非水相反应2011

1、非水相酶反应非水相酶反应许建和 介质工程 长期以来,人们一直错误地认为酶只能在水溶液 中使用; 若与有机溶剂接触，就会变性失活。 由于大多数有机化合物在水中很难溶解，有些还 不稳定，因此化学合成大多使用有机溶剂作为反 应介质，从而忽略了对生物催化剂的开发和应用。 20世纪80年代初期兴起的非水相酶催化技术则彻底地突破了酶只能在单一水溶液介质中应用的局限。研究表明，酶可以在含有各种有机溶剂和微量水分的非水介质系统中发挥催化作用，并且所表现出的催化性能(如活力、选择性、稳定性)与在常规水溶液介质中的性能截然不同，从而极大地扩展了生物催化剂的应用范围。 正是通过非水相介质系统的多样性变化，也可以在很

2、大程度上调控酶的催化性能，达到“蛋白质工程”所欲达到的类似效果，因此才提出了“溶剂工程”、“介质工程”或“微环境工程”等概念。因此,“介质工程”被视为蛋白质工程的补充。典型的生物催化反应系统典型的生物催化反应系统生物催化反应生物催化反应产物底物生理条件 or非生理条件天然化合物 or非天然化合物天然化合物 or非天然化合物生物催化剂生物催化剂酶微生物 or动植物细胞修饰、改造、固定化外消旋底物单一手性产品许多天然或合成的有机化合物，其生物转化客观上要求在非水介质中进行！系统构成三要素：反应物、催化剂和反应介质当酶的催化性能不理想时当酶的催化性能不理想时, 如何改造？如何改造？构象工程构象工程(

3、Conformational Engineering)酶在溶液中的空间构象是柔性酶在溶液中的空间构象是柔性可变的：环境可变的：环境结构结构功能！功能！通过改变反应环境通过改变反应环境( (溶液性质溶液性质) )即有可能调节酶的空间构象即有可能调节酶的空间构象, , 优化强化酶的催化性能优化强化酶的催化性能。蛋白质工程蛋白质工程生物催化反应器生物催化反应器产物底物手性化合物构型不同底物外消旋 or潜手性化合物相同酶在不同有机溶剂体系反应所得产物的构型相反相同酶在不同有机溶剂体系反应所得产物的构型相反 产物产物orEEEEEEEEEEE生物催化剂生物催化剂有机溶剂不同构象工程构象工程(Confor

4、mational Engineering)Zaks A, Klibanov AM. Science, 224: 1249 (1984) Enzymatic catalysis in organic media at 100 oC溶剂溶剂1溶剂溶剂2溶剂溶剂3 Improve enzymes by using them in organic solvents-Nature (2001)非水相生物催化的优点非水相生物催化的优点 (1) 能提高非极性（水难溶）底物的溶解度能提高非极性（水难溶）底物的溶解度； (2) 使热力学平衡向有利于合成的方向偏移使热力学平衡向有利于合成的方向偏移； (3) 改变

5、酶对底物的专一性改变酶对底物的专一性, 包括位置和立体专一性包括位置和立体专一性； (4)能抑制依赖于水的某些不利反应(如酸酐和 卤化物的水解，酚/醌的聚合等)； (5) 由于酶不溶于有机溶剂而无须固定化， 或简单吸附于无孔表面(如玻璃珠)即可； (6) 可通过过滤或离心等简单方法回收酶，反复利用； (7) 从低沸点溶剂中可以较容易地分离产物； (8) 酶的稳定性提高； (9) 消除了微生物的污染； (10) 酶可能被直接应用于化工过程。Why？酶在有机溶剂中的不同使用方式(a) 水与水溶性溶剂的均相混合物 (b) 水-有机溶剂两相系统 (c) 悬浮于溶剂中的酶粉 (d) 悬浮于溶剂中的载体固

6、定化酶 (e) 酶增溶于由水、有机溶剂和表面活性剂组成的微乳状液 (f) 可溶于有机溶剂的共价 修饰酶How？典型的非水相生物催化介质系统水或缓冲溶液系统； 2. 水-有机溶剂单相系统3. 水-有机溶剂两相系统; 4. 乳状液或微乳液系统5. 微水有机溶剂单相系统; 6. 超临界流体系统7. 离子液体介质系统 8. 双水相系统; 9. 浊点系统; 10. 无溶剂反应系统 l 除纯水之外的各种反应介质及无溶剂系统l Non-aqueous media 100%有机溶剂1. 单一的水或缓冲溶液系统 由于酶的构象与其离子化状态密切相关，因此酶的体外实验研究通常在一定浓度的缓冲溶液体系中进行，这样可保

7、证酶在最佳pH附近发挥最大的活力。 缓冲溶液的种类很多，在酶催化中使用最多的可能是磷酸盐和Tris-HCl，因为大多数酶的最佳pH在中性范围内(pH59)，但也有例外的情况。 例如，我们发现假丝酵母脂肪酶在催化酮基布洛芬氯乙酯水解时，最大活力在pH4.0附近。更为有趣的是，酶的对映选择率(E值)在pH4.0以下迅速升高，在pH2.2 时为13.6，比pH7.0时(E=1.2)提高了一个数量级。 如果酶的最适pH在中性范围，且反应过程中不涉及pH的变化，那么也可以不用缓冲溶液，直接在水中进行酶催化。例如，Furstoss等首次报道了在普通水中用环氧水解酶成功地制备了(S)-2-吡啶环氧乙烷。2.

8、 水-有机溶剂单相系统 l 增加亲脂性底物溶解度的一个最简单办法是向反应混合物中加入与水互溶的有机溶剂，通常被称为有机助溶剂或共溶剂(Organic cosolvent)。l 常用的助溶剂有二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、二噁烷(dioxane)、丙酮和低碳醇(如t-BuOH)等。l 由于形成的是均相系统，因此通常不会发生传质阻碍。一般来讲，该系统中与水互溶有机溶剂的量可达总体积的10%20% (体积分数)，在一些特殊的情况下，甚至可高达90%以上。有些酶(如酯酶和蛋白酶)在水-有机溶剂均相系统中的反应选择性会增加。l 如果该系统中有机溶剂的比例高过某一阈值

9、，将夺去酶分子表面的结构水，使酶失活，也有少数稳定性很高的酶，如南极假丝酵母脂肪酶(CALB)，只要在水互溶有机溶剂中有极少量的水，就能保持它们的催化活性。l 此外，当酶催化反应在0以下进行时，与水互溶的有机溶剂还能降低反应系统的冰点温度，这是低温酶学研究的内容之一。 3. 水-有机溶剂两相系统 水-有机溶剂两相系统是指由水相和非极性有机溶剂相(烃、醚、酯等)组成的非均相反应系统; 两相的体积比可以在很宽的范围内变动。底物和产物则主要溶于有机相中; 酶溶解于水相中，这样可使酶与有机溶剂在空间上相分离，以保证酶处在有利的水环境中，而不直接与有机溶剂相接触。 在两相系统中，分配系数(热力学参数)和

10、质量传递系数(动力学参数)决定了酶反应的拟一级速率常数kcat (=Vmax/KM)。因此整个反应的速率主要由这两个因素(溶解度、搅拌速度等)所决定，而与酶的催化能力关系不大。值得注意的是增加搅拌可以增加质量传递以提高酶催化反应的速度，但不正确的搅拌会产生机械和化学张力而导致酶的失活。通过选择适当的有机溶剂以及适度的水相调节(如pH、盐浓度等)可以控制反应物在两相中的分配。如果在均相系统中存在严重的底物或产物抑制，那么使用两相系统可望在很大程度上缓解这一问题。 4. 乳状液与微乳液系统 n 在一些疏水性底物的生物转化反应中，还经常使用表面活性剂稳定的乳状液系统。n 例如，在脂肪酶催化拆分酮基布

11、洛芬酯的水解反应中，发现添加适量的非离子表面活性剂Tween-80，不但有助于难溶底物酯的分散，使酶反应的速度提高了13倍，而且酶反应的对映选择性也大幅度提高，最多可提高两个数量级。n 类似地，在环氧水解酶催化的反应中，也发现添加乳化剂Tween-80要比添加助溶剂DMSO效果要好，不仅改善了酶的活性和选择性，而且提高了酶的稳定性。逆胶束系统(Reverse Micelles)逆胶束系统是含有表面活性剂与少量水的有机溶剂系统。表面活性剂分子由疏水性尾部和亲水性头部两部分组成，在含水有机溶剂中，它们的疏水性基团与有机溶剂接触，而亲水性头部形成极性内核，从而组成许多个逆胶束，水分子聚集在逆胶束内核

12、中形成“微水池”，里面容纳了酶分子，这样酶被限制在含水的微环境中，而底物和产物可以自由进出胶束。逆胶束系统作为反应介质具有以下优点：组成的灵活性；热力学稳定性和光学透明性；逆胶束有非常高的比界面积；逆胶束的相特性随温度而变化。 5. 微水有机溶剂单相系统 均相的有机溶剂体系均相的有机溶剂体系是指用与水不互溶的有机溶剂取是指用与水不互溶的有机溶剂取代所有的溶剂水代所有的溶剂水(98%)，形成，形成固相酶分散在有机溶剂固相酶分散在有机溶剂中中的非均相反应体系。的非均相反应体系。 处于这种体系中的酶，其表面必须有残余的结构水，处于这种体系中的酶，其表面必须有残余的结构水，才能保证其催化活性。一般有机

13、溶剂中含有小于才能保证其催化活性。一般有机溶剂中含有小于2%的的微量水。微量水。 常用的与水不互溶的有机溶剂有常用的与水不互溶的有机溶剂有烃类、醚、芳香族化烃类、醚、芳香族化合物、卤代烃等，它们的疏水指数合物、卤代烃等，它们的疏水指数(logP)较大较大。 固相酶在有机溶剂中具有催化活性是酶的一项重要特固相酶在有机溶剂中具有催化活性是酶的一项重要特性，在过去二十多年的研究中，已证明这种体系是可性，在过去二十多年的研究中，已证明这种体系是可行、可靠和多用途的。行、可靠和多用途的。微水有机溶剂单相系统固相酶在固相酶在结构结构上仍是上仍是柔性柔性的，酶分子内部的柔性足以保证酶和底物结合的，酶分子内部

14、的柔性足以保证酶和底物结合时酶能产生微小的构象变化，形成酶和底物结合的中间复合体。时酶能产生微小的构象变化，形成酶和底物结合的中间复合体。酶分子的比表面积约为酶分子的比表面积约为(13)106 m2kg1，与活性炭相当；酶分子体，与活性炭相当；酶分子体积的积的1/32/3是空的，充满了溶剂；因此是空的，充满了溶剂；因此足够的搅拌足够的搅拌将保证底物能与酶将保证底物能与酶表面或内部的活性中心结合，并起催化反应。表面或内部的活性中心结合，并起催化反应。对许多酶的应用而言，显著减少反应混合物的对许多酶的应用而言，显著减少反应混合物的含水量含水量是有利的。由于酶是有利的。由于酶在低含水系统中通常不溶，

15、故得到的是非均相反应混合物。酶既可以以在低含水系统中通常不溶，故得到的是非均相反应混合物。酶既可以以游离酶粉游离酶粉(无论纯度如何无论纯度如何)的形式直接使用，也可先固定在固相载体上再的形式直接使用，也可先固定在固相载体上再使用。使用。但两者都必须使酶处于对催化最适合的离子化状态，因此必须在将酶制但两者都必须使酶处于对催化最适合的离子化状态，因此必须在将酶制备成粉末或固定化颗粒之前将溶液的备成粉末或固定化颗粒之前将溶液的pH调节调节到最佳值。到最佳值。一般而言，酶在微水有机溶剂体系中一般而言，酶在微水有机溶剂体系中稳定性较好稳定性较好，但催化活力要比水相但催化活力要比水相中低得多，中低得多，部

16、分原因是因为酶在有机相不溶，许多酶分子聚结成团，影部分原因是因为酶在有机相不溶，许多酶分子聚结成团，影响了颗粒内部酶分子的催化效率。因此，如何保持固态酶粉在有机相中响了颗粒内部酶分子的催化效率。因此，如何保持固态酶粉在有机相中的高度分散状态，成为激活有机相酶活力的一项重要课题。的高度分散状态，成为激活有机相酶活力的一项重要课题。 6. 超临界流体u 除了亲脂性有机溶剂外，超临界流体除了亲脂性有机溶剂外，超临界流体(supercritical fluids)，如二，如二氧化碳、氟里昂氧化碳、氟里昂(CF3H)，烷烃类，烷烃类(甲烷、乙烯、丙烷甲烷、乙烯、丙烷)或无机化合或无机化合物物(SF6，N

17、2O)等，都可以作为酶催化亲脂性底物的溶剂，酶在这等，都可以作为酶催化亲脂性底物的溶剂，酶在这些溶剂中就像在亲脂性有机溶剂中一样稳定。些溶剂中就像在亲脂性有机溶剂中一样稳定。u 超临界流体对多数酶都能适用，酶催化的酯化、转酯、醇解、水超临界流体对多数酶都能适用，酶催化的酯化、转酯、醇解、水解、羟化和脱氢等反应都可在此体系中进行，但研究得最多的是解、羟化和脱氢等反应都可在此体系中进行，但研究得最多的是水解酶的催化反应。这种溶剂体系最大的优点是无毒、低粘度、水解酶的催化反应。这种溶剂体系最大的优点是无毒、低粘度、产物易于分离。产物易于分离。u 超临界流体的粘度介于气体与液体之间，其扩散性比一般溶剂

18、高超临界流体的粘度介于气体与液体之间，其扩散性比一般溶剂高12个数量级。超临界气体在临界点附近的温度或压力有一点微个数量级。超临界气体在临界点附近的温度或压力有一点微小的变化都会导致底物和产物溶解度的极大变化，因而很容易调小的变化都会导致底物和产物溶解度的极大变化，因而很容易调控超临界流体中酶催化反应的特性，如反应速率和选择性。控超临界流体中酶催化反应的特性，如反应速率和选择性。u 该体系的缺点是需要有能耐受几十个兆帕的高压容器，并且减压该体系的缺点是需要有能耐受几十个兆帕的高压容器，并且减压时易于使酶失活。此外，有些超临界流体如二氧化碳可能会与酶时易于使酶失活。此外，有些超临界流体如二氧化碳

19、可能会与酶分子表面的活泼基团发生反应而引起酶活性的丧失。分子表面的活泼基团发生反应而引起酶活性的丧失。7. 离子液体(Ionic Liquids) 在最近的在最近的10年中，离子液体年中，离子液体(Ionic Liquids, ILs)作为一种新型的作为一种新型的反应介质，被用于各种类型的反应，并常常产生显著的效果，反应介质，被用于各种类型的反应，并常常产生显著的效果，从而引起人们的广泛注意。从而引起人们的广泛注意。 离子液体实质上是一些凝固点较低的盐离子液体实质上是一些凝固点较低的盐，例如，例如1-烷基烷基-3-甲基咪甲基咪唑唑与与PF6或或BF4形成的盐。离子液体作为一类形成的盐。离子液体

20、作为一类极性溶剂极性溶剂，能溶解，能溶解许多有机化合物。许多有机化合物。 与普通有机溶剂最大的区别在于：与普通有机溶剂最大的区别在于： 离子液体离子液体不会挥发不会挥发(没有蒸没有蒸气压气压)，对环境比较友好，用于工业生产也相对比较安全；，对环境比较友好，用于工业生产也相对比较安全； 它它们们与许多有机溶剂互不相溶与许多有机溶剂互不相溶，可以形成有机溶剂，可以形成有机溶剂-离子液体两相离子液体两相系统或者有机溶剂系统或者有机溶剂-水水-离子液体三相系统，从而为溶剂工程在离子液体三相系统，从而为溶剂工程在生物催化反应中的应用提供了新的可能。生物催化反应中的应用提供了新的可能。 一般而言，离子液体

21、通常有三种方式被应用于生物催化过程：一般而言，离子液体通常有三种方式被应用于生物催化过程：作为单一的溶剂；作为单一的溶剂；作为共溶剂添加于水相系统中；作为共溶剂添加于水相系统中；与水与水形成两相系统。形成两相系统。新型生物催化介质离子液体8. 浊点系统(cloud-point system) 当一种非离子表面活性剂的水相胶束溶液温度达到其浊点(cloud point)以上，或者在存在某些添加剂的情况下，会导致相分离，形成一个表面活性剂稀少相(水包油乳液)和一个表面活性剂富集相(油包水乳液)，后者又称凝聚相，其中包含许多大的水泡，可容纳细胞或溶解的酶分子。这样的系统被称为浊点系统(cloud-p

22、oint system)，它曾被用于分离技术中，即所谓浊点萃取(Cloud-point Extraction)。最近，上海交大王志龙等将浊点系统成功地应用于疏水化合物胆固醇的微生物转化中，收到显著的效果，再次说明了生物催化反应中介质工程的重要性。9. 无溶剂或少溶剂反应系统 液相(酶液)固态底物或者产物无溶剂或少溶剂固态反应物系统无溶剂或少溶剂固态反应物系统u在许多情况下，反应系统的最佳选择可能是根本不用溶剂(即solvent-free system)，或者只用很少量的溶剂(little solvent system)。u在至少有一种反应物为液体的情况下，反应物之间的质量传递可以通过流体相进行

23、。 u在无溶剂系统中适当提高反应的温度，可以促进反应物分子的扩散和混合，从而提高酶反应的速度。当反应物均为固体颗粒时，也不一定非要用溶剂使其溶解不可。u反应完全可以在含酶的液相中进行，尽管该液相有可能完全隐藏在反应物固体颗粒之间的缝隙中而看不见 。为了形成这一隐形液相，一般只需加入很少量(例如反应物重量的10%)的某种“溶剂”，而最好的溶剂可能就是水，因为水通常会使酶产生最高的催化活力 有机溶剂的选择原则有机溶剂的选择原则log P规则规则log P 是衡量物质疏水性强弱的一个特征参数, P=C正辛醇/C水溶剂的疏水性越强，其夺取酶分子必需水的能力越弱。关于热力学水活度关于热力学水活度 水活度

24、水活度(water activity)是指在特定的温度和压力条件下，反应体系中水的摩尔分数w与水活度系数w的乘积: w = w w 水活度系数w是溶剂疏水性的函数，溶剂疏水性越大， w越大。对给定的w来说，疏水性溶剂所需的水量比亲水性溶剂的少。 w是一个强度性质的物理量。为了理解水活度的概念,可将w比喻为温度，而将水含量比喻为热焓，两个反应体系可以有相同的温度, 或w，但两者的热焓或含水量可以不同。在平衡状态时，反应体系中各组分(酶、溶剂、底物和产物等)的w是相同的。Halling PJ, et al. Biochem Biophys Acta 1992, 1118: 218水活度缓冲体系pH

25、记忆现象 在水溶液中：pH决定酶的离子化状态，从而影响酶的构象，而酶的构象又关系到酶的活性和选择性； 在有机溶剂中酶不能电离，因此必须进行预处理：将酶先溶解在少量最适pH值的缓冲溶液中，然后沉淀或冻干。这样可以保持酶的最佳电离状态，被称为“ pH记忆记忆”。 从最适pH值水溶液中沉淀的酶在有机溶剂介质中也表现出较高的酶活性，有时可提高一个数量级。 非水相生物催化的历史早期发表的关于非水相酶催化的论文 Hill, A. C. (1898) J. Chem. Soc. 73, 634658 Kastle, J. C. and Loevenhart, A. S. (1900) Am. Chem. J

26、. 24, 491525 Sym, E. A. (1933) Biochem. Z. 258, 304324 Sym, E. A. (1936) Enzymologia 1, 156160近代非水相酶催化研究再次起飞的里程碑 Zaks, A. and Klibanov, A. M. (1984) Science 224, 12491251 Zaks, A. and Klibanov, A. M. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 31923196非水相生物催化的两篇典型论文摘要(请您猜一猜它们发表的年代)1. 肪酶催化作为一种工具可用于酯的生

27、产。研究了以下两个模肪酶催化作为一种工具可用于酯的生产。研究了以下两个模型反应：型反应：1-丁醇与丁醇与2-甲基戊酸的酯化；甲基戊酸的酯化；2-甲基甲基-1-戊醇与醋酸戊醇与醋酸乙烯酯的不可逆转酯化。上述反应用猪胰脂肪酶催化，在正乙烯酯的不可逆转酯化。上述反应用猪胰脂肪酶催化，在正己烷中进行。初始水含量不仅影响酯的得率，而且影响酯化己烷中进行。初始水含量不仅影响酯的得率，而且影响酯化反应的对映选择性，而对转酯化反应却只影响酯的生成。反应的对映选择性，而对转酯化反应却只影响酯的生成。2. 用悬浮于单相丙酮中的用悬浮于单相丙酮中的猪胰脂肪酶粗粉合成了丁酸丙酯。脂猪胰脂肪酶粗粉合成了丁酸丙酯。脂肪酶

28、制剂的含水量起着主要的作用，在低水平时反应速度随肪酶制剂的含水量起着主要的作用，在低水平时反应速度随之成比例增大。在含水量较高时，脂肪酶粉发生膨胀，活力之成比例增大。在含水量较高时，脂肪酶粉发生膨胀，活力随之进一步增大，但不再是简单的线性关系。平衡的位置取随之进一步增大，但不再是简单的线性关系。平衡的位置取决于水分的浓度，符合一般的平衡方程。干的脂肪酶制剂在决于水分的浓度，符合一般的平衡方程。干的脂肪酶制剂在空气中对热非常稳定。空气中对热非常稳定。Zarevucka, M. et al. (1997) Biotechnol. Lett.19, 745750Sym, E. A. (1933) B

29、iochem. Z. 258, 304324Why did biocatalysis in organicmedia not take off in the 1930s?Peter HallingDepartment of Pure and Applied Chemistry,University of Strathclyde, Glasgow, UK G1 1XW.Trends in Biotechnol.17: 343-344 (1999)80年代兴起该领域研究的条件在年代兴起该领域研究的条件在30年代还不具备年代还不具备 First, overthrowing of the dogma

30、(教条) that enzymes are active only in aqueous surroundings; Second, the availability of commercial enzymes, which paved the way for the organic chemist; Third, contributors who were capable of strongly influencing the community. AM Klibanovs view(TIBTECH 2000, 18: 85-86)第一，在第一，在30年代没有取得八十年代中期所获得的年代没有

31、取得八十年代中期所获得的科学进展，即普通的典型酶均能在有机介质中发科学进展，即普通的典型酶均能在有机介质中发挥其功能。脂肪酶之所以能如此，当时一定是被挥其功能。脂肪酶之所以能如此，当时一定是被看作仅仅是其异常反应环境看作仅仅是其异常反应环境(油油-水界面水界面)的延伸。的延伸。第二，在当时那个年代没有对映纯化合物的需求。 相反，在80年代中期不但取得关键的科学突破，而且认识到有不可抗拒的实际需求。因而象对其它生物技术一样，对非水相酶催化技术的兴趣也剧增。这才导致生物催化剂在有机介质中惊人的新特性和新应用的发现。技术的推动和市场的需求这两个关键的因素起了相互促进的作用，而且将来可能将继续下去。非

32、水相生物催化的应用概况 4. 酯合成反应酯合成反应4.1 酯化反应4.2 转酯反应 (1) 活化酯 (2) 肟酯 (3) 烯醇酯 (4) 酸酐4.3 酯化反应的应用(1) 顺反、立体异构体拆分(2) 潜手性二醇拆分(3) 伯醇消旋体的拆分(4) 仲醇消旋体拆分(5) 金属有机化合物的拆分(6) 多羟基化合物选择性酯化(7) 内酯合成 氧化还原反应氧化还原反应; 2. 多肽合成反应多肽合成反应; 3. 酰胺化反应酰胺化反应同一酶催化的正逆反应所得产物的立体构型是互补的!酶在有机溶剂中的活力为何不如水相中高？ 1. 扩散与可获得性因素扩散与可获得性因素 酶溶于水而不溶于几乎所有的有机溶剂，当酶粉加

33、到水中便形成溶液，而在有机溶剂中则通常形成悬浊液。单凭直觉判断，以下推论似乎是合理的：酶在非水溶剂中的活力可能会因酶颗粒对底物的扩散限制而降低。这一现象在非均相催化(包括固定化酶催化)中普遍存在，并导致酶的催化能力不能充分发挥，实验观测到的即催化活力的下降。 即使扩散限制根本不存在，也不难想象在冻干的酶粉或交联的晶体酶颗粒内部，一些酶的活性中心可能在空间上会被相邻的酶分子所屏蔽住，使得底物不能接近，造成那些被屏蔽的酶分子不能发挥催化作用，使测得的催化活力下降。 酶在有机溶剂中的活力为何不如水相中高？2. 结构的变化 造成酶在无水溶剂中活力下降的另一个可能原因是酶的构象发生了变化。在水有机溶剂混

34、合体系中的蛋白质变性是众所皆知的现象，因而预期在纯的有机溶剂中蛋白变性将变得更加严重似乎也有道理。 已经证实将冷冻干燥的枯草杆菌蛋白酶置于不同的无水溶剂(如：辛烷、乙腈、二氧六环)中，对其二级结构并无显著的影响，这主要反映在螺旋的含量上。 但是，在酶的冻干过程中，却导致了枯草杆菌蛋白酶和许多其它酶的显著变性。换言之，不是与有机溶剂的接触，而是先前的脱水过程，改变了酶的结构，从而降低了催化的活力。使用冷冻保护剂可以防止(至少可以减少)这一有害的影响。 酶在有机溶剂中的活力为何不如水相中高？3. 底物去溶剂化和过渡态稳定化 酶与底物分子之间的结合能是酶催化的主要驱动力。底物为了与酶结合，在其从反应

35、介质向酶活性中心转移的过程中必须首先进行去溶剂化(desolvation)。这一去溶剂化过程在能量上越是有利，则导致催化发生的净结合能就会变得越大。 运用热力学方法，对枯草杆菌蛋白酶交联晶体在有机溶剂中催化N-Ac-L-Phe-OEt 转化时的去溶剂化能进行了计算，结果表明，与水相比较，仅底物在无水乙腈中的去溶剂化能减少一项，就可使酶的kcat/Km下降100倍以上。 影响酶反应活化能的另一项重要因素是酶-底物过渡态的能量。对枯草杆菌蛋白酶和许多其它水解酶来说，其过渡态具有高度的极性，有点像一个带电荷的四面体。由于水对高度极性的酶-底物过渡态中间体的稳定化作用要好于极性较低的有机溶剂，因此，酶

36、在有机溶剂中的催化活力应当比水相低。 酶在有机溶剂中的活力为何不如水相中高？4. 构象可塑性构象可塑性 蛋白质与水的相互作用(水合作用)，对很多生物学功能尤其是酶的活性，起着十分关键的作用。水作为一种润滑剂或者增塑剂，使酶得以展现其最佳催化所需的构象灵活性。 而有机溶剂一般不具备这样的能力，因为他们不能象水一样与酶发生多重氢键缔合，使得酶分子内部的氢键加强；加之有机溶剂的介电常数比水低，导致酶分子内部的离子作用增强。两方面共同作用的结果，使得酶在有机溶剂中的结构刚性显著增加。 因此，即使在其他条件完全相同的条件下，酶在有机溶剂中由于灵活性变差而造成活性比水中低。枯草杆菌蛋白酶交联晶体在无水乙腈

37、中单单由于构象的柔性下降，就造成了酶的活力比水相中下降了几乎2个数量级。酶在有机溶剂中的活力为何不如水相中高？5. pH状况状况 酶在水溶液中的活力显著依赖于pH，并有一个最佳值。而在有机溶剂中由于离子基团无法电离，使得pH失去其真正的意义。 可以通过其它方式来控制酶的离子基团的质子化状态。发现酶在有机溶剂中具有“pH记忆”能力，也就是说酶的催化行为与其最后一次(比如冷冻干燥前)所处的水溶液的pH有关。 因此，为使酶在有机溶剂中的催化性能达到最优，必须将酶冻干之前的水溶液的pH调到最佳值。当然，也可使用“有机相缓冲液”(有机相可溶的羧酸及其相关盐的混合物)来调节酶在有机溶剂中的pH状态。如何提

38、高有机相酶的催化活力？ 原原 因因述述 评评对对 策策扩散限制扩散限制不如多数人认为的那样严重不如多数人认为的那样严重剧烈搅拌酶悬液；使用较细的酶颗剧烈搅拌酶悬液；使用较细的酶颗粒。粒。活性中心堵塞活性中心堵塞致使酶的活力下降数倍致使酶的活力下降数倍如果可能的话，使用酶的晶体而不如果可能的话，使用酶的晶体而不是无定型颗粒。是无定型颗粒。构象发生变化构象发生变化发生于冻干或其它的脱水过程中，发生于冻干或其它的脱水过程中，与有机溶剂接触时一般不会发与有机溶剂接触时一般不会发生。用交联晶体酶可以避免。生。用交联晶体酶可以避免。使用冷冻保护剂；或制备可溶于有使用冷冻保护剂；或制备可溶于有机溶剂的酶机溶

39、剂的酶-表面活性剂复合物；表面活性剂复合物；或者使用酶的交联晶体。或者使用酶的交联晶体。不利的底物不利的底物去溶剂化能去溶剂化能对于疏水性底物或者天然的底物对于疏水性底物或者天然的底物情况比较严重；可使酶的活力情况比较严重；可使酶的活力下降下降100倍以上。倍以上。选择溶剂，造成不利的溶剂选择溶剂，造成不利的溶剂-底物底物相互作用相互作用过渡态过渡态去稳定化去稳定化当过渡态至少部分暴露于溶剂时，当过渡态至少部分暴露于溶剂时，可能比较显著可能比较显著选择溶剂，使得过渡态与溶剂的相选择溶剂，使得过渡态与溶剂的相互作用比较有利。互作用比较有利。构象的灵活性降构象的灵活性降低低在无水的亲水性溶剂中情况

40、比较在无水的亲水性溶剂中情况比较严重，可使酶的活力至少下降严重，可使酶的活力至少下降100倍。倍。优化水的活度；在溶剂中添加水；优化水的活度；在溶剂中添加水；使用疏水的溶剂；使用拟水溶使用疏水的溶剂；使用拟水溶剂，添加变性助溶剂等。剂，添加变性助溶剂等。酶的酶的pH处于次优处于次优状态状态可使酶的催化活力降低可使酶的催化活力降低100倍以上。倍以上。 从从pH最优的水溶液中脱水制备酶最优的水溶液中脱水制备酶制剂；使用有机缓冲液。制剂；使用有机缓冲液。非水相酶反应已经在工业上大规模应用！BASFBASF非水相酶反应器的构建与操作非水相酶反应器的构建与操作应用案例应用案例薄荷醇的酶促拆分(CSTR

41、)甘油的不对称酰化(PBR)红景天苷的酶促合成(分离藕合型反应器)酶促合成手性环氧化合物(两相酶反应器)(RCO)2OOH+ OCORdl-Menthold-Mentholl-Menthyl esterOH Lipase OF in org. solv._ Acyl donor 1st reaction 2nd reaction Stability(Mode of reaction) Conv. ee. Conv. e.e. 2nd/1st Free acid (batch) 39.4 99.3 13.8 n.d. 35%Anhydride (fed-batch) 45.3 98.7 39.9

42、 98.7 88% _ Xu JH et al. (1995) Appl. Microbiol. Biotechnol. 43:402-4071. dl-薄荷醇的非水相酶促拆分 Continuous stirred tank reactor (CSTR) used for lipase-catalyzed enantioselective esterification of dl-menthol in organic solvent.非水相酶反应器非水相酶反应器(CSTR)(CSTR)0204060801000102030405060Operation time (day)Yield & ee

43、 of l-ester (%)048121620Water in solvent (mM)Yielde.e.WaterXu JH et al.(1995) Appl. Microbiol. Biotechnol. 43：639-643CSTR中dl-薄荷醇的连续拆分 2. 手性单甘酯的不对称合成手性单甘酯的不对称合成OHHOOH+ OOOLipaseDioxaneOO*OHOHXu JH et al. (2001) Biotechnol. Bioeng., 73: 493-49902040608010012004896144Operation time (h)Conc. (mM) & ee(%

44、)020406080100120Temp. (oC) &flow rate (ml/h)固定床反应器中单甘酯的连续合成固定床反应器中单甘酯的连续合成 MBG concn.; E.e. of MBG; Temp. 020406080024487296120 144 Operation time (h)MBG (mM)020406080E. e. (%)固定床反应器中固定床反应器中单甘酯的半连续合成单甘酯的半连续合成Xu JH et al. (2001) Biotechnol. Bioeng., 73: 493-499反应反应分离偶联的分离偶联的绿色合成方法绿色合成方法Bioorg Med Che

45、m Lett 2004J. Mol. Catal.-B 2005 & 2007反反应应发明专利发明专利CN1560268A; CN1844405A 分离分离Tyrosol回用回用苹果籽粉苹果籽粉t-BuOH/H2O(90:10, v/v)3. 非水相酶促合成烷基糖苷非水相酶促合成烷基糖苷固定化酶催化剂(19 mg产物d-1g-1)天然酶催化剂(13 mg产物d-1g-1)化学化学修饰修饰t1/2: 2951 d高效催化剂高效催化剂废弃水果籽废弃水果籽酶反应器酶反应器产物吸附产物吸附产物精制产物精制红景天苷红景天苷社会意义社会意义l变废为宝变废为宝, 提高农副产品的附加值提高农副产品的附加值l节

46、约耕地节约耕地, 保护西部脆弱生态环境保护西部脆弱生态环境l提高纯度提高纯度, 有利于我国中药现代化有利于我国中药现代化目前目前, 红景天苷的售价高达红景天苷的售价高达20万元万元/千克千克 (上海药谷药业有限公司上海药谷药业有限公司)，而我们所开发的生物催化新工艺而我们所开发的生物催化新工艺, 不但环境友好不但环境友好, 且且成本不足成本不足2%。高原人参高原人参东方神草东方神草红景天苷红景天苷酶促合成替代种植提取酶促合成替代种植提取(RS)-环氧 (S)-环氧 + (R)-二醇(RS)-环氧环氧细胞细胞有机相有机相水相水相4. 两相酶反应器系统两相酶反应器系统 -与单相系统相对照与单相系统相对照Xu JH. Enzyme Microb. Technol. 36 (2005) 252(S)-环氧环氧异辛烷异辛烷-水水 两相系统两相系统l防止自发水解防止自发水解, 提高底物浓度提高底物浓度.l提高对映选择率提高对映选择率 E: 4094 l强化时空生产率强化时空生产率 1949 mg.h-1.g-1迄今已经被迄今已经被他人引用他人引用1