中国动物药材DNA条形码数据库.doc

1、中国动物药材DNA 条形码数据库 摘要 课题组联合相关研究者开展动物药材DNA 条形码分子鉴定研究， 并结合分析 GenBank 序列，采用 BLAST 分析防错、系统树分析防错和 Barcoding Gap 检验防错等方法核验序列的可靠性，构建了中国动物药材 DNA 条形码数据库。该库由样品数据库、序列数据库和文献数据库组成，包含 800 余种动物药材和大量动物药材混伪品及密切相关物种。中国动物药材 DNA 条形码数据库可以通过中药材 DNA 条形码鉴定系统 （ ）进行网络访问并实现未知动物样本的 DNA 条形码鉴定。该研究首次构建统一的中国动物药材 DNA 条形码数据库，对动物药材鉴定、资

2、源可持续利用和濒危物种保护均有重要意义。 关键词 动物药材；数据库；COI ；鉴定DNA 条形码技术是动物药材鉴定的新工具1 ，国家药典委员会已讨论通过在中国药典增补本中列入中药材DNA 条形码分子鉴定指导原则2 。本课题组联合相关研究者开展了大量的动物药材DNA 条形码分子鉴定研究工作。鄢丹等对包含羚羊角、鹿角的传统角类药材进行DNA 条形码研究 3 ，并以此为基础提出了濒危动物药材的贸易监控和替代品寻找策略4 。张辉等对 中国药典 45 种动物药材及其混伪品进行 DNA 条形码研究， 结果表明 45 种动物药材的正品来源与其混伪品均可相互区分 5 。崔丽娜等利用 COI序列对金钱白花蛇及其

3、常见混伪品进行DNA 条形码鉴别研究，结果表明， 金钱白花蛇COI 序列可以明确地与混伪品区分开 6 。胡嵘等对海马、海龙及其混伪品共14 个种20 份样品的COI条形码序列进行研究， 结果表明运用COI序列能够准确鉴定海马、海龙的基原动物及其混伪品7 。此外，还开展了龟甲、鳖甲、鹿茸以及蛤壳等的DNA 条形码研究工作8-11 。动物 DNA 条形码分子鉴定研究工作的大量开展，为构建中国动物药材DNA 条形码数据库奠定了基础。DNA 条形码数据库不仅是存储样品信息和DNA 条形码序列的工具，而且是DNA 条形码研究和物种鉴定分析的生物信息学平台，对推动DNA 条形码研究发展具有重要意义12 。

4、第一个国际 DNA 条形码数据系统（ BOLD ）由国际生命条形码联盟（ CBOL ）于 2007 年建立 13 。此外，国际上还有多个针对特定动物类群的条形码数据库，如：FishBarcode of Life Campaign（ FISH-BOL ， http：// ）， Lepidoptera Barcode of Life （ http ：// ）， Mammalia Barcode of Life Campaign（ http ：// ）。此外，邵鹏柱等初步构建了传统药物 DNA 条形码

5、数据库（ http ：/4/mherbsdb/ ），包含 1 661 个物种， 36 679 条序列14 。当前， 我国尚未构建统一的动物药材DNA 条形码数据库，制约了DNA 条形码技术在动物药材鉴定、资源可持续利用和濒危物种保护中的进一步应用。1 材料中国动物药材DNA 条形码数据库中的序列来自于课题组联合相关研究者所开展的动物药材DNA 条形码分子鉴定研究及 GenBank，包含 800 余种动物药材和大量动物药材混伪品及密切相关物种（表1）。2 方法对包含测序峰图的样品，根据 Q 值进行单碱基和序列质量检测。对不包含测序峰图的样品，使用EMBOSS Transe

6、q将核酸序列翻译为蛋白序列，利用隐马尔可夫模型（hiddenMarkov model ，HMM ）进行 COI 条形码区域核验13 。采用BLAST 分析防错、系统树分析防错和Barcoding Gap 检验防错等核验 COI 序列的可靠性 2 ，使用 Muscle 3.8 进行多序列比对15 ，使用Paup 4.0 进行遗传距离计算16 ，使用MEGA 6.0构建NJ（邻接法）系统聚类树17 。使用BLAST方法进行物种鉴定分析，使用MySQL 进行数据库管理，通过 MySQLdb 连接 MySQL 数据库。3 结果与讨论3.1 数据库构成中国动物药材DNA 条形码数据库由样品数据库、序列数

7、据库和文献数据库构成。样品数据库包含完整的样品采集和鉴定信息，即：样品编号、分类信息、凭证信息、采集者、采集地、鉴定者、1 张到数张样品及生境照片等。从GenBank 中下载 GB 格式文件，利用BioPython进行解析。仅保留物种分类地位清晰，拉丁名不包含“sp.”，“spp.”等字符的 Record。提取 Record 注释中基因名称为“COI ”或“ CO1 ”区域的序列，如 Record 来自于已发表的文献，收集该文献的 PubMed ID 、题目、作者、期刊、摘要等信息构成文献数据库。此外，文献数据库还包含本课题组联合相关研究者所开展的动物药材 DNA 条形码分子鉴定研究文献。中国

8、动物药材 DNA 条形码数据库包含 2010 年版中国药典 18 和中国药用动物志 （第 2 版） 19 所载 800 余种动物药材和大量动物药材的混伪品和密切相关物种的COI 序列。此外，中国动物药材 DNA 条形码数据库还包含样品采集、样品处理、 DNA 提取、 PCR 扩增、测序、序列拼接及结果判定等的标准操作方法和技术流程（图1）。3.2 数据库动态管理中国动物药材DNA条形码数据库每 6 个月更新 1 次。新增加样品如包含测序峰图，则依照中药材 DNA 条形码分子鉴定指导原则去除测序峰图两端的低质量区域 2 ，即：以 20 bp 的窗口分别从序列5端和 3端进行滑动，如果窗口内有多于

9、2个碱基的 Q值3.3 物种鉴定系统未知样品可以通过中药材DNA 条形码鉴定系统进行鉴定，其访问地址为 。任何对中国动物药材 DNA 条形码鉴定感兴趣的单位和个人，均可将获得的未知样品COI 条形码序列粘贴到物种鉴定模块的查询框，然后点击提交进行鉴定。查询COI 序列的长度须大于300 bp，且序列所含不确定碱基（ Ns）的数目应小于1%。当前，该系统支持Fasta（含“ ”号）格式和纯序列格式（不含“ ”号）查询。物种鉴定系统可以很快查询到数据库中与未知样品序列最相似的序列，并给出数据库中该序列的物种信息。为便于使用者对鉴定结果进行核对，物种鉴定系统同时列出了数据库中与查询序列相似性最高的前

10、20 条序列，并列出序列相似性、分值、E 值及比对信息（图2）。4 结论动物药材是我国传统医药的重要组成部分，在我国已有两三千年的应用历史，从秦汉时期的神农本草经，到历版中国药典都收载有动物药材，据第三次中药资源普查结果，我国药用动物有11 门， 415 科， 861 属， 1 581 种。我国动物药材多数来自野生，资源有限，部分药材的基原动物如穿山甲、赛加羚羊、梅花鹿等已被列入国家重点保护野生动物名录 （ http： /）和濒危野生动植物种国际贸易公约附录 （ http：/ ）。此外，除使用动物全体的药材外，动物药材多取自动物的不同组织或器官，例如：角、甲、壳、骨、皮等，形态鉴定特征不完整，

11、给动物药材的性状鉴定带来较大困难20 。DNA 条形码鉴定快速准确、有望实现自动鉴定，是传统生物鉴定方法的有效补充，应用前景广阔 1 。本研究首次构建我国统一的中国动物药材 DNA 条形码数据库，对动物药材鉴定、资源可持续利用和濒危物种保护均有重要意义。同时，中国动物药材 DNA 条形码数据库也为自动化动物药材鉴定仪器的开发奠定基础。随着我国动物药材 DNA 条形码鉴定研究的深入开展，动物药材 DNA 条形码鉴定研究的参与单位和参与者逐渐增多，越来越多的动物药材品种被研究和测序，许多制约大规模 DNA 条形码数据库构建的障碍也逐渐消除。随着测序费用的逐步降低，特别是高通量测序技术的普及和应用，

12、可以用极低的成本在短时间内获得大量样本的条形码序列。此外，计算机及网络技术的发展为动物药材DNA 条形码库的使用和共享提供了便捷的平台。当前，中国动物药材DNA条形码库收载动物药材的种类还比较有限，部分动物药材的COI 序列来自于 GenBank。将来，课题组需要联合相关研究者，依照中药材 DNA 条形码分子鉴定指导原则的标准操作规范，一方面增加数据库中动物药材的种类，另一方面增加数据库中动物药材样品的数目，进一步完善中国动物药材DNA 条形码数据库。加拿大动物学家Paul Hebert 等 21 对动物界，包括脊椎动物和无脊椎动物共11 门 13 320 个物种 COI 基因序列比较分析表明

13、，除腔肠动物Cnidaria 外， 98%的物种种内遗传距离差异为 02%。然而，种内遗传差异 2%的物种也逐渐被发现 22 。因此， 当利用中国动物药材 DNA 条形码数据库进行鉴定时，只有当查询序列与参考序列比对部分的长度大于参考序列长度的 50%，且具有 2%的遗传差异时， 才给出物种水平的鉴定结果，除此之外，仅列出数据库中与查询序列最接近序列的相关信息。此外，物种鉴定利用BLAST 进行鉴定，当比对部分的覆盖度小于参考序列长度的 50%，且相似度 80% 时， BLAST 比对结果的参考意义较小，物种鉴定系统会提示数据库中没有与查询序列最相似的序列。 参考文献 1 陈士林，郭宝林，张贵

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16、. 海马、海龙基于 COI 条形码的 DNA 分子鉴定 J. 吉林中医药， 2012，32（ 3）：272.8 杜鹤，崔丽娜，张辉，等 . 鳖甲及其混伪品的 DNA分子鉴定 J. 世界科学技术中医药现代化，2011，13（2）：429.9 崔丽娜，杜鹤，孙佳明，等 . 基于 COI 条形码序列的龟甲及其混伪品的 DNA 分子鉴定 J. 吉林中医药， 2012，32（ 2）： 176.10 崔丽娜，杜鹤，刘新成，等 . 基于 COI 条形码序列的鹿茸及其混伪品的 DNA 分子鉴定 J. 吉林中医药， 2012，32（ 4）： 384.11 杜鹤，崔丽娜，孙佳明，等 . 基于COI 序列的蛤壳及其

17、混伪品的DNA 分子鉴定 J. 吉林中医药， 2012， 32（ 1）： 55.12 陈士林 . 中药 DNA 条形码分子鉴定 M. 北京：人民卫生出版社， 2012.13Ratnasingham S ，Hebert P D. Bold ： the barcode of lifedata system（http ：/ ）J. Mol Ecol Notes ，2007， 7（ 3）： 355.14Lou S K ，Wong K L ，Li M ， et al. An integrated webmedicinal materials DNA databa

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21、tegrated DNA barcoding database for identifying Chinese animal medicineSHI Lin-chun1，YAO Hui1，XIE Li-fang2，ZHU Ying-jie1，SONG Jing-yuan1 ， ZHANG Hui3 ， CHEN Shi-lin4*（1. Institute of Medicinal Plant Development， ChineseAcademy of Medical Sciences ，Peking Union Medical CollegeBeijing 100193 ，China ；2

22、. Information Centre ， Chinese Academy of MedicalSciences， Beijing 100730 ， China；3. Development Center of Traditional Chinese Medicine，and Bioengineering ，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun130117， China；4.Institute of Chinese Materia Medica ， China Academy ofChinese Medical Sciences

23、，Beijing 100700 ， China）Abstract In order to construct an integrated DNAbarcoding database for identifying Chinese animal medicine ，theauthors and their cooperators have completed a lot of researches for identifying Chinese animal medicines using DNA barcoding technology. Sequences from GenBank have been analyzed simultaneously. Three different methods ， BLAST ，barcoding gap and Tree building ，have been used to confirm the reliabilities of barco