养：4-5小时后将培养瓶翻转，使有标本的瓶底壁朝下，使培养液浸泡组织块，继续置37温箱中培养。 4.2 原代培养细胞的观察原代培养细胞的观察 组织块培养2-3天后开始，每天小心取出培养瓶置于倒置显微镜下进行观察，并拍照。 一般最先“长出”的是形态不规则的游走细胞，接着“长”出成纤维细胞或上皮细胞，后逐渐出现细胞分裂，细胞数量增多，在组织块周围形成较大生长晕，随之细胞生长较快。 可根据培养液颜色变化，补加和更换培养液。如细胞生长良