实验五微生物的大小2

1、实验五实验五 大肠杆菌生长曲线的大肠杆菌生长曲线的测定测定、微生物大小及数量测定、微生物大小及数量测定了解光电比浊计数法的原理。了解光电比浊计数法的原理。 学习、掌握光电比浊计数的操作方法。学习、掌握光电比浊计数的操作方法。通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长曲线。特征和规律，绘制生长曲线。 实验实验( (一一) ) 大肠杆菌生长曲线的测定大肠杆菌生长曲线的测定一、实验目的一、实验目的生长曲线生长曲线 将少量纯种单细胞微生物接种到定量的将少量纯种单细胞微生物接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，液体培养基中，定时取样测定细胞数量

2、，以培养时间为横坐标，以菌数为纵坐标作以培养时间为横坐标，以菌数为纵坐标作图，得到一条反映单细胞微生物在整个培图，得到一条反映单细胞微生物在整个培养期间菌数变化规律的曲线。养期间菌数变化规律的曲线。二、实验原理二、实验原理一个典型的生长曲线分为延缓期、对数期、一个典型的生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期稳定期和衰亡期四个时期稀释平板计数法稀释平板计数法对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。优点：优点：活菌计数方法，对设备要求不高。活菌计数方法，对设备要求不高。缺点：缺点：操作复杂。操作复杂。显微镜直接计数法显微镜直接计数法使用血球计数板在显微镜

3、下直接计数。使用血球计数板在显微镜下直接计数。优点：优点：操作简便，计数直观。操作简便，计数直观。缺点：缺点：计数结果为活细菌和死菌体的总和。计数结果为活细菌和死菌体的总和。光电比浊法光电比浊法光电比浊法是利用在一定的范围内，微生物细光电比浊法是利用在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比的原理。当细菌细胞在胞浓度与透光度成反比的原理。当细菌细胞在溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中测定时所吸收的光线越多。测定时所吸收的光线越多。优点：优点：简便快速，适合于自动控制。简便快速，适合于自动控制。 缺点：缺点：测定结果受培养液成分影响；某些样品测定结

4、果受培养液成分影响；某些样品 样品不适合用此法。样品不适合用此法。 菌种菌种 培养不同时段的大肠杆菌。培养不同时段的大肠杆菌。仪器或其他用具仪器或其他用具 分光光度计，比色皿等。分光光度计，比色皿等。三、实验器材三、实验器材开电源，仪器预热开电源，仪器预热20 min20 min，将波长调至，将波长调至600 600 nmnm处。处。打开样品室，将挡光体插入比色皿架，将打开样品室，将挡光体插入比色皿架，将其推或拉入光路。其推或拉入光路。盖好样品室盖，在盖好样品室盖，在t modet mode下，按下，按0%t0%t键调零键调零透射比。透射比。取出挡光体，按取出挡光体，按100%t/oa100%

5、t/oa键调键调100%100%透射比。透射比。四、实验步骤四、实验步骤1.1.样品测试前的调试样品测试前的调试2.2.样品测定样品测定将参比溶液（未接种的将参比溶液（未接种的lblb液体培养基）以及液体培养基）以及被测溶液倒入比色皿中。被测溶液倒入比色皿中。打开样品室盖，将参比溶液放在样品架的第打开样品室盖，将参比溶液放在样品架的第一个槽位中，将被测溶液依次放入其它槽位。一个槽位中，将被测溶液依次放入其它槽位。将参比溶液推入光路，按将参比溶液推入光路，按100%t/oa100%t/oa键调满度。键调满度。按按modemode，将测试方式调至吸光度方式（，将测试方式调至吸光度方式（a a）。）

6、。此时此时, ,显示器显示显示器显示“0.000”0.000”。将被测溶液推入光路，显示器显示为被测样将被测溶液推入光路，显示器显示为被测样品的吸光值。品的吸光值。 在在600 nm600 nm波长下，用未接种的波长下，用未接种的lblb液体培液体培养基作空白对照，分别对培养了养基作空白对照，分别对培养了0 0、4 4、8 8、1212、1616和和20 h20 h的大肠杆菌培养液，进行光电比浊的大肠杆菌培养液，进行光电比浊测定。测定。 比色皿经蒸馏水清洗后，必须经待测样比色皿经蒸馏水清洗后，必须经待测样品润洗。比色皿的毛面用吸水纸擦干，而光品润洗。比色皿的毛面用吸水纸擦干，而光面只能用吸水纸

7、吸干，以免光面被划破。面只能用吸水纸吸干，以免光面被划破。 比色皿之间吸光度进行比较。比色皿之间吸光度进行比较。四、实验结果四、实验结果 记录不同记录不同的的odod600600值，值，并绘制大肠杆菌的生长曲线。并绘制大肠杆菌的生长曲线。 培养时间培养时间（h） 4 8 12 16 20 光密度值光密度值od600五、思考题五、思考题光电比浊计数的原理是什么？这种计数法有何光电比浊计数的原理是什么？这种计数法有何优缺点？优缺点？学习使用镜台测微尺和目镜测微尺学习使用镜台测微尺和目镜测微尺在显微镜下测定微生物大小的方法。在显微镜下测定微生物大小的方法。实验实验( (二二) ) 微生物大小的测定微

8、生物大小的测定一、目的要求一、目的要求 对于病毒、细菌、放线菌、真菌和原生动物等不同类对于病毒、细菌、放线菌、真菌和原生动物等不同类型的微生物来说，它们的大小存在很大的差异。型的微生物来说，它们的大小存在很大的差异。 在同一类型中不同种类的微生物，或同一种类中不同在同一类型中不同种类的微生物，或同一种类中不同时期的微生物个体，它们的大小也存在很大的差异。时期的微生物个体，它们的大小也存在很大的差异。二、实验原理二、实验原理 镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是将一般是将l mml mm等分为等分为100100格，每格长格，每格长0.01

9、 mm(0.01 mm(即即10 10 um) um) ，用于校正目镜测微尺每格的相对长度。，用于校正目镜测微尺每格的相对长度。 目镜测微尺是一块目镜测微尺是一块中央有精确的等分刻度中央有精确的等分刻度的圆形的圆形小玻片，置于接目镜中的隔板上。小玻片，置于接目镜中的隔板上。目镜测微尺每小格目镜测微尺每小格所代表的实际长度不一样，所代表的实际长度不一样，测量前，测量前，必须先用镜台测必须先用镜台测微尺进行校正微尺进行校正。目镜测微尺镜台测微尺利用镜台测微尺测利用镜台测微尺测定目镜测微尺的每定目镜测微尺的每格绝对值格绝对值目镜测微尺测定微目镜测微尺测定微生物大小生物大小三、实验器材三、实验器材1

10、1、菌种：、菌种：酿酒酵母（酿酒酵母（saccharomyces cerevisiaesaccharomyces cerevisiae ）2 2、器材：、器材： 显微镜、镜台测微尺、目镜测微尺显微镜、镜台测微尺、目镜测微尺三、实验步骤三、实验步骤1 1、目镜测微尺的校正、目镜测微尺的校正 镜台测微尺有刻度的一面朝上，置显微镜载物台上，镜台测微尺有刻度的一面朝上，置显微镜载物台上，先在低倍镜下，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野先在低倍镜下，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央。转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的中央。转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。利用移动器移动镜台测微尺

11、，使两尺在某刻度平行。利用移动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，分别数出两重合线之间镜台一区域内两线完全重合，分别数出两重合线之间镜台微尺和目镜微尺所占的格数。计算微尺和目镜微尺所占的格数。计算40 x40 x下目镜测微尺的下目镜测微尺的校正值。校正值。目镜测微尺每格长度（目镜测微尺每格长度（umum）两重合线间镜台测微尺）两重合线间镜台测微尺格数格数10/10/两重合线间目镜测微尺格数两重合线间目镜测微尺格数2 2、细胞大小的测量、细胞大小的测量 酵母菌悬液滴在载玻片上，盖上盖玻片，置显微酵母菌悬液滴在载玻片上，盖上盖玻片，置显微镜载物台上。用目镜测微尺测量细胞宽和长。镜载物

12、台上。用目镜测微尺测量细胞宽和长。三、实验结果三、实验结果计算出目镜测微尺校正结果以及酵母菌大小测计算出目镜测微尺校正结果以及酵母菌大小测定结果定结果 四、思考题四、思考题1 1、为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，、为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？1 1、明确血细胞计数板计数的原理。、明确血细胞计数板计数的原理。2 2、掌握使用血细胞计数板进行微生、掌握使用血细胞计数板进行微生 物计数的方法。物计数的方法。 实验实验( (三三) ) 微生物数量的测定微生物数量的测定一、目的要求一、目的要求二、实验原理

13、二、实验原理显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上玻片上( (又称计菌器又称计菌器) )，于显微镜下直接计数，于显微镜下直接计数的一种方法。的一种方法。显微镜直接计数法的优点是直观、快速。缺显微镜直接计数法的优点是直观、快速。缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色，微室培养等方法来达到只如结合活菌染色，微室培养等方法来达到只计数活菌体的目的。计

14、数活菌体的目的。 血细胞计数板由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横血细胞计数板由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室是由一个大方格为九个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室是由一个大方格分成分成2525个中方格，而每个中方格又分成个中方格，而每个中方格又分成1616个小方格；共计个小方格；共计400400个小个小方格。每一个大方格的面积为方格。每一个大方格的面积为1 mm1 mm2 2，盖玻片与计数区之间的高度，盖玻

15、片与计数区之间的高度为为0.1 mm0.1 mm，所以计数室的容积为，所以计数室的容积为0.1 mm0.1 mm3 3 。计数时，通常在计数时，通常在4040下下数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，以及大方格中的总菌数，再换算成格的平均值，以及大方格中的总菌数，再换算成1 ml1 ml菌液中的总菌菌液中的总菌数。数。(1ml=(1ml=? ? mm3)mm3)个计数室个计数室mmmm包含包含个中方格个中方格个中方格个中方格个小方格个小方格三、实验器材三、实验器材 1 1、菌种：、菌种： 酿酒酵母酿酒酵母 2 2、器材：、器材： 显微镜、血球计

16、数板显微镜、血球计数板三、实验步骤三、实验步骤 1 1、在、在1010和和4040下找到计数室。下找到计数室。2 2、盖上盖玻片将摇匀的酿酒酵母菌（或大肠杆菌）悬、盖上盖玻片将摇匀的酿酒酵母菌（或大肠杆菌）悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室。如滴入过多，溢出并流入两侧槽内，使自动进入计数室。如滴入过多，溢出并流入两侧槽内，使盖玻片浮起，体积改变，会影响计数结果，需用滤纸把多盖玻片浮起，体积改变，会影响计数结果，需用滤纸把多余的溶液吸出，以槽内没有溶液为宜。如滴入溶液过少，余的溶液吸出，以槽内没有溶液为宜。如滴入溶液过少，经多次充液，易产生气泡，应洗净计数室，干燥后重做。经多次充液，易产生气泡，应洗净计数室，干燥后重做。3 3、静置，先用低倍镜将计数室移至视野中央。、静置，先用低倍镜将计数室移至视野中央。4 4、在高倍下计数：每个计数室选、在高倍下计数：每个计数室选5 5个中格个中格(4(4个角和中央个角和中央的一个中格的一个中格) )中的菌体进行计数。对于分布在刻线上的细中的菌体进行计数。对于分布在刻线