23工具酶和基因载体

1、第三节第三节 工具酶和基因载体工具酶和基因载体2.3.12.3.1基因工程的工具酶基因工程的工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 dnadna连接酶连接酶 dnadna聚合酶聚合酶 碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 s1s1核酸酶核酸酶 逆转录酶逆转录酶能在特定部位限制性地切割能在特定部位限制性地切割dnadna分子。分子。smai cccggg gggccc ccc ggg ggg ccc在识别的序列中如果存在甲基化碱基，不能切割在识别的序列中如果存在甲基化碱基，不能切割2.3.1.1 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶粘性末端粘性末端粘性末端与平末端粘性末端与平末端限制性内切酶进行酶切时，两条多

2、聚核苷限制性内切酶进行酶切时，两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置如果是交错酸链上磷酸二酯键断开的位置如果是交错的，产生的的，产生的dna片段末端的一条链多出一片段末端的一条链多出一到多个核苷酸，这样的末端称为粘性末端。到多个核苷酸，这样的末端称为粘性末端。两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置如果是平齐的，这样的末端称为平位置如果是平齐的，这样的末端称为平末端。末端。平末端平末端1 1 限制性内切酶的分类限制性内切酶的分类 i ii iiii ii iiil 作用底物作用底物 双链双链dna dna 双链双链dna dna 双链双链dna dna l 识别

3、序列识别序列 特异特异 特异特异 特异特异l 切割位点切割位点 距识别部距识别部 在识别部位内部在识别部位内部 距识别部位距识别部位 位位1000bp 251000bp 2527bp27bpl 功功 能能 切割、修饰切割、修饰 切割切割 切割、修饰切割、修饰l 能能 量量 需要需要 不需要不需要 需要需要l 举举 例例 ecoecob b eco ecok k ecoecori ri ecoecopipi2 ii2 ii型限制性内切酶的命名原则型限制性内切酶的命名原则（1 1）限制性内切酶的基本名由限制性内切酶的基本名由3 3个字母组成。个字母组成。 第一个是该酶所属微生物属名的第一个字母，大

4、第一个是该酶所属微生物属名的第一个字母，大写、斜体。写、斜体。 第二个和第三个字母是该酶所属微生物种名的第第二个和第三个字母是该酶所属微生物种名的第一和第二个字母，小写。一和第二个字母，小写。 例如：大肠杆菌例如：大肠杆菌escherichia coli ecoescherichia coli eco 流感嗜血菌流感嗜血菌haemophilus influenzae hinhaemophilus influenzae hin （2 2）如同一种菌有不同的菌株或不同的品系，把菌株）如同一种菌有不同的菌株或不同的品系，把菌株 或品系的名称写在基本名的后面。或品系的名称写在基本名的后面。 如从大肠杆

5、菌如从大肠杆菌r r品系中分离到的酶，记做品系中分离到的酶，记做ecoecor r（3 3）同一种菌有几种不同的酶时，用罗马数字表示。）同一种菌有几种不同的酶时，用罗马数字表示。如在大肠杆菌中如在大肠杆菌中r r品系中分离到了品系中分离到了5 5种酶，分别叫种酶，分别叫 ecoecoriri、ecoecoriiriiecoecorvrv（4 4）如同一属中不同种的种名前两个字母相同时，取）如同一属中不同种的种名前两个字母相同时，取 种名较靠前的字母表示种名较靠前的字母表示 haemophilus parainfluenzae har haemophilus parahaemlyticus hp

6、h识别双链dna分子中4 - 8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构5 g c t g a a t t c g a g 33 c g a c t t a a g c t c 5ecor i的识别序列ecor i的切割位点3 ii3 ii型限制性内切酶的识别位点和切割特性型限制性内切酶的识别位点和切割特性ecori等产生的等产生的5粘性末端粘性末端5 g-c-t-g-a-a-t-t-c-g-a-g 33 c-g-a-c-t-t-a-a-g-c-t-c 5ecori 37 5 g-c-t-g-oh p-a-a-t-t-c-g-a-g 33 c

7、-g-a-c-t-t-a-a-p oh-g-c-t-c 5 退火 4-7 5 g-c-t-g a-a-t-t-c-g-a-g 33 c-g-a-c-t-t-a-a g-c-t-c 5oh pohppsti等产生的等产生的3粘性末端粘性末端5 g-c-t-c-t-g-c-a-g-g-a-g 33 c-g-a-g-a-c-g-t-c-c-t-c 5psti 37 5 g-c-t-c-t-g-c-a-oh p-g-g-a-g 33 c-g-a-g-p oh-a-c-g-t-c-c-t-c 5 退火 4-7 5 g-c-t-c-t-g-c-a g-g-a-g 33 c-g-a-g a-c-g-t-c-

8、c-t-c 5ohpohp连接便利连接便利 粘性末端的意义粘性末端的意义i i）不同的）不同的dnadna双链：双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。只要粘性末端碱基互补就可以连接。iiii）同一个）同一个dnadna分子内连接：分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成通过两个相同的粘性末端可以连接成环环形分子形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。这比连接两个平齐末端容易的多。 补平成平齐末端补平成平齐末端凸出的凸出的33端端可以通过末端转移酶添加几个多可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如聚核苷酸的尾巴（如aaaaaa或或tttttt等）造成人工粘等）造成人工粘性末端。性末端。

9、55末端标记末端标记凸出的凸出的55末端末端可用可用dnadna多核苷酸激酶进行多核苷酸激酶进行3232p p标记。标记。粘性末端可以用粘性末端可以用dnadna聚合酶补平成平齐末端。聚合酶补平成平齐末端。pvuii等产生的平头末端等产生的平头末端5 g-c-t-c-a-g-c-t-g-g-a-g 33 c-g-a-g-t-c-g-a-c-c-t-c 5pvuii 37 5 g-c-t-c-a-g-oh p-c-t-g-g-a-g 33 c-g-a-g-t-c-p oh-g-a-c-c-t-c 5 识别位点的序列相同的限制性内切酶。识别位点的序列相同的限制性内切酶。 同裂酶（同裂酶（isosc

10、hizomers)hind 5-aagctt-3 3-ttcgaa-5 hsu i 5-aagctt-3 3-ttcgaa-5 识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如bamh ibamh i、bgl bgl 、bcl ibcl i、xho xho 等等 同尾酶同尾酶(isocaudamers）5-ggatcc-3 3-cctagg-5 bamh ibamh ibcl ibcl i5-tgatca-3 3-actagt-5 5-agatct-3 3-tctaga-5 bgl bgl 5-ugatcy-3 3-yctagu-5 xho xho u u代

11、表嘌呤；代表嘌呤；y y代表嘧啶。代表嘧啶。5-5-gatcgatc-3 -3 3-3-ctagctag-5 -5 sau 3asau 3a同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能一般不能再被原来的酶识别。再被原来的酶识别。？5-g 5-g 3-c3-cctagctag gatcgatct t-3 -3 a a-5-5 bamh ibamh ibgl bgl 5-g5-ggatcgatct t-3 -3 3-c3-cctagctaga a-5-5 bamh ibamh ibgl bgl sau 3asau 3a（1 1）在特异位点上切割）在特异位点上

12、切割dnadna，产生特异的限制性内，产生特异的限制性内切酶切割的切酶切割的dnadna片段；片段；5 ii5 ii型限制性内切酶的主要用途型限制性内切酶的主要用途（2 2）建立）建立dnadna分子的限制性内切酶物理图谱；分子的限制性内切酶物理图谱；（3 3）构建基因文库；）构建基因文库；（4 4）用限制性内切酶切出相同的粘性末端，以便）用限制性内切酶切出相同的粘性末端，以便重组重组dnadna。 如果用不同的限制性内切酶酶解同一个如果用不同的限制性内切酶酶解同一个dnadna分分子，然后用琼脂糖凝胶电泳的方法对酶解过的子，然后用琼脂糖凝胶电泳的方法对酶解过的dnadna片段的大小进行比较，

13、最后将这一片段的大小进行比较，最后将这一dnadna片段上的限片段上的限制性内切酶位点的顺序标出来，就可以制出酶切制性内切酶位点的顺序标出来，就可以制出酶切位点的物理图谱。位点的物理图谱。dnadna连接酶的基本性质连接酶的基本性质修复双链修复双链dnadna上缺口处的磷酸二酯键上缺口处的磷酸二酯键dnadna连接酶连接酶5 g-c-t-c-t-g-c-a g-g-a-g 33 c-g-a-g a-c-g-t-c-c-t-c 5oh pohp5 g-c-t-c-t-g-c-a-g-g-a-g 33 c-g-a-g-a-c-g-t-c-c-t-c 5nicknicknicknick2.3.1.2

14、 dna连接酶连接酶（1 1）必须是两条）必须是两条双链双链dnadna。（2 2）dna3dna3端有游离的端有游离的-oh-oh， 55端有一个磷酸基团（端有一个磷酸基团（p p）。）。（3 3）需要）需要能量能量动物或噬菌体中：动物或噬菌体中：atp atp 大肠杆菌中：大肠杆菌中： nadnad+ + 连接条件连接条件dnadna连接酶的基本性质连接酶的基本性质大肠杆菌大肠杆菌dnadna连接酶：只能催化双链连接酶：只能催化双链dnadna的互补的互补 黏性末端，以黏性末端，以nadnad+ +为能量为能量 t4t4噬菌体连接酶：黏性、平末端均可连接，以噬菌体连接酶：黏性、平末端均可连

15、接，以 atpatp为能量为能量dnadna连接酶的基本性质连接酶的基本性质连接多个平头双链连接多个平头双链dnadna分子：分子：5 g-c-t-c-a-g-c-t-g-g-a-g 33 c-g-a-g-t-c-g-a-c-c-t-c 55 g-c-t-c-a-g-oh p-c-t-g-g-a-g 33 c-g-a-g-t-c-p oh-g-a-c-c-t-c 5 t4-dnat4-dna连接酶连接酶连接酶连接缺口连接酶连接缺口dnadna的最佳反应温度是的最佳反应温度是3737。但。但在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的。稳定的。dnadn

16、a连接酶的基本性质连接酶的基本性质因此连接粘性末端的最佳温度介于酶作用的最佳因此连接粘性末端的最佳温度介于酶作用的最佳温度和末端结合速率最佳温度之间，一般认为温度和末端结合速率最佳温度之间，一般认为415415是比较合适的。是比较合适的。基因工程中常用的基因工程中常用的dnadna聚合酶聚合酶1.1.大肠杆菌大肠杆菌dnadna聚合酶聚合酶i i（全酶）（全酶）2.2.大肠杆菌大肠杆菌dnadna聚合酶聚合酶i i大片段大片段 （klenow fragmentklenow fragment）3. t4 3. t4 噬菌体噬菌体dnadna聚合酶聚合酶 4. t7 4. t7 噬菌体噬菌体dna

17、dna聚合酶及其改造的测序物聚合酶及其改造的测序物 5. 5. 耐热耐热dnadna聚合酶聚合酶(tap dna) (tap dna) 6. 6. 末端转移酶末端转移酶2.3.1.3 dna聚合酶聚合酶1. 1. 共同特点共同特点把把dntpsdntps连续地加到引物的连续地加到引物的3oh3oh端。端。2. 2. 主要区别主要区别t7 dnat7 dna聚合酶可以连续添加数千个聚合酶可以连续添加数千个dntpsdntps而不而不从模板上掉下来。从模板上掉下来。常用的常用的dnadna聚合酶的特点聚合酶的特点持续合成能力和外切酶活性不同。持续合成能力和外切酶活性不同。dna聚合酶聚合酶35外切

18、外切酶活性酶活性53外切外切酶活性酶活性聚合速率聚合速率 持续能力持续能力大肠杆菌dna聚合酶低低有有中中低低klenow fragment低低无无中中低低t4噬菌体dna聚合酶高高无无中中低低taq dna聚合酶无无有有快快高高常用常用dnadna聚合酶的特性比较聚合酶的特性比较大肠杆菌大肠杆菌dnadna聚合酶聚合酶 i i（ dna pol i dna pol i ）5353的的dnadna聚合酶活性聚合酶活性5353的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性3535的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性大肠杆菌大肠杆菌dnadna聚合酶聚合酶 i i的基本性质：的基本性质：3 g-c-t-c-a-g-

19、c-t-g-g-a-g-a 53 g-c-t-c-a-g-c-t-g-g-a-g-a 55 c-g-a-g-t-5 c-g-a-g-t-ohoh5 ppp dntp mg5 ppp dntp mg2+2+3 g-c-t-c-a-g-c-t-g-g-a-g-a 53 g-c-t-c-a-g-c-t-g-g-a-g-a 55 5 c-g-a-g-t-c-g-a-g-t-c c- -g g- -a a- -c c- -c c- -ohohdna pol dna pol i idnadna聚合酶聚合酶i i的主要用途：的主要用途：用切口平移方法标记用切口平移方法标记dnadna（可作杂交探针）（可作杂

20、交探针）使用其使用其5353外切核酸酶活性降解寡核苷酸外切核酸酶活性降解寡核苷酸作为合成作为合成cdnacdna第二链的引物第二链的引物用于用于dnadna分子的分子的33突出尾进行末端标记，用于突出尾进行末端标记，用于dnadna序列分析。序列分析。大肠杆菌大肠杆菌dnadna聚合酶聚合酶 i i 大片段（大片段（ klenow klenow ）klenowklenow酶的基本性质：酶的基本性质：大肠杆菌大肠杆菌dnadna聚合酶聚合酶i i经枯草杆菌蛋白酶处理，获得经枯草杆菌蛋白酶处理，获得n n端端三分之二的大肽段，即为三分之二的大肽段，即为klenowklenow酶酶klenowkle

21、now酶仍拥有酶仍拥有5353的的dnadna聚合酶活性聚合酶活性和和3535的的核酸外切酶活性，核酸外切酶活性，但失去了但失去了5353的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性klenowklenow酶的基本用途：酶的基本用途：补平由限制性内切酶切割补平由限制性内切酶切割dnadna产生的产生的33凹端凹端用用p32 dntp补平补平3凹端凹端cdnacdna克隆中，用于合成克隆中，用于合成cdnacdna第二链第二链在体外诱变中，用于从单链模板合成双链在体外诱变中，用于从单链模板合成双链dnadna应用双脱氧链末端终止法进行应用双脱氧链末端终止法进行dnadna测序测序对带对带33突出端突出端dn

22、adna进行末端标记进行末端标记1.1.补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的33凹端凹端5 g-c-t-g-oh p-a-a-t-t-c-g-a-g 33 c-g-a-c-t-t-a-a-p oh-g-c-t-c 5 klenowklenowdatp dttpdatp dttp5 g-c-t-g-a-a-t-t-oh p-a-a-t-t-c-g-a-g 33 c-g-a-c-t-t-a-a-p oh-t-t-a-a-g-c-t-c 5 2.dna2.dna片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记5 g-c-t-g-oh p-a-a-t-t-c-g-a-g 33 c-g-a-c-t-t-

23、a-a-p oh-g-c-t-c 5 klenowa-32p-pppda tp5 g-c-t-g-a-a-t-t-oh p-a-a-t-t-c-g-a-g 33 c-g-a-c-t-t-a-a-p oh-t-t-a-a-g-c-t-c 5 基本性质：基本性质： 功能与功能与klenowklenow片段相似，都具有片段相似，都具有5353聚合酶聚合酶活性及活性及3535外切核酸酶外切核酸酶活性，但其活性，但其3535外切酶外切酶活性对单链活性对单链dnadna的作用比对双链的作用比对双链dnadna的作用的作用更强。更强。t4t4噬菌体噬菌体dnadna聚合酶聚合酶t4t4噬菌体噬菌体dnadn

24、a聚合酶的主要用途：聚合酶的主要用途： 对带对带33突出端突出端dnadna进行末端标记进行末端标记补平或标记限制性内切酶消化补平或标记限制性内切酶消化dnadna产生的产生的33凹端凹端标记用作探针的标记用作探针的dnadna片段片段将双链将双链dnadna的末端转化成为平端的末端转化成为平端使结合于单链使结合于单链dnadna模板上的诱变寡核苷酸引物得到模板上的诱变寡核苷酸引物得到延伸延伸t7t7噬菌体噬菌体dnadna聚合酶及其改造的测序酶聚合酶及其改造的测序酶基本特性：基本特性：3535外切核酸酶活性约为外切核酸酶活性约为klenowklenow片段的片段的10001000倍倍 无无5

25、353核酸外切酶活性核酸外切酶活性 用途：用途： 复制长段模板的引物延伸反应复制长段模板的引物延伸反应 快速末端标记快速末端标记taqdnataqdna聚合酶聚合酶基本特性：基本特性： 5353的的dnadna聚合酶活性聚合酶活性 5353的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性 耐高温耐高温78-9478-94度度用途：用途： pcr扩增扩增 dna序列测定序列测定 催化脱氧核苷酸添加到催化脱氧核苷酸添加到dnadna分子的分子的3-oh3-oh末端末端 上，催化作用不要求有模板，但需有上，催化作用不要求有模板，但需有co2+co2+的存在。的存在。 用途：用途：给载体或给载体或cdnacdna加上

26、互补的同聚尾加上互补的同聚尾 dnadna片段片段33末端的放射同位素标记末端的放射同位素标记末端转移酶末端转移酶逆转录酶的基本特性：逆转录酶的基本特性：1.1.以以rnarna为模板聚合为模板聚合cdnacdna链链3aaaaaaaaaaaaaa5mrna逆转录酶逆转录酶mgmg2+2+ dntp dntp5tttttttttttt oligo (dt) 12-183aaaaaaaaaaaaaa5mrna5tttttttttttttt3cdna2.3.1.4 依赖于依赖于rna的的dna聚合酶（逆转录酶）聚合酶（逆转录酶）逆转录酶的基本特性逆转录酶的基本特性: :2.2.双向外切双向外切dn

27、a-rnadna-rna杂合链中的杂合链中的rnarna链链逆转录酶逆转录酶3 rna5 dna353 rna5 dna35逆转录酶逆转录酶5 dna32.3.22.3.2基因工程载体基因工程载体 质粒（质粒（plasmidplasmid） 植物病毒载体植物病毒载体噬菌体载体噬菌体载体 黏性质粒载体或柯斯质粒（黏性质粒载体或柯斯质粒（cosmidcosmid） 表达载体表达载体 在基因工程操作中，把能携带外源在基因工程操作中，把能携带外源dnadna进入受体进入受体细胞，并在其中得以维持的细胞，并在其中得以维持的dnadna分子叫分子叫载体载体。1. 1. 载体载体 （vectorsvecto

28、rs）载体的功能及特征载体的功能及特征 （1 1）具有对受体细胞的可转移性，并在宿主细胞）具有对受体细胞的可转移性，并在宿主细胞 内能独立复制。内能独立复制。 （2 2）有选择性标记，便于重组）有选择性标记，便于重组dnadna分子的检测。分子的检测。（3 3）有一段多克隆位点。）有一段多克隆位点。2. 2. 基因工程对载体的要求基因工程对载体的要求外源外源dnadna插入其中不影响载体的复制。插入其中不影响载体的复制。（4 4）分子量小，拷贝数多。）分子量小，拷贝数多。 （5 5）容易从宿主细胞中分离纯化。）容易从宿主细胞中分离纯化。大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质粒2.3.2.1 2.3.2.1

29、 质粒载体质粒载体（1 1）分子小：）分子小： 1. 1. 质粒的一般生物学特性质粒的一般生物学特性1500 kb1500 kb（2 2）编码基因少：）编码基因少： 2323个中等大小的蛋白质。个中等大小的蛋白质。 （3 3）环形）环形dnadna分子：分子：双链环状双链环状dnadna。（酵母的（酵母的“杀伤质粒杀伤质粒”是是rna）。）。如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。外的特性（非必须）。（4 4）质粒的空间构型：）质粒的空间构型： 共价闭合环状共价闭合环状dnadna（cccdnacccdna) )呈超螺旋（呈超螺旋（s

30、csc）（）（s super uper c coiloil）covalent close circular dna 线形线形dna （ linear ，ldna）一条链上有一至数个缺口。一条链上有一至数个缺口。 开环开环dna（ open circular， ocdna）（1 1） 具有复制起点（具有复制起点（oriori）质粒载体必须具备的基本条件质粒载体必须具备的基本条件（2 2）应该有一个或多个选择标记基因）应该有一个或多个选择标记基因（3 3）应该有用来克隆外源）应该有用来克隆外源dnadna的单一的限制性内切的单一的限制性内切 酶识别位点酶识别位点是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗

31、菌素抗是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。性基因。用来插入外源用来插入外源dnadna片断。且插入后不影响复制功能。片断。且插入后不影响复制功能。（4 4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。）具有较小的分子量和较高的拷贝数。氨苄青霉素抗性（氨苄青霉素抗性（ampampr r） 卡那霉素抗性卡那霉素抗性 （kankanr r） 四环素抗性四环素抗性 （tettetr r） 链霉素抗性链霉素抗性 （strstrr r） 氯霉素抗性氯霉素抗性 （cmlcmlr r）2. 2. 质粒载体的选择标记质粒载体的选择标记（1 1）选择标记）选择标记绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：绝大多数质

32、粒载体都是用抗菌素抗性标记：10当带有当带有抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因的的载体载体进入受体菌后，受进入受体菌后，受体菌才能生长。体菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。菌素的培养基（选择培养基）中生长。（2 2）抗菌素选择原理）抗菌素选择原理活活死死抗性基因抗性基因抗菌素抗菌素3. 3. 质粒载体的种类质粒载体的种类（1 1）高拷贝数的质粒载体）高拷贝数的质粒载体cole1cole1、pmb1pmb1派生质粒具有高拷贝数的特点。派生质粒具有高拷贝数的特点。而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质而且在没有

33、菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数到每个细胞的拷贝数1000100030003000个！个！适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。因产物。（2 2）低拷贝数的质粒载体）低拷贝数的质粒载体 但有特殊用途但有特殊用途: :由由psc101psc101派生来的载体特点是分子量小，拷贝数派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低。低。当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死影响寄主菌的

34、正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。亡时，就需要低拷贝的载体。plg338、plg339、phsg415等等不适合大量扩增不适合大量扩增dnadna用。用。（3 3）失控的质粒载体）失控的质粒载体这是一类这是一类温度敏感型复制控制温度敏感型复制控制质粒。质粒。温度低（低于温度低（低于37 37 o oc c），拷贝数很少；），拷贝数很少； 温度增加（温度增加（40 40 o oc c）时，拷贝数会很快增加到）时，拷贝数会很快增加到10001000个以上。个以上。如如pbeu1、pbeu2。runaway plasmid vectors19791979年年b. e. uhlinb

35、. e. uhlin等构建。等构建。（4 4） 插入失活型质粒载体插入失活型质粒载体载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。内部。如如pdf41、pdf42、pbr329。抗菌素抗性抗菌素抗性外源外源dnadna无抗菌素抗性无抗菌素抗性（5 5）正选择的质粒载体）正选择的质粒载体如如pur2、ptr262等。等。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。培养基上生长。直接选择转化后的细胞。直接选择转化后的细胞。目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。

36、direct selection vectorspsp2124质粒的质粒的ampr基因基因a. pbr322a. pbr322：（1 1）元件来源）元件来源f. bolivar和和r.l. rodriguez人工构建载体。人工构建载体。 复制起点复制起点 oripmb1系列（来源于系列（来源于cole1）的）的高拷贝高拷贝型复制起点型复制起点 ampr基因基因 tetr基因基因psc101的的tetr 基因。基因。4.4.常见的质粒载体常见的质粒载体（2 2）长度）长度4363bp（3 3）选择标记）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。氨苄青霉素和四环素抗性。（4 4）克隆位点）克隆位点其中其中9

37、个会导致个会导致tetr基因失活（如基因失活（如bamh i、hind 、sal i）；）； 3个会导致个会导致ampr基因失活（基因失活（sca i、pvui、pst i）。）。24个克隆位点。个克隆位点。（5 5）pbr322pbr322的优点的优点 双抗菌素抗性选择标记双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择：插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞没有获得载体的寄主细胞 在在ampamp或或tettet中中都都死亡。死亡。获得载体的寄主细胞获得载体的寄主细胞 在在ampamp或或tettet其中之一其中之一中死亡。中死亡。外源基因外源基因bamh ibamh iampam

38、p中存活中存活但在但在tettet中死亡中死亡外源基因外源基因pst ipst itettet中存活中存活但在但在ampamp中死亡中死亡氯霉素扩增之后，每个细胞可达氯霉素扩增之后，每个细胞可达10001000 3000copy3000copy 安全安全失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因mobmob（mobilizationmobilization）。不）。不能通过接合转移。能通过接合转移。 高拷贝数高拷贝数 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大载体越小越好。载体越小越好。 10kb10kb的的dnadna在纯化过程中容易断裂。在纯化过程中容易断裂。b. b. 质粒载体质粒载体pucpuc系

39、列系列u university of niversity of c californiaalifornia的的j. messingj. messing和和j. j. vieriavieria于于19781978年，在年，在pbr322pbr322的基础上改造而成。的基础上改造而成。属正选择载体。属正选择载体。puc7puc7、puc8puc8、puc9puc9、puc10puc10、puc11puc11、puc18puc18、puc19puc19 复制起点复制起点pbr322pbr322的的 oriori但其上失去了克隆位点。但其上失去了克隆位点。 ampr ampr 基因基因（1 1）元件来

40、源）元件来源 laczlacz的启动子的启动子大肠杆菌大肠杆菌 laczlacz基因基因大肠杆菌大肠杆菌laczlacz的的a a- -肽链序列，肽链序列， 是是lacz lacz 的氨的氨基端片断。基端片断。pbr322pbr322的的ampampr r基因基因（2 2）长度）长度约约2.7kb2.7kb（3 3）克隆位点）克隆位点 1010个连续的单一限制酶切位点，个连续的单一限制酶切位点，位于位于laczlacz基因的基因的55端。端。ampicillin ampicillin 抗性抗性和和 laczlacz的的a a肽互补肽互补（蓝白斑）（蓝白斑）相结合。相结合。（4 4）选择标记）选

41、择标记蓝白斑选择原理：蓝白斑选择原理： xgal xgal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -d-galactoside） - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶能把无色的化合物能把无色的化合物xgalxgal分分解成半乳糖和一个解成半乳糖和一个深蓝色深蓝色的物质的物质5-5-溴溴-4-4-氯靛蓝。氯靛蓝。xgal半乳糖半乳糖5-5-溴溴-4-4-氯靛蓝氯靛蓝 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶xgalxgal显色反应：显色反应： laczlacz的的a a肽互补肽互补1 1）a a- -肽（肽（ laczlacz ）：）： - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶n n端的

42、一段氨基酸片断（端的一段氨基酸片断（11-4111-41氨基酸）。氨基酸）。lacz只有在只有在4 4聚体的状态下才有功能聚体的状态下才有功能. .c c端大部分端大部分n n端的端的11-41aa11-41aac c端大部分端大部分n n端的端的11-41aa11-41aac c端大部分端大部分n n端的端的11-41aa11-41aac c端大部分端大部分n n端的端的11-41aa11-41aa4 4聚体聚体2 2）受体菌）受体菌laczlacz突变（突变（laczlaczm15m15）受体菌基因组的受体菌基因组的 - -半乳糖苷酶基因的氨基端半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失有缺失（缺

43、失a a肽），不能形成肽），不能形成4 4聚体的活性聚体的活性酶，不能分解酶，不能分解xgal xgal 受体菌株：受体菌株：jmjm系列系列、tg1tg1、tg2tg2、xl1-bluexl1-blue、xs127xs127、xs101xs101、kk2186kk2186、mv1184mv1184、dh5adh5apucpuc质粒载体上的质粒载体上的laczlacz 编码编码a a肽与这个缺失肽与这个缺失突变的突变的 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶“互补互补”，使它能形成，使它能形成4 4聚聚体。又能分解体。又能分解xgalxgal。产生蓝色物质。产生蓝色物质。c c端大部分端大部分n n端的端

44、的11-41aa11-41aapuc puc laczlacz 受体菌受体菌laczlacz3 3）载体）载体laczlacz与与a a互补互补4 4）a a互补的插入失活互补的插入失活pucpuc载体上载体上laczlacz的的55端有一段多克隆位点端有一段多克隆位点(mcs)(mcs)区，本身虽不干扰区，本身虽不干扰laczlacz的合成，但的合成，但插入外源基因就会阻止插入外源基因就会阻止laczlacz的合成。不能的合成。不能互补。互补。 lacz lacz 55 33 a a肽移码突变肽移码突变laczlacz 55 33 a a肽肽不互补不互补互补互补mcsmcs外源外源dnadn

45、a iptgiptg的诱导作用的诱导作用iptgiptg是乳糖的类似物。能诱导是乳糖的类似物。能诱导laclac操纵子的启操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的动转录，使受体菌基因组中的lacz lacz 的的c c端部端部分分和载体的和载体的laczlacza a肽肽都表达。从而互补。都表达。从而互补。但载体但载体mcsmcs上插入外源上插入外源dnadna后，仍然不能产后，仍然不能产生生a a肽！肽！iptg通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有dnadna插入。插入。mcsmcs无插入时，互补，蓝菌斑。无插入时，互补，蓝菌斑。 mcsmcs

46、有插入时，不互补，白菌斑。有插入时，不互补，白菌斑。iptgiptg诱导的结果：诱导的结果：无质粒的无质粒的 受体菌受体菌 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶部部分缺失，不能分分缺失，不能分解解xgalxgal；无抗菌；无抗菌素抗性素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和xgalxgal的培的培养基上培养养基上培养无菌斑无菌斑生长生长质粒转化质粒转化的受体菌的受体菌 - -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的缺缺失被载体产物失被载体产物a a互互补，能分解补，能分解xgalxgal。且有抗菌且有抗菌素抗性素抗性在含抗菌素和在含抗菌素和xgalxgal的培养的培养基上培养基上培养有蓝色菌有蓝色菌斑生长斑生长带外源带外源dna

47、dna插插入的质粒转化入的质粒转化的受体菌的受体菌载体产物失活，载体产物失活，不能互补不能互补 - -半乳半乳糖苷酶糖苷酶的缺失。的缺失。不能分解不能分解xgalxgal，但有抗菌素抗性但有抗菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和xgalxgal的培的培养基上培养养基上培养有白色菌有白色菌斑生长斑生长（5 5）pucpuc系列载体的优点系列载体的优点 更小的分子量：更小的分子量：如如puc18puc18为为2682bp2682bp，puc8puc8为为2750bp2750bp。 选择方便选择方便xgalxgal显色、抗菌素双重直接选择。显色、抗菌素双重直接选择。 克隆便利克隆便利具有多克隆位点（具有

48、多克隆位点（mcsmcs），使有两个不同粘性），使有两个不同粘性末端的外源末端的外源dnadna方便地插入。方便地插入。 测序方便测序方便pucpuc的的mcsmcs与与m13m13噬菌体载体的噬菌体载体的mcsmcs完全相同，便完全相同，便于把外源于把外源dnadna转移到转移到m13m13载体上测序。载体上测序。c. c. 酵母质粒载体（酵母质粒载体（穿梭质粒载体）穿梭质粒载体）（1 1）穿梭质粒载体的结构）穿梭质粒载体的结构人工构建的、具有两种不同复制起点和选人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。活

49、和复制的质粒载体。（2 2）穿梭载体的优点）穿梭载体的优点 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。哺乳动物细胞等）进行基因表达。 可以自如地在两种不同寄主细胞之间来可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。回转移基因。克隆、构建克隆、构建表达表达e.colie.colianimal cellanimal cell 利用大肠杆菌进行基因克隆、表达利用大肠杆菌进行基因克隆、表达2.3.2.3 2.3.2.3 噬菌体载体噬菌体载体 噬菌体是一类细菌病毒（噬菌体是一类细菌病毒（bacteriophagebacteriophage）

50、。）。1. 1. 噬菌体的特点噬菌体的特点结构：结构： 蛋白质外壳内包裹着蛋白质外壳内包裹着dnadna（双链双链、单链、单链、线线性性、环状等）。、环状等）。single linear dna (about 182,000 bp)t2 genomic dna分为两种：分为两种：（1 1）溶菌周期：）溶菌周期：2. 2. 噬菌体的生活周期噬菌体的生活周期感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。细胞解体，释放出大量子代噬菌体。烈性噬菌体（烈性噬菌体（vi

51、rulent phage)virulent phage)感染细菌后，将自己的感染细菌后，将自己的dnadna整合到细菌的染色整合到细菌的染色体体dnadna中。形成这一过程称为溶源化中。形成这一过程称为溶源化（lysogenization)lysogenization)。整合到细菌染色体的噬菌体整合到细菌染色体的噬菌体dnadna称为称为原噬菌体原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。随细菌的染色体复制而复制。温和噬菌体（温和噬菌体（temperate phage)temperate phage)原噬菌体（原噬菌体（prophage)prophage)：（2 2）溶源周期：）溶源周期：（1 1）长

52、度为）长度为48502 bp48502 bp； （2 2）双链线性）双链线性dnadna； （3 3）在两端有）在两端有coscos位点，可以环化。位点，可以环化。 dnadna两端各有两端各有12bp12bp的粘性末端，粘性末端形成的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为的双链区域称为coscos位点。位点。(1) (1) dnadna分子的特点分子的特点 coscos位点（位点（cocohenhens sive-end siteive-end site）：）：3. 3. 噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建 dna进入细菌体内后，可形成双链环状进入细菌体内后，可形成双链环状dna复制型（复制型（

53、rfdna）。）。dnadna上有至少上有至少6161个基因，有一半是必须的，与自身个基因，有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列。的活动有关，成簇排列。 其他约其他约1/31/3是非必须基因是非必须基因（位于尾部合成至阻遏之（位于尾部合成至阻遏之间的区段）。间的区段）。(2) (2) 噬菌体的基因组特点噬菌体的基因组特点 构建原理：构建原理：(3) (3) 噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建构建过程构建过程用限制性内切酶去用限制性内切酶去 dnadna分子上的非必需区分子上的非必需区在在 dnadna的非必需区内插入选择标记基因的非必需区内插入选择标记基因 噬菌体噬菌体dna上本身有上本身

54、有5个个 ecor i 和和7 个个hind iii切点！切点！删除删除 噬菌体的非必需区，留出插入空间。噬菌体的非必需区，留出插入空间。 dna dna如质粒载体那样直接转化细菌时效率远如质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。比质粒低。在试管中与在试管中与 噬菌体的噬菌体的头部头部和和尾部尾部蛋白人工装蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组组dnadna注入受体菌中。注入受体菌中。必须利用噬菌体外壳的作用！必须利用噬菌体外壳的作用！体外包装：体外包装：建立建立 dnadna分子体外包装系统分子体外包装系统 人工构建的人工构建的 噬菌体

55、载体有两种类型：噬菌体载体有两种类型：a. a. 插入型载体（插入型载体（insertion vectors)insertion vectors)：只具有一个外源只具有一个外源dnadna插入限制酶位点，如插入限制酶位点，如 gt10gt10、 gt11gt11、 bv2bv2、 nm540nm540、 nm1590nm1590、 nm607nm6071 1）免疫功能失活型：）免疫功能失活型：插入位点位于载体合成活性插入位点位于载体合成活性阻遏物区域阻遏物区域（cici基因）内。基因）内。ecor ici gt10插入导致载体不能合成阻遏物，插入导致载体不能合成阻遏物， 载体载体dnadna不

56、能进不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑清晰的噬菌斑。 没有外源没有外源dnadna插入的插入的 载体感染受体菌形成载体感染受体菌形成混浊噬混浊噬菌斑菌斑。如如 nm1149载体的两个克隆位点（载体的两个克隆位点（ecor i 和和hind iii）都是位于）都是位于ci基因内部。基因内部。2 2） - -半乳糖苷酶失活型载体：半乳糖苷酶失活型载体：在在 基因组中引入了基因组中引入了laczlacz序列。（其上含有一个序列。（其上含有一个ecor i ecor i 克隆位点）。克隆位点）。感染感染laczlacz突变的大肠杆菌，经突变的大肠杆菌，经ip

57、tgiptg的诱导，利用的诱导，利用xgalxgal的显色反应的显色反应作选择标记。作选择标记。laczlacz ecor iecor icharon16acharon16ab.b. 替换型载体（替换型载体（substitution vectors)substitution vectors) 两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于 dnadna的非必须区两端。的非必须区两端。用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源酶切成的外源dnadna片断置换。片断置换。可置换区可置换区mcsmcsmcsmcs如：

58、如： embl4 embl4、charon40charon40等。等。 embl4 embl4 embl4 embl4的可置换片断内部还有的可置换片断内部还有sal isal i酶切位点。酶切位点。以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。左臂左臂可置换区可置换区右臂右臂ecor i ecor i bamh i bamh i sal isal isal i sal i bamh i bamh i ecor iecor isal isal i sal isal i embl4embl4比一般的质粒载体的容量大的多。比一般的质粒载体的容量大的多。 用在真核生物基因组文库的建立。用在真核生物基因组文库的建立。sau3asau3abamhibamhi(4)(4) dnadna载体的优点载体的优点19781978年年j. collinsj. collins和和b. hohnb. hohn等人发展出等人发展出cosmid cosmid vectorvector（cos cos site-carrying plassite-carrying plasmidmid) )。指含有抗性。指含有抗性基因、单一克隆位点及基因、单一克隆位点及 dna cos位点的细菌质粒。位点的细菌质粒。 dna dna：46kb46kb（1 1）大小）大小 （2 2）组成）