03分子标记刘晓雪

1、1第三节第三节 分子标记技术分子标记技术2一、分子标记的概念一、分子标记的概念 v广义的分子标记广义的分子标记(molecular marker)(molecular marker)是指可遗传的是指可遗传的并可检测的并可检测的dnadna序列或蛋白质。序列或蛋白质。v蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。同分子形式）。v狭义的分子标记概念只是指狭义的分子标记

2、概念只是指dnadna标记，而这个界定标记，而这个界定现在被广泛采纳：现在被广泛采纳： 能反映生物个体或种群间基因组中某种差异能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的特征的dnadna片段，它直接反映基因组片段，它直接反映基因组dnadna间的差异。间的差异。3二、分子标记的种类二、分子标记的种类 分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为三大类。 第一类第一类是以分子杂交为核心的分子标记分子杂交为核心的分子标记技术技术，包括：限制性片段长度多态性标记限制性片段长度多态性标记（restriction fragment length polymorphism, 简称rflp标记）； dna

3、指纹技术指纹技术（dna fingerprinting）；原位杂交原位杂交（in situ hybridization）等；4 第二类第二类是以聚合酶链式反应（以聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ,简称简称pcr反应）为核心的分子标记技术反应）为核心的分子标记技术，包括： 随机扩增多态性随机扩增多态性dna标记标记（random amplification polymorphism dna, 简称rapd标记）； 简单序列重复标记简单序列重复标记（simple sequence repeat, 简称ssr标记）或简单序列长度多态性（simple sequenc

4、e length polymorphism, 简称sslp标记）； 扩展片段长度多态性标记扩展片段长度多态性标记（amplified fragment length polymorphism, 简称aflp标记）； 序列标签位点序列标签位点（sequence tagged sites, 简称sts标记）； 序列特征化扩增区域序列特征化扩增区域（sequence charactered amplified region, 简称scar标记）等；5 第三类第三类是一些新型的分子标记，如： 单核苷酸多态性单核苷酸多态性（single nuleotide polymorphism, 简称snp标记）；

5、 表达序列标签表达序列标签（expressed sequences tags, 简称est标记）等。6三、分子标记的特点三、分子标记的特点（1）直接以）直接以dna的形式表现，在生物体的各个组的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；限制，不存在表达与否等问题；（2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；乎无限；（3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；人为创造；（4）表现为中性，不影响目标性状的表

6、达；）表现为中性，不影响目标性状的表达；（5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。体和杂合体。7四、几种常用的分子标记四、几种常用的分子标记（一）（一）限制性片段长度多态性标记限制性片段长度多态性标记（restriction fragment length polymorphism, rflp） 该技术由该技术由grodzicker等于等于1974年创立。年创立。 特定生物类型的基因组特定生物类型的基因组dna经某一种限制性内切经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段，酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段，或称

7、限制性等位片段。或称限制性等位片段。rflp标记技术的基本原理就标记技术的基本原理就是通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡是可以引是通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段切位点）和一段dna的重新组织（如插入和缺失造成的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限制性等位酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生片段的变化，从而产生rflp。8commonly used restriction enzymes 9ecor酶切示意图酶切示意图

8、 5 ag-gaattc-gaattc-gaattc-cg 33 tc-cttaag-cttaag-cttaag-gc 5v ag-g aattc-g aattc-g aattc-cg tc-cttaa g-cttaa g-cttaa g-gc100.1kb0.2kb0.4kb0.5kb0.3kb0.4kb0.5kb(1)(2)0.2kb0.3kb0.5kb品系品系1 品系品系20.4kb0.1kb+11v基本步骤基本步骤 dna提取提取用用dna限制性内切酶消化限制性内切酶消化 凝胶电泳分离限制性片段凝胶电泳分离限制性片段 将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作将这些片段按原来的顺序和位置

9、转移到易操作的滤膜上的滤膜上 用放射性同位素或非放射性物质标记的用放射性同位素或非放射性物质标记的dna作作探针与膜上的探针与膜上的dna杂交（称杂交（称 southern杂交）杂交） 放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性。探针的限制性酶切片段多态性。 12 rflp标记的主要特点有：标记的主要特点有：v（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；限的；v（2）无表型效应，不受发育阶段及器官）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；特异性限制；v（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；）共显性，可

10、区分纯合子和杂合子；v（4）结果稳定、可靠；）结果稳定、可靠；v（5）dna需要量大，检测技术繁杂，难需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。以用于大规模的育种实践中。13abab限制性内切酶位点与放射性探针结合部位限制性内切酶酶切后；电泳分离dna片段；转移至硝酸纤维素薄膜；与放射性探针杂交，分析阳性条带14（二二）随机扩增多态性随机扩增多态性dna标记标记(rapd)v由由williams等于等于1990年创立。其基本原理与年创立。其基本原理与pcr技技术一致。术一致。 vrapd标记技术就是用一个（有时用两个）随机引标记技术就是用一个（有时用两个）随机引物（一般物（一般8-1

11、0个碱基）非定点地扩增基因组个碱基）非定点地扩增基因组dna，然后用凝胶电泳分开扩增片段。然后用凝胶电泳分开扩增片段。v遗传材料的基因组遗传材料的基因组dna如果在特定引物结合区域发如果在特定引物结合区域发生生dna片段插入、缺失或碱基突变，就有片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致pcr产产物增加、缺少或发生分子量变化。物增加、缺少或发生分子量变化。若若pcr产物增加产物增加或缺少，或缺少，则产生则产生rapd标记。标记。 15亲本中国春小麦、节节麦双倍亲本中国春小麦、节节麦双倍体和子代的体和子代的rapd电

12、泳图谱电泳图谱 v 引物为引物为s516: : ctctgcgcgt ctctgcgcgt v泳道泳道1为中国春小麦，为中国春小麦，v泳道泳道2、二者的子代，、二者的子代，v泳道泳道3为节节麦。为节节麦。 160.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.3kb0.5kb品系品系1 品系品系217vrapd扩增克隆鱼(b)、供体红鲤(a)、受体金鱼(d)和杂交鱼(c，即axd)的细胞核dna指纹图谱。结果显示，对于不同的引物，克隆鱼的扩增谱带均和供体红鲤的一致，迥异于受体金鱼和杂交鱼。18vrapd标记的主要特点有：v（1）不需dna探针，设计引物也无须知道序列信息

13、；v（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；v（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；v（4）dna样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；v（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。 19v通过对基因组通过对基因组dnadna酶切片段的选择性扩增来酶切片段的选择性扩增来检测检测dnadna酶切片段长度的多态性。酶切片段长度的多态性。aflpaflp揭示揭示的的dnadna多态性是酶切位点和其后的选择性碱多态性是酶切位点和其后的选择性碱基的变异。基的变异。扩增片段长度多态性，扩增片段长度多态性，20fig. aflp autoradiographs of 14 rice

14、cultivars using two primer combinations.21v荷兰荷兰keygenekeygene公司公司zabeauzabeau等（等（19921992）、）、zabeauzabeau和和vosvos等（等（19931993）发展了一种检测）发展了一种检测dnadna多态性的新方法多态性的新方法aflpaflp（amplified amplified fragment length polymorphismfragment length polymorphism）：）：vrflprflp接头引物接头引物pcraflppcraflpvaflpaflp既是进行酶切位点分析

15、又要对酶切片段既是进行酶切位点分析又要对酶切片段进行选择性扩增，因此它既具备进行选择性扩增，因此它既具备rflprflp的准确的准确性又具有性又具有pcrpcr的高效性，综合了两者的优点，的高效性，综合了两者的优点，并于并于19931993年获得欧洲专利局专利。年获得欧洲专利局专利。ecor imse i（限制性内切酶）ecor i接头mse i接头ecor i引物+amse i引物+c（预扩增）ecor i引物+aacmse i引物+caa （选择扩增）（连接）（电泳检测）引物和接头引物和接头(adapter)合成合成引物和接头合成是引物和接头合成是aflp技术中重要的步骤，引物技术中重要的

16、步骤，引物和接头的改进是和接头的改进是aflp较较rapd、pcr最主要的变革。最主要的变革。引物可通过引物可通过dna自动合成仪人工合成，自动合成仪人工合成，aflp引引物的设计主要由接头的设计决定，物的设计主要由接头的设计决定，aflp引物的一个引物的一个重要特征是所有引物起始于重要特征是所有引物起始于5残基，残基，5端是与接头序端是与接头序列相对应的。列相对应的。引物主要由引物主要由3部分组成：部分组成：核心序列核心序列(core)；酶特异序列酶特异序列(enz)；选择性延伸序列选择性延伸序列(ext)。如如ecoriecori引物和引物和mseimsei引物引物(ext(ext用用nn

17、nnnn表示，表示，n n表示任何碱基表示任何碱基) ) core core enz enz extext ecori ecori 5-5-gactgcgtacgactgcgtacc c aattc aattc nnn-3 nnn-3 msei msei 5-5-gatgagtcctgatgagtcctgag gag taa taa nnn-3 nnn-3 接头一般由二部分组成：核心序列和酶特异序列，接头一般由二部分组成：核心序列和酶特异序列，如如ecori接头和接头和msei接头：接头：ecori-adapter:5-ctcgtagactgcgtacccatctgacgcatggttaa-5

18、msei-adapter:5-gacgatgagtcctgagtactcaggactcat-526aflp技术的优点v（1 1）酶切所需）酶切所需dnadna量少（仅需量少（仅需5050300ng300ng）, ,也可也可以作用于以作用于mitdnamitdna；v（2 2）多态性检测能力高，既能检测酶切位点不同）多态性检测能力高，既能检测酶切位点不同造成的多态性，又能检测随机选择碱基造成的多态造成的多态性，又能检测随机选择碱基造成的多态性；性；v（3 3）简单高效，一次选择扩增就能比较几十甚至）简单高效，一次选择扩增就能比较几十甚至上百个位点；上百个位点；v（4 4）分辨率高，扩增片段短，片

19、段多态性检出率）分辨率高，扩增片段短，片段多态性检出率高；高；v（5 5）可靠性与重复性好。）可靠性与重复性好。aflpaflp由于是特定引物扩由于是特定引物扩增，退火温度高，因而假阳性低，重复性好。增，退火温度高，因而假阳性低，重复性好。aflpaflp集集rflprflp、pcrpcr和和rapdrapd的优点于一身，并且克服了的优点于一身，并且克服了rflprflp和和rapdrapd的缺点。的缺点。aflpaflp技术的优点：技术的优点：27aflp技术的不足技术的不足v（1 1）aflpaflp技术受到专利保护，试剂盒昂贵，技术受到专利保护，试剂盒昂贵，成本较高；成本较高；v（2 2

20、）对）对dnadna的纯度和内切酶的质量要求较的纯度和内切酶的质量要求较高，技术要求高。现在一般都采用银染和荧高，技术要求高。现在一般都采用银染和荧光标记的方法来代替放射性同位素标记，因光标记的方法来代替放射性同位素标记，因而避免了辐射伤害。而避免了辐射伤害。v（3 3）操作繁琐。）操作繁琐。28（四）简单序列重复标记，（四）简单序列重复标记，ssrv又称微卫星又称微卫星dna(micro-satellite dna)dna(micro-satellite dna)标记；标记；v属高度重复序列，重复单元属高度重复序列，重复单元26bp，如，如(ca)n、(at)、(ggc)n等重复，重复区大多

21、几十等重复，重复区大多几十几百几百bp，分散在，分散在基因组中，大多不存在于编码序列内，具有较高的基因组中，大多不存在于编码序列内，具有较高的多态性。多态性。呈现孟德尔式遗传。呈现孟德尔式遗传。目前微卫星目前微卫星dnadna已经发已经发现了万余个位点。现了万余个位点。ttcagctagctttcagctagctcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagagcttgcagcttgcaagtcgatcgaaagtcgatcgagtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtctcgaacgtcgaacg29marker name: dpl048

22、9forward sequence: actcctccttgctcatgttgaatareverse sequence: catggatgactcttctgcttcatalinkage: ch22 motif: atac# of repeats: 10 forward_tm: 61.341 reverse_tm: 60.632 forward_gc%: 41.667 reverset_gc%: 41.667 clone sequence: gcactcctccttgctcatgttgaatatcaaacactcttctataagatgatgcacctgcat aaatac atac atac

23、atac atac atac atac atac atac atac atgatcatcttggaaaca actataactttatggaaattgctatataatacttaccatatggatgtatgaagcagaaga gtcatccatgttcatgaaatcatccaaatattggtactgagtttaggctttttccaccaa gaactagcagagtggaaattatataatagaggaaacagggggatgaagaagaaacaagac atgatgtcataggttgttggttgggtccgatgtcccacgtgggacgatgtctatgattgg tg

24、gagatgagattttattaccaagcaccactcttctgtccgaag30ssr标记在f1、亲本及f2中的多态情况3132微卫星微卫星dna pcrdna pcr扩增结果（示例）：扩增结果（示例）：500bp500bp400bp400bp300bp300bp240bp240bp 该结果显示在所检查的人群中，该位点多态性有该结果显示在所检查的人群中，该位点多态性有4 4种。种。33 引物 1 alu (ca)n alu alu (gt)n alu 引物 2 显性表型 (p)a f 和 h 总是一道遗传链锁？b a 和 b 总是分开遗传是等位基因？cd a 和 d 有 50是重组的不

25、连锁？e f，h 和 e 之间 f 和 h 紧密连锁，f f 和 e 不连锁(不在一条染色体上)gh p 等位基因可能和 i 及 c 连锁。i 图 10 在作图中用 dna 指纹作为标记34ssr标记的主要特点标记的主要特点（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）具有较多的等位性变异；）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费

26、用的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。也较高。 在在ssr标记技术中，采用标记技术中，采用pcr反应必须知道扩增反应必须知道扩增dna片段两侧序列片段两侧序列，在大多数情况下，某些序列本身或其旁测序列并不清楚，而且由于，在大多数情况下，某些序列本身或其旁测序列并不清楚，而且由于ssr两侧引物具有物种特异性，引物设计费时耗力，要检测多个基因座两侧引物具有物种特异性，引物设计费时耗力，要检测多个基因座是不现实的。这就限制了是不现实的。这就限制了pcr技术的应用，技术的应用，“锚定锚定pcr（anchored pcr）”可克服上述障碍。锚定简单重复序列（可克服上述障碍。锚定简单重复序列（a

27、nchored simple sequence repeat，assr），也称作简单重复序列间区（），也称作简单重复序列间区（inter-simple sequence repeat，issr）标记技术或者以微卫星为引物的）标记技术或者以微卫星为引物的pcr（microsatellite-primed pcr, mp-pcr）技术。）技术。issr标记技术由加拿大蒙特利尔大学的标记技术由加拿大蒙特利尔大学的zietkiewicz等于等于1994年提出。年提出。用锚定的微卫星用锚定的微卫星dna为引物，即在为引物，即在ssr序列的序列的3端或端或5端加上端加上24个随机核苷酸，在个随机核苷酸，在

28、pcr反应中，锚定引物可以引起特定位点退火，导致反应中，锚定引物可以引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间dna片段进行片段进行pcr扩增。所扩增。所扩增的扩增的interssr区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辨，扩增带多为显性表现。胶电泳得以分辨，扩增带多为显性表现。锚定锚定issr-pcr示意图示意图5锚定引物锚定引物nnnn(ca)n3锚定引物锚定引物nn(ca)ncacacacacacacacagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtg

29、tgtgtgtgtgtgtgtcacacacacacacacacacacacacaca5锚定引物锚定引物nnnn(ca)n3锚定引物锚定引物nn(ca)n3锚定引物的锚定引物的pcr产物产物5锚定引物的锚定引物的pcr产物产物用重复序列用重复序列(ca)n作单引物，在引物的作单引物，在引物的5端或端或3锚定锚定1至数个碱基。至数个碱基。issr遗传多态性高，重复性好。（遗传多态性高，重复性好。（1724bp）符合孟德尔遗传规律。符合孟德尔遗传规律。无需知道任何靶标序列的无需知道任何靶标序列的ssr背景信息。背景信息。dna用量少用量少advantages：pcr扩增反应的最适条件需要一定时间摸

30、索。扩增反应的最适条件需要一定时间摸索。issr标记大多是显性标记标记大多是显性标记disadvantages：dnaextractionandpurificationprimerdesign issr引物常为5端或3 加猫（24个碱基）的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸序列，重复次数常为48次。pcramplification6page detectofpcrproductandstatisticalanalysis扩增步骤与扩增步骤与rapd相似，但不同引物、不同材料的扩增条件有异。相似，但不同引物、不同材料的扩增条件有异。primer0.20.8mol/ltemplatedna550ngta

31、qdnapolymerase0.41u需要做预备实验优化需要做预备实验优化pcr条件，以获得清晰、可重复，易统计的条件，以获得清晰、可重复，易统计的条带。条带。25l0.52.0%agarosegelelectrophoresisebstaining silverstaining yes1no042（五）（五）单核苷酸多态性单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism snp)1. 定义v单核苷酸多态性(snp)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。 不同个体间，基因组不同个体间，基因组dna某部位的某部位的 单核苷酸的变异。单核苷

32、酸的变异。1996年，年，lander报道了用单核苷酸多态性报道了用单核苷酸多态性标记（标记（single nucleotid polymorphism snp）制备第三代遗传连锁图的遗传标记。制备第三代遗传连锁图的遗传标记。43p2 p1f144bb f1 bb p2 bb p1452. snp在人类基因组中出现的频率在人类基因组中出现的频率 snp在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就有1个，估计其总数可达1700万个甚至更多。 there is one snp in every 1000 bases leads to an estimate that any two i

33、ndividuals differ by up to three million snps. 在基因组dna中，任何碱基均有可能发生变异，因此snp既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的snp(coding snp,csnp)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此csnp的研究更受关注。46single nucleotide polymorphisms (snps)473. snp检测方法检测方法 目前已有多种方法可用于目前已有多种方法可用于snp检测检测：根据根据dna列阵的微测序法列阵的微测序法；动态等位基