分子生物学：第六章 DNA的限制和修复

1、第六章第六章DNA的限制和修复的限制和修复内容内容一、一、DNA的限制与修饰的限制与修饰二、限制酶切图谱二、限制酶切图谱三、三、DNA损伤与突变损伤与突变四、四、DNA损伤的修复损伤的修复1.限制与修饰系统限制与修饰系统是对外来是对外来DNA侵入的防卫机制。侵入的防卫机制。限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。各种细各种细菌菌都都能合成一种或几种能够切割能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，双链的核酸内切酶，它们它们以此来限制外源以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成存在于自身细胞内，但合成的这种酶的这种酶不影响细胞自身的不影响细胞自身的DNA

2、，因为这种细胞还合成了一种修饰，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对进行了修饰，限制性酶对修饰过的修饰过的DNA不能起作用。不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。现象。2)由两部分组成：由两部分组成：通过一定的识别位点水解外通过一定的识别位点水解外来来DNA的内部磷酸二酯键。的内部磷酸二酯键。b) 甲基化酶甲基化酶。在在DNA复制后，它把甲基加在构成限复制后，它把甲基加在构成限制酶识别位点序列中的腺嘌呤或胞嘧啶上，从而制酶识别位点序列中的腺嘌呤或胞嘧啶上，从而使细菌使细菌DNA获得对限制酶的抗性。获得对

3、限制酶的抗性。粘性末端粘性末端3) 限制性内切酶限制性内切酶有三有三种种类型类型按限制按限制性内切酶性内切酶的组成、的组成、是否具有是否具有修饰酶修饰酶活性以及活性以及切断核切断核酸的情况不同，限制酶酸的情况不同，限制酶可可分为三类：分为三类：I型，型，II型和型和III 型型。a. I和和III型限制性内切酶既能催化宿主型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，的甲基化，又催化非甲基化的又催化非甲基化的DNA的降解；的降解；b. II型限制性内切酶只催化非甲基化的型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的降解的降解（无无修饰酶活性修饰酶活性），且具有识别位点的专一性和切割位点的专一），且具有识别

4、位点的专一性和切割位点的专一性，一般在识别序列内切割，不需要性，一般在识别序列内切割，不需要ATP提供能量，提供能量，是重组是重组DNA技术中常用的限制性内切酶技术中常用的限制性内切酶。A. I型限制性内切酶型限制性内切酶a. 能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点很远的地方任能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点很远的地方任意切割意切割DNA链。链。b. 这类限制性内切酶由于不产生确定的限制酶切片段，这类限制性内切酶由于不产生确定的限制酶切片段，因此在因此在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析于分析DNA结构或克隆基因。结构或克隆基因。c. 这类酶如这

5、类酶如EcoB、EcoK等。等。TGANNNNNNNNTGGTAGTNNNNNNNNACCAB. III型限制性内切酶型限制性内切酶a. 有专一的识别顺序，但不是对称的回文序列有专一的识别顺序，但不是对称的回文序列b. 在识别序列旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。在识别序列旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对但这几个核苷酸对不是特异性的不是特异性的。c. 因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，片段，具有各种单链末端具有各种单链末端。d. 因此不能应用于基因克隆。因此不能应用于基因克隆。C. II型限制性核酸内切酶型

6、限制性核酸内切酶a. 能识别专一的核苷酸序列，并在该序列内的固定位置上能识别专一的核苷酸序列，并在该序列内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的，因此可都是专一的，因此可用于用于DNA重组重组和克隆和克隆。b. 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或个或6个核苷个核苷酸，少数也有识别酸，少数也有识别5个核苷酸以及个核苷酸以及7个、个、8个、个、9个、个、10个和个和11个核苷酸的。个核苷酸的。c. II型限制性内切酶的识别序列是一个型限制性内切酶的识别序列是一个回文对称序

7、列。回文对称序列。d. 酶的命名：酶的命名：v用用属名属名的头一个字母和的头一个字母和种名种名的头两个字母表示寄主菌的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如的物种名称，如E. coli 用用Eco表示（用斜体字）。表示（用斜体字）。v第四个字母代表第四个字母代表菌株菌株，如大肠杆菌，如大肠杆菌R型型菌株用菌株用R，即，即EcoR。v在同一品系细菌中得到的识别不同碱基序列的几种不在同一品系细菌中得到的识别不同碱基序列的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，用罗马数字表示，同特异性的酶，可以编成不同的号，用罗马数字表示，如如 EcoR I、EcoR V等。等。在指定在指定pH与温度下，与温度下，在在5

8、0 L反应反应体系中，体系中，1小时消化小时消化1g的的DNA的的酶量为酶量为1单位（单位（1U）。）。e. 酶切方式酶切方式平端：平端：两条链的切口在同一位置两条链的切口在同一位置粘性末端：粘性末端：两条链上的切口相互交错两条链上的切口相互交错，结果形成两，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可以重条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可以重新形成氢键，所以称为新形成氢键，所以称为粘性末端粘性末端。5突出末端：突出末端：切口靠识别序列的切口靠识别序列的5端。端。3突出末端：突出末端：切口靠识别序列的切口靠识别序列的3端。端。GCAATTGCTTAAG-OH-3CTTp-5

9、AA5-pAA3-OH-GCTTSticky endsGGCCTAATCCGGGGC-5TAC-33-CAT 5-CGG平（钝）末端平（钝）末端AGTCTAATCTGATCA-5AGT-33-TGA 5-ACT这些这些粘性粘性末端都可以通过末端都可以通过DNA连接酶连接酶重新连接起来。重新连接起来。5突出末端突出末端3突出末端突出末端53535353f. 酶切片段的大小酶切片段的大小不同酶的识别序列长度不同，不同酶的识别序列长度不同，4-8bp.酶切片段的长度变化很大酶切片段的长度变化很大，平均长度与识别序列长度有关平均长度与识别序列长度有关。限制性限制性酶切片段酶切片段平均长度平均长度=4n

10、 bp, n=识别序列的碱基数目。识别序列的碱基数目。GTAC二、二、限制限制酶切酶切图谱图谱1. DNA片段的电泳片段的电泳电泳的基质：琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶电泳的基质：琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶原理：原理：DNA带带负负电荷，在电场作用下，凝胶中电荷，在电场作用下，凝胶中DNA向向正极移动。片段移动的正极移动。片段移动的速度速度取决于片段的大小，较小取决于片段的大小，较小的片段移动较快。的片段移动较快。电泳的分辨率取决于凝胶的浓度。电泳的分辨率取决于凝胶的浓度。电泳电泳的的用途用途1) 从胶中分离和纯化不同从胶中分离和纯化不同长度长度的的DNA片段片段2) 分析特定片段的存在与否及其大

11、小。分析特定片段的存在与否及其大小。通常用分子量标准通常用分子量标准（Marker）来确定大小，也可以参来确定大小，也可以参照标准进行定量。照标准进行定量。 电泳方法电泳方法a) 水平电泳水平电泳b) 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶凝胶垂直电泳，垂直电泳，分分变性胶与非变性胶。分变性胶与非变性胶。分离离500 bp 以下的片段以下的片段。c) 脉冲场电泳脉冲场电泳 (PFGE)，分离大片段分离大片段DNA。2. 限制限制酶切酶切图谱图谱的的构建构建1. 定义：限制定义：限制酶切酶切图谱描述图谱描述的是的是一段一段DNA上特上特定酶切位点的线性位置定酶切位点的线性位置，是一种物理图是一种物理图谱谱。二

12、、二、限制限制酶切酶切图谱图谱1) 双酶解双酶解末端标记末端标记+部分酶解部分酶解三、三、DNA损伤与突变损伤与突变1.突变和突变和DNA重组是基因组进化的驱动力。重组是基因组进化的驱动力。突变突变(mutation)：是一个是一个DNA分子在碱基序列上发分子在碱基序列上发生的可遗传的变化。表现在碱基的改变或碱基数目的增生的可遗传的变化。表现在碱基的改变或碱基数目的增加或减少上。加或减少上。突变体突变体(mutant)：不同于正常或野生型形式的个体不同于正常或野生型形式的个体。2. 突变的类型：突变的类型：a) 点突变：单个碱基的变化，碱基对既不增加也不减点突变：单个碱基的变化，碱基对既不增加

13、也不减少，而是发生了少，而是发生了替换替换 (substitution)：转换转换( (Transition) )：嘧啶嘧啶嘧啶嘧啶，嘌呤嘌呤嘌呤嘌呤A/TG/C, T/AC/G颠换颠换( (Transversion) )：嘧啶嘧啶嘌呤嘌呤，嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶A/TC/G，T/AG/Cb) 碱基对的插入和缺失碱基对的插入和缺失c) 染色体结构变异：片段缺失、重复、倒位、转座染色体结构变异：片段缺失、重复、倒位、转座等等三、三、DNA损伤与突变损伤与突变3. 突变的效应：突变的效应：a)沉默突变沉默突变(silent mutation)：不影响氨基酸序列。发：不影响氨基酸序列。发生在非编码区，非调

14、节区或密码子的第三位。生在非编码区，非调节区或密码子的第三位。b)中性突变中性突变(neutral mutation)：突变的密码子编码不：突变的密码子编码不同但同但性质相似性质相似的氨基酸。的氨基酸。c)错义突变错义突变(missense mutation)：编码的氨基酸序列：编码的氨基酸序列发生改变，可能无作用也可能致死。发生改变，可能无作用也可能致死。三、三、DNA损伤与突变损伤与突变d) 无义突变无义突变(nonsense mutation)：形成新的终止密码子：形成新的终止密码子，编码截短了的蛋白。，编码截短了的蛋白。e) 移码突变移码突变(frame-shift mutation)

15、：碱基的插入或缺失：碱基的插入或缺失引起读码框引起读码框（ORF）的改变。的改变。f) 温度敏感突变温度敏感突变(temperature-sensitive mutation)：突变：突变蛋白质在某一温度有活性，在另一温度下失活。蛋白质在某一温度有活性，在另一温度下失活。g) 渗漏突变渗漏突变 (leaky mutation)：某某些氨基酸的变化些氨基酸的变化使得使得蛋白活性显著降低，蛋白活性显著降低，但但不是完全丧失不是完全丧失。4. 突变产生的方式突变产生的方式三、三、DNA损伤与突变损伤与突变(1) 自发突变和损伤自发突变和损伤(2) 物理诱变和化学诱变物理诱变和化学诱变(3) 转座元件

16、的插入导致突变转座元件的插入导致突变(1) 自发突变和损伤：自发突变和损伤：A. 碱基结构互变碱基结构互变酮式酮式(=O, =NH)烯醇式烯醇式(-OH, -NH2)，烯醇式烯醇式T与与G配对，烯醇式配对，烯醇式C与与A配对配对三、三、DNA损伤与突变损伤与突变A可以通过可以通过错配修复机制进行修复。错配修复机制进行修复。B. 复制错误未被复制错误未被DNA聚合酶所修复聚合酶所修复C. 脱氨基脱氨基如果未被修复，产生的如果未被修复，产生的U会在接下来的复制中与会在接下来的复制中与A配对，产生配对，产生点突变点突变。D. 脱嘌呤脱嘌呤在嘌呤碱基和脱氧核糖之间的在嘌呤碱基和脱氧核糖之间的N-糖苷键

17、断裂糖苷键断裂X氧化碱基氧化碱基F. 活性氧导致碱基的氧化损伤活性氧导致碱基的氧化损伤在所有需氧细胞中由于超氧化物、氢过氧化物及羟基自由基等活性氧的存在，会在正常条件下发生氧化损伤。8-氧化鸟嘌呤氧化鸟嘌呤2-氧化腺嘌呤氧化腺嘌呤5-羟甲基尿嘧啶羟甲基尿嘧啶(2) 物理诱变和化学诱变物理诱变和化学诱变A. 射线辐射射线辐射高能离子化辐射（如高能离子化辐射（如X射线，射线， 射线）射线），使目标分子，使目标分子失去电子，引起失去电子，引起DNA发生广泛的化学变异，包括发生广泛的化学变异，包括断链、碱基及五碳糖的损伤。断链、碱基及五碳糖的损伤。非离子化辐射非离子化辐射可引起新的化学键形成，如紫外线

18、引可引起新的化学键形成，如紫外线引起相邻嘧啶碱基产生嘧啶二聚体。起相邻嘧啶碱基产生嘧啶二聚体。三、三、DNA损伤与突变损伤与突变B. 碱基类似物碱基类似物碱基类似物是改变碱基配对碱基类似物是改变碱基配对特性的正常碱基衍生物，可特性的正常碱基衍生物，可诱发直接诱变。诱发直接诱变。在复制过程中结合可引起点在复制过程中结合可引起点突变。突变。举例：T的类似物5-溴尿嘧啶的酮式异构体与A配对，烯醇式与G配对。T/AC/G-转换C.亚硝酸的脱氨作用亚硝酸的脱氨作用通过氧化脱氨将氨基转变为通过氧化脱氨将氨基转变为酮基酮基。例如，例如，胞嘧啶脱氨变成尿嘧胞嘧啶脱氨变成尿嘧啶，从而和腺嘌呤配对，引啶，从而和腺

19、嘌呤配对，引起随后复制中发生起随后复制中发生C/G向向T/A的转换。的转换。D. 烷化剂：烷化剂：可将甲基加入到核酸上的各个位点，导致配对错可将甲基加入到核酸上的各个位点，导致配对错误或双螺旋变形。误或双螺旋变形。MMS（甲基磺酸甲酯）、（甲基磺酸甲酯）、EMS（甲基磺（甲基磺酸乙酯酸乙酯 ）、）、ENU (乙基亚硝基脲乙基亚硝基脲)7-甲基鸟嘌呤甲基鸟嘌呤3-甲基腺嘌呤甲基腺嘌呤MMSENUO6-甲基鸟嘌呤甲基鸟嘌呤E. 嵌入剂嵌入剂吖啶橙、吖啶黄、原黄素等吖啶类都是三环结构，大吖啶橙、吖啶黄、原黄素等吖啶类都是三环结构，大致类似于嘌呤嘧啶碱基对，可插入碱基对之间，使其致类似于嘌呤嘧啶碱基对

20、，可插入碱基对之间，使其中一条中一条DNA链形成一个链形成一个Loop，相邻碱基对分开约一个碱，相邻碱基对分开约一个碱基的距离，导致复制后的基的距离，导致复制后的DNA发生发生移码突变移码突变。(3) 转座元件的插入导致突变转座元件的插入导致突变转座元件是数百到数千个碱基对的转座元件是数百到数千个碱基对的DNA片段，它的转片段，它的转座使被插入的基因发生突变座使被插入的基因发生突变。三、三、DNA损伤与突变损伤与突变四、四、DNA损伤的修复损伤的修复1. 直接修复（直接修复（ 光复活光复活 、转甲基作用）、转甲基作用） 无差错修复无差错修复2. 取代修复取代修复切除修复切除修复错配修复错配修复

21、重组修复重组修复SOS修复修复无差错修复无差错修复有有差错差错倾向倾向修复修复1. 直接修复直接修复 A. 光复活光复活环丁烷嘧啶二聚体环丁烷嘧啶二聚体光复活酶光复活酶可见光可见光嘧啶单体嘧啶单体光复活对嘧啶二聚体是专一的，是损伤被光复活对嘧啶二聚体是专一的，是损伤被直接直接修复的一种例子，是无差错的。修复的一种例子，是无差错的。四、四、DNA损伤的修复损伤的修复B. 转甲基作用转甲基作用从突变的从突变的O6-甲甲基鸟嘌呤上去除的基鸟嘌呤上去除的甲甲基基被转移到被转移到甲甲基转移基转移酶上后，使酶本身失活。因此，每个酶上后，使酶本身失活。因此，每个甲甲基转移酶基转移酶只能用只能用一次。一次。这

22、种修复也是无差错直接修复。这种修复也是无差错直接修复。A. 切除修复切除修复损伤部位被切除，然后由损伤部位被切除，然后由DNA聚合酶合成新的聚合酶合成新的DNA填填补，并由补，并由DNA连接酶封口。连接酶封口。两种类型：核苷酸切除修复（两种类型：核苷酸切除修复（NER）和碱基切除修复）和碱基切除修复（BER）。）。2. 取代修复取代修复四、四、DNA损伤的修复损伤的修复无差错修复无差错修复1)2)3)4)核苷酸切除修复当当DNA链上相应位置的链上相应位置的核苷酸核苷酸发生损伤，导致双链间无法形成发生损伤，导致双链间无法形成氢键，则由核苷酸切除修复系统负责修复。氢键，则由核苷酸切除修复系统负责修

23、复。2) 碱基切除修复碱基切除修复a) AP内切核酸酶识别内切核酸酶识别AP位点，并引入切口。位点，并引入切口。b) 外切酶切除损伤外切酶切除损伤DNA。碱基专化的糖苷水解酶切除碱基专化的糖苷水解酶切除受损碱基，留下一个脱嘌呤或脱嘧啶（受损碱基，留下一个脱嘌呤或脱嘧啶（AP）位点。）位点。c) 由由DNA聚合酶和连接酶完成修复。聚合酶和连接酶完成修复。切除修复与转录相偶联，因而被转录切除修复与转录相偶联，因而被转录DNA的修复要快的修复要快于未被转录于未被转录DNA区域，区域，这有助于限制缺陷基因产物的生成这有助于限制缺陷基因产物的生成。四、四、DNA损伤的修复损伤的修复B. . 错配修复错配

24、修复错配修复是切除修复的一种特定形式，用于修复在复制中错配并漏错配修复是切除修复的一种特定形式，用于修复在复制中错配并漏过校正检验的任何碱基。过校正检验的任何碱基。复制中的错配碱基存在于子代链中，因此必须在复制叉通过后，有复制中的错配碱基存在于子代链中，因此必须在复制叉通过后，有一种能识别亲本链与子代链的方法，以保证只从子代链中去除一种能识别亲本链与子代链的方法，以保证只从子代链中去除错配碱基。错配碱基。无差错修复无差错修复四、四、DNA损伤的修复损伤的修复MutS识别并结合错配位点识别并结合错配位点MutL与与MutS结合结合MutS转移至转移至GATC位点位点MutL-MutS复合体与复合体与MutH结合并激活其内切酶结合并激活其内切酶活性活性MutH识别未甲基化的识别未甲基化的GATC位点并产生切口。位点并产生切口。MutSMutLMutHC. 重组修复重组修复又称为复制后修复，它发生在复制之后又称为复制后修复，它发生在复制之后。机体细胞对在复制起始时尚未修复的机体细胞对在复制起始时尚未修复的DNA损伤部位可以先复制损伤部位可以先复制再修复，即先跳过该损伤部位，在新合成链中留下一个对应于损伤序再修复，即先跳过该损伤部位，在新合成链中留下一个对应于损伤序列的缺口。列的缺口。容易出错容易出错四、四、DN