天津大学生物化学课件第十二章45节1

1、第四节第四节 rnarna的生物合成的生物合成一、一、dnadna指导下的指导下的rnarna合成转录合成转录二、二、rnarna指导下的指导下的rnarna合成合成rnarna复制复制三、三、rnarna指导下的指导下的dnadna合成逆转录合成逆转录一、一、dnadna指导下的指导下的rnarna合成转录合成转录1 1转录：转录：在在dnadna指导下指导下rnarna的合成。此过程包括的合成。此过程包括rnarna链的起始、延伸、终止等步骤。链的起始、延伸、终止等步骤。 转录要涉及两方面：转录要涉及两方面：一是一是rnarna合成的酶学过程；合成的酶学过程；二是二是rnarna合成的起始

2、信号和终止信号。合成的起始信号和终止信号。模板链：模板链：转录的模板转录的模板dnadna链，也叫反义链或负链。链，也叫反义链或负链。编码链：编码链：与模板链对应的链，也叫有义链或正链。与模板链对应的链，也叫有义链或正链。转录的起始是由转录的起始是由dnadna的启动子（的启动子（promterpromter）区控制）区控制的，而控制终止的部位则称为终止子的，而控制终止的部位则称为终止子(ferminafor)(ferminafor)。一、一、dnadna指导下的指导下的rnarna合成转录合成转录2 2（一）大肠杆菌（一）大肠杆菌rnarna聚合酶聚合酶（二）（二）rnarna聚合酶催化的转

3、录过程聚合酶催化的转录过程 （三）（三）rnarna的转录后加工的转录后加工 （一）大肠杆菌（一）大肠杆菌rnarna聚合酶聚合酶1 1+核心酶（一）大肠杆菌（一）大肠杆菌rnarna聚合酶聚合酶1 1ppppp- p- p53pppppdnadna指导下的指导下的rnarna合成合成（二）（二）rnarna聚合酶催化的转录过程聚合酶催化的转录过程1 1rnarna聚合酶与模板聚合酶与模板dnadna结合结合 2 2起始起始 3 3延伸延伸 4 4终止终止1 1rnarna聚合酶与模板聚合酶与模板dnadna结合结合1 1rnarna聚合酶结合到模板聚合酶结合到模板dnadna的特定位置上的特

4、定位置上1 1rnarna聚合酶与模板聚合酶与模板dnadna结合结合2 2 这一特定部位有这一特定部位有rnarna聚合作用的起动聚合作用的起动基因，即启动子基因，即启动子ttgacaaactgttataatatatta3535（识别位）（识别位）1010（pribnowpribnow框）框）1 1起始部位起始部位dna53原核生物启动子结构原核生物启动子结构1 1rnarna聚合酶与模板聚合酶与模板dnadna结合结合3 3双链双链dnadna局部解开局部解开2 2起始起始1 1磷酸二酯键的形成磷酸二酯键的形成1 12 2起始起始2 2ppppp- p- p53ppppp磷酸二酯键的形成磷

5、酸二酯键的形成2 23 3延伸延伸1 1恢复的恢复的dnadna双螺旋双螺旋mrnamrna5延长阶段延长阶段1 1 在在dnadna的一条链上，通过碱基配对的一条链上，通过碱基配对合成合成rnarna链，解链区沿链，解链区沿dnadna移动移动3 3延伸延伸2 2延长阶段延长阶段2 2解链区到达基因终端解链区到达基因终端4 4终止终止1 1终止阶段终止阶段1 1rnarna和和rnarna聚合酶从聚合酶从dnadna上脱落上脱落4 4终止终止2 2终止阶段终止阶段2 2：原核生物转录中止信号及产物原核生物转录中止信号及产物agcccgctcgggcggcgggctcgcccgattttttt

6、taaaaaaaa反义链反义链有义链有义链dnaaaaaaaaattttttttuuuuuuucgggcggcccgca5反义链反义链有义链有义链dnarna产物产物5 5原核生物的转录过程原核生物的转录过程（三）（三）rnarna的转录后加工的转录后加工 在细胞内，由在细胞内，由rnarna聚合酶合成的原初聚合酶合成的原初转录物往往需要经过一系列的变化，包转录物往往需要经过一系列的变化，包括链的裂解、括链的裂解、55端与端与33端的切除和特端的切除和特殊结构的形成，碱基修饰和糖苷键的改殊结构的形成，碱基修饰和糖苷键的改变，以及拼接等过程。使其能转变为成变，以及拼接等过程。使其能转变为成熟的熟

7、的rnarna分子，此过程总称为分子，此过程总称为rnarna的成熟的成熟或转录后加工。或转录后加工。 （三）（三）rnarna的转录后加工的转录后加工1 1原核生物原核生物rnarna的转录后加工的转录后加工 2 2真核细胞真核细胞rnarna的转录后加工的转录后加工 1 1原核生物原核生物rnarna转录后加工转录后加工1 1（mrnamrna） 原核生物的原核生物的mrnamrna大多不需加工，一经转大多不需加工，一经转录即可直接进行翻译。录即可直接进行翻译。1 1原核生物原核生物rnarna转录后加工转录后加工2 2（rrna1rrna1） 大肠杆菌共有大肠杆菌共有7 7个个rrnar

8、rna的转录单位，它的转录单位，它们分散在基因组的各处。们分散在基因组的各处。 1 1原核细胞原核细胞rnarna转录后加工转录后加工2 2（rrna2rrna2）p16sp16sp23sp23sp5sp5s16s16s23s23s5s5s细菌细菌rrnarrna的形成的形成1 1原核生物原核生物rnarna转录后加工转录后加工3 3（trna1trna1） 大肠杆菌染色体基因组共有大肠杆菌染色体基因组共有trnatrna基基因约因约6060个，这个数字远大于按变偶假说个，这个数字远大于按变偶假说所要求的反密码子数。即：某些反密码所要求的反密码子数。即：某些反密码子可能不只一个子可能不只一个t

9、rnatrna分子，或某些分子，或某些trnatrna基因不是一个拷贝。基因不是一个拷贝。trnatrna基因大多成簇基因大多成簇存在。存在。trnatrna转录时首先成为转录时首先成为trnatrna前体。前体。 1 1原核生物原核生物rnarna转录后加工转录后加工3 3（trna2trna2）5ppp转录转录trnatrna前体前体trnatrnaoh35pppoh3oh3+核苷核苷酸降解产物酸降解产物降解至单降解至单核苷酸核苷酸p成熟的成熟的trnatrnaugm2gai6a等等修饰修饰trnatrna的形成的形成2 2真核生物真核生物rnarna转录后加工转录后加工1 1（rrna1

10、rrna1）rna聚合聚合酶的种类酶的种类功能功能所在所在i irrnarrna的前体的前体核仁核仁iiiimrnamrna的前体的前体核质核质iiiiii5srrna5srrna、trnatrna、及其他多种、及其他多种小分子核仁和核浆小分子核仁和核浆rnarna前体前体核质核质2 2真核生物真核生物rnarna转录后加工转录后加工2 2（rrna2rrna2）18s18s5.8s5.8s28s28s45s45s甲基化作用甲基化作用核酸内切酶核酸内切酶18s18srnarna5.8s5.8srnarna28s28srnarna真核生物真核生物rrnarrna前体的加工前体的加工2 2真核生物

11、真核生物rnarna转录后加工转录后加工3 3（rrna3rrna3）真核生物真核生物rrnarrna的生成与成熟的生成与成熟45s 45s 5s5s41s41s32s32s 5s 20s 5s 20s32s 32s 5s5s细胞核细胞核核仁核仁细胞质细胞质28s 28s 5.8s5.8s18s 18s 5s 5s 28s 28s 5.8s5.8s18s 18s 核蛋白体核蛋白体2 2真核生物真核生物rnarna转录后加工转录后加工4 4（trna1trna1）在酶的催化下，切掉部分核苷酸分子（包在酶的催化下，切掉部分核苷酸分子（包括括1414分子的分子的umpump、7 7分子分子cmpcm

12、p、8 8分子分子gmpgmp及少于及少于1 1分子的分子的ampamp）。）。trnatrna前体分子被修饰：其一是有些尿嘧啶前体分子被修饰：其一是有些尿嘧啶残基转变为拟尿嘧啶或二氢尿嘧啶残基；其二残基转变为拟尿嘧啶或二氢尿嘧啶残基；其二是甲基化作用。此变化是在甲基转移酶的催化是甲基化作用。此变化是在甲基转移酶的催化下，由下，由s-s-腺苷蛋氨酸供给甲基，在多核苷酸水腺苷蛋氨酸供给甲基，在多核苷酸水平上进行。平上进行。 从从trnatrna前体转变到前体转变到trnatrna的过程的过程2 2真核生物真核生物rnarna转录后加工转录后加工5 5（trna2trna2）trnatrna的生成

13、的生成细胞核细胞核核仁核仁细胞质细胞质trnatrna基因基因转录转录5切断切断trnatrna前体前体nch3拟尿苷生成拟尿苷生成trnatrna2 2真核生物真核生物rnarna转录后加工转录后加工6 6（mrna1mrna1）两者都为不均一分子两者都为不均一分子两者碱基组成上有部分相似两者碱基组成上有部分相似两者两者33末端都有多聚腺苷酸尾部；末端都有多聚腺苷酸尾部；55端端连接有连接有gmtpgmtp（7-7-甲基鸟苷）的帽子甲基鸟苷）的帽子（1 1）细胞核中的不均一核）细胞核中的不均一核rnarna（hnrnahnrna）可能是可能是mrnamrna的前体的前体, ,因为：因为：2

14、2真核生物真核生物rnarna转录后加工转录后加工7 7（mrna2mrna2）55端形成特殊的帽子结构（端形成特殊的帽子结构（m m7 7g g55pppppp55nmpnp-nmpnp-）在链的在链的33端切断并加上多聚腺端切断并加上多聚腺苷酸（苷酸（polyapolya）尾巴）尾巴通过拼接除去由内含子转录来通过拼接除去由内含子转录来的序列的序列链内部核苷被甲基化链内部核苷被甲基化（2 2）hnrnahnrna转变成转变成mrnamrna的加工过程：的加工过程：2 2真核生物真核生物rnarna转录后加工转录后加工8 8（mrna3mrna3）卵清蛋白基因产生卵清蛋白基因产生mrnamrn

15、a的过程：的过程：转录转录1 2 3 4 5 6 7 a b c d e f g 卵清蛋白基因卵清蛋白基因(7700(7700个核苷酸个核苷酸) )1 2 3 4 5 6 7 a b c d e f g ll5533加帽子和尾巴加帽子和尾巴1 2 3 4 5 6 7 a b c d e f g l5533内含子内含子rna的除去的除去 和拼接作用和拼接作用12345 6 7 lcapcappolyapolya尾尾成熟的成熟的mrnamrna18721872个核苷酸个核苷酸2 2真核生物真核生物rnarna转录后加工转录后加工9 9（mrna4mrna4）2 2真核生物真核生物rnarna转录后

16、加工转录后加工1010（帽子结构形成过程）（帽子结构形成过程）gtppipppn1n2n3g5 ppp5 n1n2n3 pppn1n2n3 rnarna三磷酸酶三磷酸酶piimrnamrna鸟苷酸鸟苷酸转移酶转移酶s-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸m7g5 ppp5 n1n2n3 s-腺苷高半胱氨酸腺苷高半胱氨酸mrna(mrna(鸟嘌呤鸟嘌呤-7-)-7-)甲基转移酶甲基转移酶mrna(mrna(核苷核苷-2-)-2-)甲基转移酶甲基转移酶s-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸s-腺苷高半胱氨酸腺苷高半胱氨酸m7g5 ppp5 n1 mn2n3 s-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸s-腺苷高半胱氨酸腺苷高半胱氨酸m

17、7g5 ppp5 n1 mn2mn3 mrna(mrna(核苷核苷-2-)-2-)甲基转移酶甲基转移酶二、二、rnarna指导下的指导下的rnarna合成合成rnarna复制复制病毒正链（具病毒正链（具mrnamrna功能）功能）pppg5 3 oh5 5 pp3 oh复制中间体复制中间体5 3 3 新合成的负链新合成的负链病毒正链为模板病毒正链为模板复制酶复制酶5 三、依靠反转录的三、依靠反转录的dnadna生物合成生物合成1 1 19701970年年temintemin和和baltimorebaltimore同时分别从致癌同时分别从致癌rnarna病毒中发现病毒中发现rnarna指导的指导

18、的dnadna聚合酶。由于它催化聚合酶。由于它催化遗传信息从遗传信息从rnarna流向流向dnadna，与转录作用正好相反，与转录作用正好相反，故称为反转录酶或逆转录酶。，故称为反转录酶或逆转录酶。病毒感染细胞后，通过逆转录酶生成与病毒病毒感染细胞后，通过逆转录酶生成与病毒rnarna碱基序列互补的碱基序列互补的dnadna，并整合到宿主细胞的，并整合到宿主细胞的染色体染色体dnadna中。此后，在宿主细胞内，这段插中。此后，在宿主细胞内，这段插入的入的dnadna经转录生成相应的经转录生成相应的mrnamrna，再转译成病，再转译成病毒专一的蛋白质。毒专一的蛋白质。 三、依靠反转录的三、依靠

19、反转录的dnadna生物合成生物合成2 2 rna3 5 依赖于依赖于rna的的dna聚合酶聚合酶rna3 5 核糖核酸酶核糖核酸酶h53 53 cdna依赖依赖dna的的dna聚合酶聚合酶cdna杂种分子杂种分子35 53 双链双链dna新合成的双链新合成的双链dna整合到整合到寄主染色体寄主染色体dna中中第五节第五节 基因的重组与基因的重组与dna“dna“克隆克隆”dnadna重组技术是指将不同的重组技术是指将不同的dnadna片段按人们的片段按人们的设计方案定向地连接起来，并在特定的受体细设计方案定向地连接起来，并在特定的受体细胞中，与载体一起得到复制与表达，使受体细胞中，与载体一起

20、得到复制与表达，使受体细胞获得新的遗传特性。胞获得新的遗传特性。从某种意义上来说，从某种意义上来说，dnadna重组技术也可理解重组技术也可理解为基因工程，也是使生物基因结构得到改造的为基因工程，也是使生物基因结构得到改造的技术。技术。 第五节第五节 基因的重组与基因的重组与dna“dna“克克隆隆”2 2一、一、dnadna重组技术的用途重组技术的用途 二、重组中所用的酶和载体二、重组中所用的酶和载体三、重组的大致步骤三、重组的大致步骤一、一、dnadna重组技术的用途重组技术的用途1 1利用利用dnadna重组技术大量生产一些在正常组重组技术大量生产一些在正常组织代谢中产量很低的多肽物质，

21、如多肽激素、织代谢中产量很低的多肽物质，如多肽激素、多肽抗生素、酶类、抗体及各种肽类。多肽抗生素、酶类、抗体及各种肽类。2 2定向地改造生物基因组结构，使其具有定向地改造生物基因组结构，使其具有的某些有经济价值的功能得以成百倍地提高。的某些有经济价值的功能得以成百倍地提高。3 3将将dnadna重组技术应用于基础研究。如在基重组技术应用于基础研究。如在基因组结构及基因组功能调节的研究。因组结构及基因组功能调节的研究。二、重组中的酶及载体二、重组中的酶及载体（一）（一）dnadna体外重组中常用的酶体外重组中常用的酶 （二）载体（二）载体（一）（一）dnadna体外重组中常用的酶体外重组中常用的

22、酶1 1 1 1限制性内切酶限制性内切酶2 2t t4 4dnadna连接酶连接酶3 3大肠杆菌大肠杆菌 dnadna聚合酶聚合酶i i4 4大肠杆菌大肠杆菌dnadna聚合酶大片段（聚合酶大片段（klenowklenow片段）片段）5 5t t4 4dnadna聚合酶聚合酶6 6t t4 4多核苷酸激酶多核苷酸激酶7 7反转录酶反转录酶8 8细菌碱性磷酯酶细菌碱性磷酯酶9 9核酸酶核酸酶s s1 11010脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶i i1111polyapolya聚合酶聚合酶（一）（一）dnadna体外重组中常用的酶体外重组中常用的酶2 2 由同一个限制性内切酶切断得到由同一个限制性内切

23、酶切断得到的任何两个的任何两个dnadna片段的粘性末端都片段的粘性末端都可以互相配对，然后每条可以互相配对，然后每条dnadna链的链的断开部分再通过断开部分再通过dnadna连接酶所产生连接酶所产生的磷酸二酯键连接起来。的磷酸二酯键连接起来。1.1.限制性内切酶限制性内切酶1 1（一）（一）dnadna体外重组中常用的酶体外重组中常用的酶2 2 1.1.限制性内切酶限制性内切酶2 2 酶酶（产生平头末端）（产生平头末端）限制和修饰部位限制和修饰部位来源来源 hindii5-g-t-py-pu-a-c-3 3-c-a-pu-py-t-g-5流感嗜血菌流感嗜血菌 hindi 5-g-t-t-a

24、-a-c-3 3-c-a-a-t-t-g-5副流感副流感嗜血菌嗜血菌*（一）（一）dnadna体外重组中常用的酶体外重组中常用的酶2 2 酶酶（产生粘性末端）（产生粘性末端）限制和修饰部位限制和修饰部位来源来源 ecori 5-g-a-a-t-t-c-3 3-c-t-t-a-a-g-5流感嗜血菌流感嗜血菌ecorii 5-n-c-c-n-g-g-n-3 3-n-g-g-n-c-c-n-5大肠杆菌大肠杆菌ecoriii 5-a-a-g-c-t-t-3 3-t-t-c-g-a-a-5流感嗜血菌流感嗜血菌*（一）（一）dnadna体外重组中常用的酶体外重组中常用的酶2 2 1.1.限制性内切酶限制性

25、内切酶3 3（一）（一）dnadna体外重组中常用的酶体外重组中常用的酶3 3 2 2t t4 4dnadna连接酶：连接酶：是从噬菌体是从噬菌体t t4 4 感染过的大肠感染过的大肠杆菌中分离出来的。此酶由一条肽链组成，分子杆菌中分离出来的。此酶由一条肽链组成，分子量量68006800，催化，催化dnadna上的上的3-oh3-oh与与5-p5-p末端之间的末端之间的磷酸二酯键的形成，既可催化粘性末端又可催化磷酸二酯键的形成，既可催化粘性末端又可催化平头末端间的连接。催化过程需平头末端间的连接。催化过程需atpatp和和mgmg2+2+3 3大肠杆菌大肠杆菌 dnadna聚合酶聚合酶i i：

26、5-35-3聚合酶活力聚合酶活力4 4大肠杆菌大肠杆菌dnadna聚合酶大片段（聚合酶大片段（klenowklenow片段）片段）：将大肠杆菌将大肠杆菌dnadna聚合酶用枯草杆菌素来降解，聚合酶用枯草杆菌素来降解，形成的产物中有一个分子量为形成的产物中有一个分子量为76,00076,000的多肽，即的多肽，即为此酶。它失去了为此酶。它失去了5-35-3外切酶活力，其它功外切酶活力，其它功能与能与dnadna聚合酶相同，此酶用途很广。聚合酶相同，此酶用途很广。（一）（一）dnadna体外重组中常用的酶体外重组中常用的酶4 4 5 5t t4 4dnadna聚合酶：聚合酶：它存在于噬菌体它存在于

27、噬菌体t t4 4中，与中，与klenowklenow片段相似，片段相似，5-35-3聚合酶活力比大肠杆聚合酶活力比大肠杆菌菌dnadna酶多酶多200200倍。倍。6 6t t4 4多核苷酸激酶：多核苷酸激酶：此酶是从此酶是从t t4 4感染过的大感染过的大肠杆菌中分离出来的，它催化肠杆菌中分离出来的，它催化atpatp上的上的-p-p转移转移到到dnadna或或rnarna的的5-oh5-oh上，所以可用来标记上，所以可用来标记dnadna或或rnarna。7 7反转录酶：反转录酶：合成合成cdnacdna的第一条链，具有的第一条链，具有5-3dna5-3dna聚合酶活力。聚合酶活力。（一

28、）（一）dnadna体外重组中常用的酶体外重组中常用的酶5 5 8 8细菌碱性磷酯酶：细菌碱性磷酯酶：十分耐热，可将十分耐热，可将dnadna或或rnarna的的5-p5-p除去，反应常在除去，反应常在60600 0c c以上进行，以以上进行，以抑制反应中其他内切酶。抑制反应中其他内切酶。9 9核酸酶核酸酶s s1 1：催化单链催化单链dnadna降解，产生降解，产生5-5-p p结尾的单核苷酸或寡核苷酸，用以切除双链结尾的单核苷酸或寡核苷酸，用以切除双链cdnacdna上的发夹形结构上的单链凸环。上的发夹形结构上的单链凸环。1010脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶i i：是一种内切酶，降是一种内

29、切酶，降解双链或单链解双链或单链dnadna，产生以，产生以5-p5-p结尾的单核结尾的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。苷酸及寡核苷酸的混合物。1111polyapolya聚合酶：聚合酶：催化将催化将ampamp加到加到rnarna的的3-oh3-oh末端，形成末端，形成3-polya3-polya的反应。的反应。（二）载体（二）载体（总）（总） 1 1定义定义2 2载体必须具备的条件载体必须具备的条件 3 3目前常用的载体目前常用的载体1 1定义定义 外源外源dnadna片段要进入受体细胞，并片段要进入受体细胞，并在其中进行复制与表达，必须有一个在其中进行复制与表达，必须有一个适当的运载工具将其

30、带入细胞内，并适当的运载工具将其带入细胞内，并载着外源载着外源dnadna一起进行复制与表达，这一起进行复制与表达，这种运载工具称为载体种运载工具称为载体 。2 2载体必须具备如下条件载体必须具备如下条件 （1 1）在受体细胞中，可以独立进行复）在受体细胞中，可以独立进行复制，所以其本身必须是一个复制单位，制，所以其本身必须是一个复制单位，而且插入外源而且插入外源dnadna后不会影响其本身的后不会影响其本身的复制能力。复制能力。（2 2）易于鉴定、筛选。即易将带有外）易于鉴定、筛选。即易将带有外源源dnadna的重组体与正常的载体区别开。的重组体与正常的载体区别开。（3 3）易于引入受体细胞

31、。）易于引入受体细胞。3 3目前常用的载体目前常用的载体1 1（总）（总） （1 1）质粒：是比较小的双链）质粒：是比较小的双链dnadna环形分环形分子，在细菌和酵母中都存在。子，在细菌和酵母中都存在。（2 2）噬菌体：包括）噬菌体：包括噬菌体、装配型噬菌体、装配型质粒（质粒（噬菌体改造）及噬菌体改造）及 m13m13噬菌体（噬菌体（是一种含有单链是一种含有单链dnadna的噬菌体）。的噬菌体）。3 3目前常用的载体目前常用的载体1 1（总）（总） 3 3目前常用的载体目前常用的载体2 2（噬菌体为载体）噬菌体为载体） dnadna用限制酶除用限制酶除去中间一段去中间一段太小不能太小不能被包

32、装被包装与外源与外源dnadna连接连接重组重组dnadna分子的体外包装分子的体外包装带有外源带有外源dnadna的的噬菌体噬菌体三、重组的步骤三、重组的步骤1 1（1 1）外源）外源dnadna与载体的连接，形成重组与载体的连接，形成重组dnadna（2 2）通过转化（或感染）将重组）通过转化（或感染）将重组dnadna引入引入受体细胞受体细胞（3 3）筛选出含有重组体的阳性克隆）筛选出含有重组体的阳性克隆 三、重组的步骤三、重组的步骤1 1dna与载体相连接与载体相连接简明简明p235p235图图12121313、12121414载体载体外源基因外源基因三、重组的步骤三、重组的步骤2 2

33、转化与筛选转化与筛选含有不同插入含有不同插入dnadna片断的质粒片断的质粒细菌细胞细菌细胞转化并置于有抗生素的介质转化并置于有抗生素的介质带有抗药性质粒带有抗药性质粒的细菌才生长的细菌才生长鉴定携有鉴定携有dnadna片断克隆的片断克隆的的菌落，并扩大培养的菌落，并扩大培养质粒质粒dnadna纯化纯化三、三、dnadna表达的一般步骤表达的一般步骤1 1 1 1目的基因的取得目的基因的取得2 2外源外源dnadna与载体的连接，形成与载体的连接，形成 重组重组dnadna3 3将重组将重组dnadna引入受体细胞引入受体细胞4 4重组体的筛选重组体的筛选5 5表达表达 三、三、dnadna表

34、达的一般步骤表达的一般步骤2 2 待插入的待插入的外源外源dnadna质粒载体质粒载体连接连接重组体重组体dnadna经转化作用或病毒经转化作用或病毒感染引入宿主细胞感染引入宿主细胞宿主染宿主染色体色体筛选出具有重组体筛选出具有重组体dnadna的细胞的细胞克隆克隆dnadna重组体的构建和克隆重组体的构建和克隆1 1目的基因的取得目的基因的取得分离法、合成法分离法、合成法 （1 1）dnadna片段的直接提取片段的直接提取（2 2）用噬菌体或质粒从宿主细胞）用噬菌体或质粒从宿主细胞中将目的基因携出中将目的基因携出（3 3）使用相应的）使用相应的mrnamrna分离基因分离基因2 2外源外源d

35、nadna与载体连接形成重组与载体连接形成重组dna1dna1（1 1）粘性末端连接）粘性末端连接（2 2）平头末端连接）平头末端连接（3 3）在）在dnadna片断末端加上均聚寡核苷酸后片断末端加上均聚寡核苷酸后连接，在连接，在3-oh3-oh端由末端核苷酸转移酶添加端由末端核苷酸转移酶添加单核苷酸的反应单核苷酸的反应（4 4）用接头连接：适用于粘端与平端）用接头连接：适用于粘端与平端dnadna之间的连接之间的连接外源外源dnadna与载体的与载体的dnadna之间的连接方式：之间的连接方式：2 2外源外源dnadna与载体连接形成重组与载体连接形成重组dna2dna2（1 1）粘性末端连接）粘性末端连接tgcatgcaacgtgcate.colie.coli质粒质粒限制酶限制酶tgcaacgttgcaacgt限制酶限制酶acgtgcatgcat混合、退火混合、退火 dnadna连接酶连接连接酶连接重组体重组体dnadnatgcatgcatgcatgca2 2外源外源dnadna与载体连接形成重组与载