分子生物学：实验课

1、分子生物学实验分子生物学实验李国强李国强 作物基因组与生物信息研究中心作物基因组与生物信息研究中心2013-05-05实验内容实验内容v植物基因组植物基因组DNA的提取的提取v聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）v琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳实验一、植物基因组实验一、植物基因组DNA的提取的提取v实验目的：掌握实验目的：掌握SDS法提取植物基因组法提取植物基因组DNA的原理和方法的原理和方法v实验难点：保证实验难点：保证DNA的质、量的质、量 提取的量提取的量 DNA完整性完整性植物细胞结构示意图植物细胞结构示意图细胞壁细胞壁细胞膜细胞

2、膜细胞质细胞质细胞核细胞核实验原理实验原理v 采用采用物理或化学方法物理或化学方法破碎植物细胞壁；利用十六烷基破碎植物细胞壁；利用十六烷基三甲基溴化铵（三甲基溴化铵（CTAB）或十二烷基硫酸钠（）或十二烷基硫酸钠（SDS）等离子型表面活性剂溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋等离子型表面活性剂溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，白解聚，DNA游离出来；随后加入游离出来；随后加入酚或氯仿、异戊醇酚或氯仿、异戊醇等有机溶剂等有机溶剂使蛋白质变性。由于使蛋白质变性。由于DNA溶解于水，通过溶解于水，通过离心可以使提取液分相，去除细胞碎片和大部分蛋白离心可以使提取液分相，去除细胞碎片和大部分蛋白，随后在上清液

3、中加入，随后在上清液中加入乙醇或异丙醇乙醇或异丙醇将将DNA析出。析出。v Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止）提供一个缓冲环境，防止DNA被被破坏。破坏。v EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性。活性。v NaCl 提供一个高盐环境，降低提供一个高盐环境，降低DNA的溶解度。的溶解度。实验材料和试剂实验材料和试剂v实验材料：植物叶子实验材料：植物叶子v实验所需试剂：实验所需试剂： DNA提取液：提取液：0.1M Tris-Hcl (pH8.0)，0.05M EDTA (pH8.0) ，1.25% SDS， 0.5M NaCl，3.8g/L

4、 NaBisufite 氯仿、异戊醇氯仿、异戊醇、无水乙醇，无水乙醇，TE等等实验仪器实验仪器离心机离心机各种型号的微量移液枪各种型号的微量移液枪研钵研钵不同型号的不同型号的eppendorf管管实验方法实验方法1、取适量的植物、取适量的植物幼叶幼叶，加入液氮充分，加入液氮充分研磨研磨。将适量叶。将适量叶片粉末转入片粉末转入2ml离心管，离心管，加入加入适量适量DNA提取液；提取液；2、65C水水浴浴30-60min，每隔，每隔510分颠倒混匀一次；分颠倒混匀一次；3、静置、静置冷却后加入冷却后加入等体积等体积的的氯仿氯仿/异戊醇异戊醇 （24:1），置），置摇床上轻轻摇晃摇床上轻轻摇晃20分

5、钟。分钟。10000rpm离心离心 10min，吸取上，吸取上清清液至液至1.5ml离心管离心管；4、加加等体积等体积异丙醇或异丙醇或-20C预冷的无水乙醇沉淀；预冷的无水乙醇沉淀；5、用、用70%乙醇洗涤乙醇洗涤DNA沉淀沉淀2-3次次，置摇床上轻轻摇晃，置摇床上轻轻摇晃10-20分钟分钟;6、吹干吹干DNA ，用，用TE溶解。溶解。实验注意事项实验注意事项1. 叶片磨得越细越好，加入提取液的量一定要叶片磨得越细越好，加入提取液的量一定要合适合适，水，水浴时间浴时间合适合适；2. 提取过程中的机械力可能使大分子提取过程中的机械力可能使大分子DNA断裂成小片断裂成小片段，所以为保证段，所以为保

6、证DNA的完整性，各步操作均的完整性，各步操作均应应较温和较温和，避免剧烈震荡；避免剧烈震荡；3. 由于植物细胞中有大量的酶，对提取的由于植物细胞中有大量的酶，对提取的DNA不利。不利。除在提取液中加入除在提取液中加入EDTA抑制酶的活性外，加提取液时抑制酶的活性外，加提取液时应应迅速以免组织解冻迅速以免组织解冻，导致细胞裂解使，导致细胞裂解使DNA降解；降解；4. 微量移液器的使用一定要规范。吸取微量移液器的使用一定要规范。吸取氯仿等有机试剂氯仿等有机试剂或腐蚀性试剂或腐蚀性试剂时注意不要将试剂吸入枪中。时注意不要将试剂吸入枪中。实验二、聚合酶链式反应实验二、聚合酶链式反应-PCRv 实验目

7、的：学习和掌握实验目的：学习和掌握PCR的基本原理和相关实验技的基本原理和相关实验技术术v 实验原理：实验原理： PCR实际上是体内实际上是体内DNA复制在体外的模复制在体外的模拟。当双链拟。当双链DNA变性为单链变性为单链DNA后，后，DNA聚合酶聚合酶以以单链单链DNA为模板，以为模板，以特定引物特定引物为延伸起点，利用反应为延伸起点，利用反应液中的液中的dNTP通过通过变性、退火、延伸变性、退火、延伸等步骤合成新的等步骤合成新的DNA的互补链，在体外复制出与母链模板的互补链，在体外复制出与母链模板DNA互补互补的子链的子链DNA。它是一项。它是一项DNA体外合成体外合成放大技术放大技术，

8、能，能快速特异地在体外扩增任何目的快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究，转基因检测，司法鉴定等许多方面。，转基因检测，司法鉴定等许多方面。PCR三大步三大步v1.变性变性(denaturation)：通过加热使模板：通过加热使模板DNA双链之间的氢键断裂，形成单链的过程。双链之间的氢键断裂，形成单链的过程。v2.退火退火(annealling)：当温度降低时，引物与模：当温度降低时，引物与模板板DNA中互补区域结合成杂交分子。中互补区域结合成杂交分子。 v3.延伸延伸(exte

9、nsion)：在引物、：在引物、dNTPs、 Mg2+ 存在下，存在下，DNA聚合酶催化引物按聚合酶催化引物按53方向延方向延伸，合成出与模板伸，合成出与模板DNA链互补的链互补的DNA子链子链。实验试剂、设备实验试剂、设备v 实验试剂：实验试剂： Taq酶、酶、dNTP、10Taq酶酶Buffer、Mg2+、引物、引物、模板模板DNA、无菌去离子水、无菌矿物油、无菌去离子水、无菌矿物油v 实验设备：实验设备： PCR仪、微量移液器、微量离心管、微量吸头（仪、微量移液器、微量离心管、微量吸头（Tip头）等头）等实验方法实验方法v PCR反应体系反应体系(50ul) 模板模板DNA：5ul 10

10、Taq酶酶Buffer：5ul Mg2+： 4ul dNTP： 4ul Primer：左右引物各：左右引物各1ul Taq酶：酶：0.5 ul 去离子水去离子水：29.5 ulPCR反应程序反应程序1. 94 3min.2. 94 30sec.3. 55 40sec. 36Cycles4. 72 1min.5. 72 5min.6. 12 预变性预变性延伸延伸注意事项注意事项v 防止污染防止污染v PCR反应体系（各个成份的比例）反应体系（各个成份的比例） 模板浓度模板浓度 引物特异性引物特异性 扩增延伸时间扩增延伸时间 Taq酶（不同的酶对应的酶（不同的酶对应的PCR程序不同）程序不同）实验

11、三、琼脂糖凝胶电泳实验三、琼脂糖凝胶电泳v 实验目的：学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定实验目的：学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理的原理和方法。和方法。v 实验原理：琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲实验原理：琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但水性，但不带电荷不带电荷，是一种很好的电泳支持物。，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正在碱性条件下带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同极移动，不同DNA分子片段由于分子片段由于分子量和构型分子量和构型不同，不同，在电场中的泳动速率不同。溴化乙锭（在电场中的泳动速率不同。溴化乙锭（EB）可）可嵌

12、入嵌入DNA分子碱基对间分子碱基对间，经紫外线照射后可发出荧光。琼，经紫外线照射后可发出荧光。琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标片段的标准方法。准方法。实验试剂、设备实验试剂、设备v 电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、微波炉、微量移电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、微波炉、微量移液器液器v 琼脂糖，溴化乙锭等琼脂糖，溴化乙锭等 溴化乙锭的配制：称取溴化乙锭的配制：称取0.1g溴化乙锭，溶于溴化乙锭，溶于10ml水，配成终水，配成终浓度为浓度为10mg/ml的母液，的母液，4冰箱保存。染色时，吸取冰箱保存。染色时，吸取12.5 l 的母液，加入的母液，加

13、入250ml的水中，使其终浓度为的水中，使其终浓度为0.5g/ml，混合，混合均匀。均匀。v 加样缓冲液加样缓冲液 0.25%溴酚蓝，溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液）蔗糖水溶液v 电泳缓冲液电泳缓冲液 4mol/LTris-HCl（pH8.0），），2mol/L醋酸钠，醋酸钠，200mmol/L EDTA=Tris 242.2g，无水乙酸钠，无水乙酸钠 82.03g，EDTA-Na2 37.23g，用冰乙酸调，用冰乙酸调pH至至8.0（大约加入冰乙酸（大约加入冰乙酸50ml），然后定容），然后定容至至500ml。用时稀释。用时稀释100倍。倍。实验方法实验方法v 琼脂糖凝胶的制备：称取琼脂

14、糖溶解在电泳缓冲液中琼脂糖凝胶的制备：称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，置微波炉中加热至，置微波炉中加热至完全溶化完全溶化（不要加热至沸腾），（不要加热至沸腾），取出摇匀。取出摇匀。v 灌胶：将灌胶：将冷却冷却到到60的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。待琼脂糖胶凝固后，平板上。待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓在电泳槽内加入电泳缓冲液冲液，然后拔出梳子。，然后拔出梳子。v 加样：将加样：将DNA样品与加样缓冲液按样品与加样缓冲液按5：1混匀后，用微混匀后，用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加10-20l，记，记录样品的点样次序和加样量。录样品的点样次序和加样量。v 电泳：电压电泳：电压50-80V(3-5V/cm)，根据指示剂在凝胶中，根据指示剂在凝胶中的电泳位置，停止电泳。的电泳位置，停止电泳。实验方法实验方法v 染色和观察：取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液染色和观察：取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色中染色5-30min，即可在，即可在254nm的紫外灯下观察，有的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为橙红色荧光条带的位置，即为DNA条带，或在紫外灯条带，或在紫外灯下照相记录电泳图谱。下照相记录电泳图谱。v 凝胶浓度的确定凝胶浓度的确定： 200-20