第四章药物方法验证

1、第四章第四章 药物定量分析药物定量分析和分析方法验证和分析方法验证药物分析的一般规律 判断药物真伪-鉴别 判断药物质量的优劣-纯度 杂质检查-控制主成分之外的杂质 含量测定-测定药物中主成分的含量第一节第一节 定量分析样品的前处理方法定量分析样品的前处理方法 概述概述 不经有机破坏的分析方法不经有机破坏的分析方法 经有机破坏的分析方法经有机破坏的分析方法 前处理：特殊分析对象的前处理：药物制剂、生物样品前处理：特殊分析对象的前处理：药物制剂、生物样品 特殊药物成分的前处理特殊药物成分的前处理概概 述述前处理的目的前处理的目的：将特定原子或离子从药物中分离出来，转变为适合分析状态将特定原子或离子

2、从药物中分离出来，转变为适合分析状态适用药物对象：适用药物对象： 含金属元素（含金属元素（Bi、Al、Mg、Zn等）等） 含卤素元素（含卤素元素（F、Cl、I） 含氮、硫、磷等含氮、硫、磷等前处理方法： 依据待测元素在药物分子中结合的牢固程度，各有不同 泛影酸泛影酸 碘番酸碘番酸 三氯叔丁醇三氯叔丁醇 磺溴酞钠磺溴酞钠COOHNHCOCH3CH3CONHIIIDiatrizoic acidCH2CH2(C2H5)COOHNH2III Iiopanoic acidCCH3CH3OHCCl3._ 12H2O ChlorobutanolCCOOBrBrBrBrHOSO3NaSO3NaOHSulfob

3、romophthalein sodiumOrganic halidesOrganic halides（有机卤化物）（有机卤化物） 酒石酸锑钾酒石酸锑钾 富马酸亚铁富马酸亚铁 卡巴胂卡巴胂COCHOOCHSbOCO-SbOOOCHCHCCOOO-O.K+2H2O3Antimony potassium tartrateOCOCHFeCHCOOFerrous fumarateAsNHCONH2OOHHOCarbarsoneOrganic metal-containing drugs Organic metal-containing drugs （有机金属化物）（有机金属化物）概概 述述前处理的目的前

4、处理的目的：将特定原子或离子从药物中分离出来，转变为适合分析状态将特定原子或离子从药物中分离出来，转变为适合分析状态适用药物对象：适用药物对象： 含金属元素（含金属元素（Bi、Al、Mg、Zn等）等） 含卤素元素（含卤素元素（F、Cl、I） 含氮、硫、磷等含氮、硫、磷等前处理方法： 依据待测元素在药物分子中结合的牢固程度，各有不同 不经有机破坏的分析方法不经有机破坏的分析方法 适用于： 所含金属离子或待测元素易于解离的药物 常用前处理方法：直接测定法经水解后测定法经还原分解后测定法 常用测定方法：配位滴定，氧化还原滴定，沉淀滴定直接测定的分析方法应用示例的分析方法应用示例葡萄糖酸锑钠葡萄糖酸锑

5、钠的测定 取本品约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水100ml、盐酸15ml与碘化钾试液10ml，密塞、振摇后，在暗处静置10min，用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每lml的硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)相当于6.088mg的Sb。K2ISbKI2Sb23H56423222OSNaNaI2OSNa2I经水解后测定法分析示例 三氯叔丁醇三氯叔丁醇的测定的测定 原理原理 三氯叔丁醇在氢氧化钠溶液中加热回流水解，氯元三氯叔丁醇在氢氧化钠溶液中加热回流水解，氯元素全部转变成氯化钠，然后用剩余滴定法，即

6、于水解液中素全部转变成氯化钠，然后用剩余滴定法，即于水解液中加硝酸酸化，再加入定量过量的硝酸银滴定液，使加硝酸酸化，再加入定量过量的硝酸银滴定液，使ClCl- -生成生成AgClAgCl沉淀，过量的硝酸银，以沉淀，过量的硝酸银，以FeFe3+3+为指示剂，用硫氰酸铵液为指示剂，用硫氰酸铵液回滴定。回滴定。CCl3 C(CH3)2 OH + 4NaOH回流回流(CH3)2 CO + 3NaCl + HCOONa + 2H2ONaCl + AgNO3AgCl + NaNO3AgNO3+ NH4SCNAgSCN + NH4NO3（淡棕红色）（淡棕红色）(Ksp=1.561010 )(Ksp=1.01

7、0 12 )Fe3+ + SCNFe (SCN) 2+不经有机破坏的分析方法不经有机破坏的分析方法 适用于： 所含金属离子或待测元素易于解离的药物 常用前处理方法：直接测定法经水解后测定法经还原分解后测定法 常用测定方法：配位滴定，氧化还原滴定，沉淀滴定经有机破坏的分析方法经有机破坏的分析方法适用于原子与碳原子结合牢固的药物适用于原子与碳原子结合牢固的药物 湿法破坏湿法破坏 ( (硝酸硝酸- -高氯酸法高氯酸法; ;硝酸硝酸- -硫酸法硫酸法; ;硫酸硫酸- -硫酸盐法等硫酸盐法等) ) 干法破坏干法破坏湿法破坏凯氏定氮法湿法破坏凯氏定氮法凯氏定氮法（凯氏定氮法（Kjeldahl method

8、Kjeldahl method，）是一种常用的确，）是一种常用的确定定有机化合物有机化合物中中氮氮含量的检测方法。这种方法是含量的检测方法。这种方法是由由凯耶达尔凯耶达尔在在18831883年年发明的。发明的。 凯氏定氮法的普遍适用性、精确性和可重复性已经得凯氏定氮法的普遍适用性、精确性和可重复性已经得到了国际的广泛认可。它已经被确定为检测食品到了国际的广泛认可。它已经被确定为检测食品中中蛋白质含量蛋白质含量的标准方法。的标准方法。 样本的分解：样本的分解： 蛋白质蛋白质 + H2SO4 (NH4)2SO4(aq) + CO2(g) + SO2(g) + H2O(g) 铵盐的分解：铵盐的分解：

9、 (NH4)2SO4(aq) + 2NaOH Na2SO4(aq) + 2H2O(l) + 2NH3(g) 氨的固定：氨的固定： B(OH)3 + H2O + NH3 NH4+ + B(OH)4 返滴定：返滴定： 2NH4+ +2 B(OH)4 + H2SO4 （NH4)2SO4 + 2B(OH)3 + 2H2O凯氏定氮法（凯氏定氮法（kjeldahl nitrogen determination）仪器装置 凯氏烧瓶：凯氏烧瓶：为3050ml（半微量法）或500ml（常量法）硅玻璃或硼玻璃制成的硬质茄形烧瓶蒸馏装置蒸馏装置（半微量法） ：1000ml的圆底烧瓶（A）、安全瓶（B）、连有氮气球的

10、蒸馏器连有氮气球的蒸馏器（C）、漏斗（D）、直形冷凝管（E）、100ml锥形瓶（F）橡皮管夹（G、H）注意注意 通过凯氏定氮法测得的含氮量一般被称作通过凯氏定氮法测得的含氮量一般被称作总凯氮量总凯氮量。总凯。总凯氮量有时并不能真正地反映样本中的蛋白质含量，因为所氮量有时并不能真正地反映样本中的蛋白质含量，因为所测定的部分含氮量可能不是由蛋白质转化来的。测定的部分含氮量可能不是由蛋白质转化来的。 如今，凯氏定氮法已经可以自动化进行，一些如今，凯氏定氮法已经可以自动化进行，一些催化剂催化剂（如（如氧化汞氧化汞或或硫酸铜硫酸铜）也被使用来提高反应速率。）也被使用来提高反应速率。 干法破坏干法破坏 干

11、法破坏法适用于湿法不易破坏完全的有机物（如含氮杂环干法破坏法适用于湿法不易破坏完全的有机物（如含氮杂环类有机物）以及某些不能用硫酸进行破坏的有机药物。类有机物）以及某些不能用硫酸进行破坏的有机药物。 氧瓶燃烧破坏氧瓶燃烧破坏 氧瓶燃烧法系将有机药物在氧气中燃烧，燃烧产物被吸氧瓶燃烧法系将有机药物在氧气中燃烧，燃烧产物被吸收液吸收后，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量收液吸收后，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定，该法适用于含卤素或含硫、磷、硒等有机药物分析测定，该法适用于含卤素或含硫、磷、硒等有机药物分析的前处理。的前处理。 氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法 原理：原理：氧瓶燃烧法系氧瓶燃烧法

12、系将有机药物放入将有机药物放入充满氧气充满氧气的的密闭密闭燃烧瓶中进燃烧瓶中进行行燃烧燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质，并将燃烧所产生的欲测物质吸收吸收于适当的吸收液中，于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定。检查或含量测定。适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析。适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析。NaClHClOClCNaOH2 溶液点燃氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法称样用材料及称样称样用材料及称样 A. A. 固体样品固体样品 无灰滤纸无灰滤纸 B. B. 液体样品液体样品 纸袋纸袋 C. C.

13、 软膏类样品：将适量样品置不含被测成分的蜡油纸中包软膏类样品：将适量样品置不含被测成分的蜡油纸中包裹严密，外层再用无灰滤纸包裹裹严密，外层再用无灰滤纸包裹氧气氧气吸收液吸收液 作用：吸收液的作用是将样品经燃烧分解所产生的各种作用：吸收液的作用是将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒等，定量地吸收并转变为一定的便价态的卤素、硫、氮、硒等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态。于测定的价态。氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法样品样品 吸收液吸收液测定方法测定方法FH2O茜素氟蓝分光光度法茜素氟蓝分光光度法 ClNaOH溶液溶液 银量法银量法、汞量法汞量法 BrSO2-NaOH液或液或NaOH液液-

14、硫酸肼饱和液硫酸肼饱和液银量法、分光法银量法、分光法INaOH液硫酸肼饱和液液硫酸肼饱和液 银量法、碘量法、汞量法、分光法银量法、碘量法、汞量法、分光法第二节第二节 定量分析方法的特点定量分析方法的特点容量分析法光谱分析法 色谱分析法含量测定的表述方式 原料药：原料药的百分含量 W测定量/ W称取量100% 药物制剂：表示量的百分含量 W测定的每片主成分含量/ W标示的每片主成分含量100% W测定的每片主成分含量：实际测定时取10-20片计算平均片重、混合均匀后测定平均每片的主成分含量容量分析法容量分析法n 容量分析法：容量分析法：用已知浓度的标准溶液，滴定一定体积的待测溶液，直到化学反应完

15、全为止，到达终点，根据标准溶液的体积和浓度计算待测物质含量的方法。n 特点：简便，快速，准确度高，专属性较差（化学原料药分析）容量分析法容量分析法 滴定度滴定度每1 ml标准滴定液相当待测物的mg数。 滴定度计算滴定度计算T 待测物反应系数滴定度 待测物分子量 滴定剂浓度滴定剂反应系数容量分析法容量分析法 直接滴定法的结果计算直接滴定法的结果计算%10010(%)3WFTV含量滴定液的规定浓度滴定液的实际浓度FV为滴定液的消耗体积(ml)；T为滴定度；W为供试品的称样量(g)；103为质量换算因数(1mg等于103g)；F为滴定液的浓度校正因数。 精密称取阿司匹林0.3972g，用氢氧化钠（0

16、.1021 mol/L）滴定,消耗反应体积21.35 ml。计算每1ml标准氢氧化钠滴定液（0.1 mol/L）的滴定度，以及阿司匹林的含量。（分子式C9H8O4 分子量180.2） 取司可巴比妥钠胶囊（标示量为0.1g）20粒，除去囊壳后测得内容物总重为3.0780g，称取0.1536g，按药典规定用溴量法测定。加入溴液（0.05 mol/L） 25mL，剩余的溴液用硫代硫酸钠液（0.1025mol/L）滴定到终点时，用去17.94mL。空白试验用去硫代硫酸钠液25.00mL。按每1mL溴液（0.05mol/L）相当13.01mg的司可巴比妥钠，计算该胶囊标示量百分含量。 （注：溴与硫代硫酸

17、钠反应摩尔比（注：溴与硫代硫酸钠反应摩尔比为为1：2）光谱分析法光谱分析法 光谱分析法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性、定量分析的方法。 单色光穿过吸光物质溶液时，在一定的浓度范围内，被该物质吸收的光量与该物质溶液的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比。其关系式如下： 0lg IATE C LI= -=取标示量为25mg的盐酸氯丙嗪片20片，除去糖衣后精密称定，总重量为2.4120g，研细，精密称量片粉0.2368g，置500ml量瓶中，加盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置100ml量瓶中，加同一溶剂稀释至刻度，摇匀，在25

18、4nm波长处测得吸收度为0.435，按百分吸收系数为915计算，求其标示量百分含量？(10分) 紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法紫外-可见分光光度法用于药物含量测定的方法有三种：1 1 对照品比较法对照品比较法 分别配制供试品和对照品溶液，在规定波长处分别测定吸光度，按下式计算供试品溶液中被测组分的浓度。CX=（AX/AR）CR 2 2 吸收系数法吸收系数法 按各品种项下方法，配制供试品溶液，在规定波长处测定其吸光度，再根据吸收系数按下式计算供试品溶液的浓度。 1%1cmACEL=紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法3 3 比色法比色法 供试品本身在紫外-可见区没有强吸收，或在

19、紫外区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度，可加入适当的显色剂显色后测定 用比色法测定时，由于显色时影响的因素较多，应取供试品与对照品同时操作。除另有规定外，比色法所用的空白系指用同体积的溶剂代替对照品或供试品溶液，然后依次加入等量的试剂，并用同样方法处理，在规定的波长处测定吸光度后，按对照品比较法公式计算供试品溶液的浓度。 色谱法色谱法 色谱法（chromatography）是利用混合物不同组分在两相中具有不同的分配系数（或吸附系数、渗透性等），当两相作相对运动时，不同组分在两相中进行多次反复分配实现分离后，通过检测器检测器得以检测，进行定性定量分析。色谱系统适用性试验 系统适用性试验指用规定

20、的对照品对色谱系统进行试验和调整，应达到的要求。 在选定的色谱条件下，测定主成分或内标物色谱峰的保留时间（tR）和半峰宽（W1/2），按塔板理论公式计算色谱柱的理论板数。如果测得的理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱填充的优劣等），使理论板数达到要求。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。除另有规定外，分离度应大于1.5。 取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。 为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子是否符

21、合各种项下的规定。拖尾因子（T）以下式计算：0.05h1=2WTd除另有规定外，除另有规定外，T T 应在应在0.950.951.051.05之间。之间。第三节第三节 药品分析方法的验证药品分析方法的验证 证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求，方证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求，方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中。明中。 1、药品质量标准起草时，分析方法需经验证。、药品质量标准起草时，分析方法需经验证。2、药物合成方法变更、制剂的组分变更、原分析方法进、药物合成方法变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，分析方法需

22、经验证。行修订时，分析方法需经验证。1. 鉴别试验；鉴别试验；2. 杂质定量或限度检查；杂质定量或限度检查；3. 原料或制剂中有效成分含量测定；原料或制剂中有效成分含量测定；4. 制剂中其它成分（降解产物、防腐剂等）的测定；制剂中其它成分（降解产物、防腐剂等）的测定；5. 溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等的测试方法。的测试方法。 验证内容有：验证内容有：准确度、准确度、精密度（重复性、中间精密度和重现性）、精密度（重复性、中间精密度和重现性）、专属性专属性、检测限、检测限、定量限、定量限、线性、线性、范围和耐用性范围和耐用性 （一）（一） 准确度（准确度

23、（accuracy） 准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。考值接近的程度，用百分回收率表示。 原料药可原料药可用已知纯度的对照品或样品进行测定，用已知纯度的对照品或样品进行测定，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较定的结果进行比较。 制剂制剂可用含己知量被测物的各组分混可用含己知量被测物的各组分混合物进行测定，即采用在空白辅料中加入原料合物进行测定，即采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法。药对照品的方法。 如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中如不能得到

24、制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定。加入已知量的被测物进行测定。空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M%100AMR 已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M%100APMR 规定的范围内，至少用规定的范围内，至少用9 9次测定结果评价，如制备次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次。三个不同浓度样品各测三次。 精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差多次取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差（d）、标准偏差）、标准偏差(SD)、相对标准

25、偏差、相对标准偏差(RSD)（变异（变异系数，系数，CV）表示。）表示。 相对标准（偏）差（相对标准（偏）差（RSD），），也称变异系数（CV）%100 xSRSD 1. 重复性重复性 在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度；在规定的范围内，至少用的精密度；在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，次测定结果评价，或制备三个不同浓度样品各测三次或把被测物浓度当作或制备三个不同浓度样品各测三次或把被测物浓度当作100%，至少测，至少测6次进行评价。次进行评价。2. 中间精密度中间精密度 同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所同一实验室，

26、不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。考察随机变动因素的影响。变动因素得结果的精密度。考察随机变动因素的影响。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备为不同日期、不同分析人员、不同设备3. 重现性重现性 不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。如建立药典分析方法时通过协同检验得出重现验。如建立药典分析方法时通过协同检验得出重现性结果，协同检验的过程、重现性结果均应记载在性结果，协同检验的过程、重现性结果均应记载在起草说明中。起草说明中。 检测限系

27、指试样中被测物能被检测出的最低量。检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量。是限度试验参数，无需定量测定。是限度试验参数，无需定量测定。 指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度。常用具有一定准确度和精密度。常用% %、ppmppm、ppbppb表示。表示。 指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力。该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定

28、能力。是指该法用于复杂样品分析时相互干扰程度的度量。是指该法用于复杂样品分析时相互干扰程度的度量。 在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。正比关系的程度。 数据要求：应列出回归方程、相关系数和线性图。数据要求：应列出回归方程、相关系数和线性图。 指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。试方法适用的高低限浓度或量的区间。 指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度，指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。是衡量实验室和工作人员之间在正为常规检验提供依据。是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现性的尺度。常情况下实验结果重现性的尺度。 2. 杂质的限量检查除专属性、检测限、耐用性外，杂质的限量检查