DNA测序化学降解法PPT学习教案

1、会计学1DNA测序化学降解法测序化学降解法脱氧核糖含氮碱基磷酸A G C TDNA的基本单位腺嘌呤腺嘌呤腺嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶胞嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶第1页/共35页 DNA测序：测定未知序列 确定重组DNA的方向与结构 对突变进行定位和鉴定 比较研究第2页/共35页第3页/共35页第二代测序技术第二代测序技术GS FLX测序技术（罗氏454 公司）solexa测序技术（Illumina 公司）SOLiD测序技术（AB I公司）第4页/共35页测序技术454454SolexaSolexaSOLiDSOLiD上市时间200520072007价格（万美元，2007）504559

2、单次反应数据量0.42050读长（bp）40050*250优势长读长低测序成本，高性价比高通量，高准确度第5页/共35页第三代测序技术第三代测序技术 第二代测序技术在制备测序文库的时候都需要经过PCR扩增，而这一PCR过程可能引入突变或者改变样品中核酸分子的比例关系。另外，第二代测序的读长普遍偏短，在进行数据拼接时会遇到麻烦。为了克服这样的缺点，业界发展出了以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术。 Heliscope单分子测序仪SMRT技术纳米孔单分子技术第6页/共35页Maxam-Gilbert DNA 化学降解法化学降解法基本原理：直接或间接特异性识别4 种碱基特定化学试剂可对碱基

3、进行特异性修饰在修饰碱基处(5或3)打断磷酸二酯键将一个 DNA 片段的 5 端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而 5 端被标记的 DNA 片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的 DNA 的碱基序列。操作步骤 将双链DNA样品变为单链 每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带 分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体 电泳,读取DNA的核苷酸顺序第7页/共35页第8页/共35页 先用限制性内切酶把DNA切成10200bp 的测序材料； 用碱性磷

4、酸化酶处理该片段，消除5末端上的磷酸； 在5OH端标记 32P，用多核苷酸磷酸激酶催化； 标记片段变性为单链； 用特异的化学试剂作用于不同的碱基进行修饰，然后用哌啶甲酸切断反应碱基的多核苷酸链，紧接着用四组不同的特异反应可以使末端标记的DNA分子切成不同长度的片段， 产生一组其末端都是该特异碱基的长度不等的DNA片段； 经电泳和放射性自显影后，从4个反应系统统一阅读，待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出第9页/共35页该反应的关键在于使该反应的关键在于使DNA的的4种核苷酸中，只有种核苷酸中，只有1-2种发生种发生特异性的化学切割反应：特异性的化学切割反应：碱基的特异性修饰；修饰的碱基从核糖

5、环上转移；失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂。专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯（dimethylsulphate)和肼(hydrazine)、哌啶甲酸等。 第10页/共35页 肼，又称联氨 NH2.NH2 在碱性环境中作用于胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的C4和C6位置导致糖苷键断裂。 如果加入高浓度的盐（1.5M NaCl），肼则主要作用于胞嘧啶C使之断裂。 在高温强碱作用(90,1.2M NaOH)下可使腺嘌呤A位点发生剧烈的断裂反应,但对胞嘧啶C的反应较弱哌啶甲酸(90,1mol/L)在修饰位点两端使DNA的糖-磷酸链断裂 胞嘧啶胸腺嘧啶第11页/共35页 硫酸二

6、甲酯dimethyl sulphate ，DMS ，（CH3O）2SO2： 一种碱性化学试剂，可以使DNA链上的腺嘌呤A的N2和鸟嘌呤G的N甲基化，但是鸟嘌呤G的N甲基化速度比腺嘌呤A的N2甲基化速度要快4-10倍，并且在中性pH环境中，DMS主要作用于鸟嘌呤G，使之甲基化，导致糖苷键断裂。热哌啶：使DNA链上的嘌呤在酸的作用下发生糖苷水解，导致DNA链在脱嘌呤位点（G和A）发生断裂。第12页/共35页DNA化学降解反应体系化学降解反应体系反应体系反应体系 碱基修饰试剂碱基修饰试剂 碱基修饰反应碱基修饰反应 主链断裂试剂主链断裂试剂 断裂点断裂点G 硫酸二甲酯硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化鸟嘌呤甲基

7、化 六氢吡啶六氢吡啶 GG+A 甲酸甲酸 脱嘌呤作用脱嘌呤作用 六氢吡啶六氢吡啶 G和和AC+T 肼肼 嘧啶开环嘧啶开环 六氢吡啶六氢吡啶 C和和TC 肼（加盐）肼（加盐） 胞嘧啶开环胞嘧啶开环 六氢吡啶六氢吡啶 C DMS（硫酸二甲酯）在（硫酸二甲酯）在中性中性pH环境，环境，主要主要作用于作用于G，被六氢吡啶作用而造成该位点上，被六氢吡啶作用而造成该位点上DNA链的断裂。链的断裂。 甲酸甲酸具有脱嘌呤作用。具有脱嘌呤作用。DNA链在脱嘌呤位点链在脱嘌呤位点(G和和A)发生断裂。发生断裂。 肼肼，在，在碱性条件下，作用于碱性条件下，作用于T胸腺嘧啶和胸腺嘧啶和C胞嘧啶胞嘧啶，在具有六氢吡啶的

8、条件下，导致在这个核苷酸位置上发生，在具有六氢吡啶的条件下，导致在这个核苷酸位置上发生DNA链的断裂。如果在反应体系中加入链的断裂。如果在反应体系中加入高浓度的盐高浓度的盐，同胸腺嘧啶的反应速率便会下降，主要作用于，同胸腺嘧啶的反应速率便会下降，主要作用于C胞嘧啶胞嘧啶。A C 肼肼 90C, NaOH (1.2M) 断裂反应第13页/共35页 在在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的的机制是：机制是： G+A反应反应-（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键弱了嘌呤脱

9、氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。，然后哌啶置换了嘌呤。 G反应反应-硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（DMS）使）使GN7甲基化，其后断开甲基化，其后断开了了C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。 T+C反应反应-肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。 C反应反应-在在NaCl存在时，只有存在时，只有C才能与肼发生反应，随才能与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。第14页/共35页 在在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂种反应体系

10、中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是：的机制是： G+A反应反应-（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。呤。 G反应反应-硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（DMS）使）使GN7甲基化，其后断开了甲基化，其后断开了C8-C9间间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。 T+C反应反应-肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。 C反应反应

11、-在在NaCl存在时，只有存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，被修饰才能与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。的胞嘧啶被哌啶置换。第15页/共35页第16页/共35页哌啶第17页/共35页5 GATCACTACTG 3 标记标记5 *GATCACTACTG 3 G：DMSC：肼（加盐：肼（加盐）G+A：甲酸：甲酸C+T：肼：肼5-*GATCACTACTG 5-*G G5-*GATCACTACTG 5-*GATCACTA 5-*GATCA5-*GA 5-*G 5-*GATCACTAC 5-*GATCACT 5-*GATCAC5-*GATC 5-*GAT 5-*GATCACTACT 5-

12、*GATCACTACTG- 5-*GATCACTAC 5-*GATCAC5-*GATC -*GATCACTACTG- 第18页/共35页在化学修饰反应过程中，通过在化学修饰反应过程中，通过控制反应温度和反应时间控制反应温度和反应时间，只有，只有一小部分碱基被修饰一小部分碱基被修饰(而不是全部被修饰而不是全部被修饰)，随后，随后进行的断裂反应也是进行的断裂反应也是定量反应定量反应。因此，。因此，DNA链并不是在链并不是在所有可被修饰的碱基位点断裂，而是所有可被修饰的碱基位点断裂，而是随机断裂随机断裂。在。在4个个反应中，产生反应中，产生4套带相同标记末端、长短不一的寡聚核套带相同标记末端、长短不

13、一的寡聚核苷酸片段。苷酸片段。只有带标记末端的片段可被识别只有带标记末端的片段可被识别，没有标记，没有标记末端的片段可以忽略不计。末端的片段可以忽略不计。第19页/共35页 在在化学修饰反应过程中，通过化学修饰反应过程中，通过控制反应温度和反应时间控制反应温度和反应时间，只有，只有一一小部分碱基被修饰小部分碱基被修饰(而不是全部被修饰而不是全部被修饰)，随后进行的断裂反应也是，随后进行的断裂反应也是定定量反应量反应。因此，。因此，DNA链并不是在所有可被修饰的碱基位点断裂，而是链并不是在所有可被修饰的碱基位点断裂，而是随机断裂随机断裂。在。在4个反应中，产生个反应中，产生4套带相同标记末端、长

14、短不一的寡聚套带相同标记末端、长短不一的寡聚核苷酸片段。核苷酸片段。只有带标记末端的片段可被识别只有带标记末端的片段可被识别，没有标记末端的片段，没有标记末端的片段可以忽略不计。可以忽略不计。第20页/共35页第21页/共35页具体的测定过程中，首先将3端或5端的双链DNA溶解在总体积为50L的、分别含有0.03mol/LNaOH、10%甘油、1mmol/L EDTA、0.05%二甲苯蓝和0.05%溴甲酚蓝的溶液中，使双链DNA变性。然后加到由5%10%的丙烯酰胺、0.16%0.33%的双丙烯酰胺、50mmol/LTris-硼酸、pH8.3的1mmol/L EDTA组成的凝胶板上，进行电泳和放

15、射性自显影等处理，制得一端带标记的单链DNA。第22页/共35页第23页/共35页第24页/共35页第25页/共35页第26页/共35页第27页/共35页化学法读序的方法化学法读序的方法 化学法测序放射自显影图谱的识读，比较复杂一些，这是因为化学裂化学法测序放射自显影图谱的识读，比较复杂一些，这是因为化学裂解反应并不完全是碱基特异性的，每组测序图谱为解反应并不完全是碱基特异性的，每组测序图谱为4或或5条垂直的阶梯带条垂直的阶梯带，AC反应可以不做。该片从胶底部一个个向顶部读，反应可以不做。该片从胶底部一个个向顶部读，G+A和和C+T两列两列中含有所有相差一个碱基的中含有所有相差一个碱基的DNA

16、片段。片段。如果如果G+A中出现中出现1条带就看条带就看G列中列中是否有同样大小的带，若有即为是否有同样大小的带，若有即为G碱基，无则为碱基，无则为A碱基；同理，碱基；同理，C+T中则中则检查检查C列中有无同样大小条带，有即为列中有无同样大小条带，有即为C，无则为，无则为T。在做了在做了AC反应时反应时，出现较深的带时，可以帮助确定为，出现较深的带时，可以帮助确定为A碱基。化学法必须碱基。化学法必须4或或5个反应管统个反应管统一阅读，一阅读，DNA中中4个碱基每个位置都有个碱基每个位置都有1个相应的片段，待测的个相应的片段，待测的DNA全部全部序列可直接读出。序列可直接读出。 化学法测序采用化

17、学法测序采用32P标记标记DNA进行，条带会较末端法更模糊，更宽，进行，条带会较末端法更模糊，更宽，由于分辨率不足，从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为由于分辨率不足，从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为200-300bp以内以内。第28页/共35页聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳将电泳将DNADNA链按长链按长短分开短分开, ,根据放射根据放射自显影显示区带自显影显示区带，直接读出，直接读出DNADNA的的核苷酸序列。核苷酸序列。如果如果G+A中出现中出现1条带就看条带就看G列中是否有同样大小的带，若有即为列中是否有同样大小的带，若有即为G碱基，无则为碱基，无则为A碱基；同理，碱基；同理，C+T

18、中则检查中则检查C列中有无同样大小条带，有即为列中有无同样大小条带，有即为C，无则为，无则为T。第29页/共35页在做了在做了AC反应时，出现较深的带时，可以帮助确定为反应时，出现较深的带时，可以帮助确定为A碱基。碱基。第30页/共35页DNA序列测定的应用序列测定的应用1) 测序测序 PCR克隆测序验证 突变体检测 新基因测序 全基因组测序 系统发育及物种鉴定2) 2) 片段分离片段分离 个体识别：亲缘鉴定 SNP关联分析 疾病诊断等第31页/共35页Maxam-Gilbert化学降解法的测序长度约250bp 优点：不需要进行酶催化反应，因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差；对未经克隆的 DNA 片段可以直接测序；化学