食品微生物学第六章

1、第六章第六章 食品中的微生物及其产物的鉴定食品中的微生物及其产物的鉴定微生物检测技术：微生物检测技术：v定量：定量： 微生物数量的测定微生物数量的测定v定性定性：根据各种性状特征，对微生物：根据各种性状特征，对微生物 的种类鉴别。的种类鉴别。1 ml1 ml1 ml1ml9ml9ml9ml9ml1ml1 ml1 ml1ml1ml1mlDEFT微菌落计数微菌落计数 仅用于活细胞的检测仅用于活细胞的检测 原理：原理： 食品匀液经食品匀液经DEFT膜过滤，膜膜过滤，膜放在培养基表面，恒温培养至微菌放在培养基表面，恒温培养至微菌落长出，显微镜观察落长出，显微镜观察 G- 3h G+ 6h MPN的缺点

2、：的缺点：l需要大量的玻璃器皿（特别是需要大量的玻璃器皿（特别是5试试管实验）管实验）l不能观察微生物菌落的形态不能观察微生物菌落的形态l准确性不高准确性不高主要包括：主要包括：l 大肠埃希氏菌属大肠埃希氏菌属 （Escherichia） l 柠檬酸杆菌属柠檬酸杆菌属 （Citrobacter）l 克雷氏菌属克雷氏菌属 （Klebsiella）l 产气肠杆菌属产气肠杆菌属 （Enterobacter）非典型大肠杆菌非典型大肠杆菌典型大肠杆菌典型大肠杆菌 目前，大肠菌群已被我国和许多国家用目前，大肠菌群已被我国和许多国家用作作食品质量评价食品质量评价的指示菌。一般认为，的指示菌。一般认为，大肠菌

3、群都是直接或间接来自人与温血大肠菌群都是直接或间接来自人与温血动物的动物的粪便粪便。 3、大肠菌群检测方法与检验结果、大肠菌群检测方法与检验结果 检验结果检验结果：用每用每100mL（g）样品中）样品中 大肠菌群最近似数来表示，大肠菌群最近似数来表示， 简称大肠菌群简称大肠菌群MPN.检测方法：乳糖发酵试验、分离培养、检测方法：乳糖发酵试验、分离培养、 证实试验证实试验 见见GB4789.3-1994两种染料：两种染料：应用及优、缺点应用及优、缺点抗原（抗原（Antigen，Ag）Antigens are macromolecules that elicit an immune respons

4、e in the body. Antigens can be proteins polysaccharides conjugates of lipids with proteins (lipoproteins) and polysaccharides ( glycolipids ). Antibodies are immune system-related proteins called immunoglobulins（Ig）. Each antibody consists of four polypeptides two heavy chains and two light chains j

5、oined to form a Y shaped molecule. 抗体（抗体（Antibody，Ab）1.基因探针技术基因探针技术探针（探针（Probe）：经过）：经过标记标记的一段的一段短核苷酸短核苷酸，用于检测与之，用于检测与之同源同源的核的核苷酸序列。苷酸序列。Probe is a short labelled nucleotide used to detect homologous nucleotide sequence .Length of probe： 20-1000bpType of probe： Oligonucleotide probes （20-40 bp） Singl

6、e stranded DNA probes （200-500 bp ） Double stranded DNA probes RNA probes or Riboprobes Radioactive ：32P、35S、 3H、14C Digoxigenin （Dig） Biotin Fluorescent dyeChoice of Labelling： Non-radioactive ： 可检测的细胞数量：可检测的细胞数量： 10106 6 -10107 7 必须进行细胞富集必须进行细胞富集 ！ 探针检测的灵敏度与检测时间探针检测的灵敏度与检测时间细胞数量为细胞数量为 10108 8，检测需要

7、，检测需要10-12h 2.DNA扩增法扩增法（1）多聚酶链反应）多聚酶链反应 Polymerase Chain Reaction，PCR 1985年，美国年，美国PE-Cetus 公司人类遗传公司人类遗传学研究室的学研究室的Kary Mullis 发明发明 1993年，年，Mullis 获得诺贝尔获得诺贝尔化学奖化学奖三步曲：三步曲： 变性（变性（Denaturation） 退火（退火（Annealling） 延伸（延伸（Extension）一个循环一个循环（cycle）一般进行一般进行25-30个循环个循环PCR反应的三步曲与五要素反应的三步曲与五要素 Step 1Step 1：双链双链D

8、NADNA热变热变性（性（9494）；）；Step 2Step 2：引物与模板引物与模板单链单链DNADNA退火（退火（5555）；）；Step 3Step 3：DNADNA的聚合延的聚合延伸反应（伸反应（7272）；）；Step 4Step 4：扩增的双链扩增的双链DNADNA再次热变性（返回再次热变性（返回Step 1Step 1）。）。五要素：五要素：循环次数与产物的量循环次数与产物的量实际：实际：Nf = N0 （1 + Y）N其中其中Y Y为扩增效率为扩增效率理论：理论：Nf = N0 X 2 N 其中其中N为循环次数，为循环次数，N0为起始拷贝数，为起始拷贝数，Nf为最终拷贝数为最

9、终拷贝数Denaturing94 oCTemperature100055T i m e5335PCRDenaturing94 oCTemperature100055T i m e3553HeatDenaturing94 oCAnnealingPrimers55 oCExtension72 oCTemperature100055T i m e355355Denaturing94 oCDenaturing94 oCDenaturingng94 oCAnnealingPrimers55 oCExtension72 oCTemperature100055T i m e30 x3553HeatHeat5

10、55Denaturing94 oCDenaturing94 oCAnnealingPrimers55 oCExtension72 oCTemperature100055T i m e30 x3553555555（2）随机扩增的多态性）随机扩增的多态性DNA lDeveloped by Williams et al. (1990) using 10 base primers to generate random fragments from template DNAslRAPD fragments can be separated and used as genetic markers or a

11、 kind of DNA fingerprint Two related techniques: 1. Arbitrary Primed PCR (AP-PCR) Welsh and McClelland (1990) longer primers(18-25 bases)2. DNA Amplification Fingerprinting (DAF) Caetano-Anolles et al. (1991) very short primers (8 bases) Components of PCR and RAPD RAPD1. Buffer (Mg+) usually high Mg

12、+ concentration2. Template DNAl1 short primer (10 bases) anneals to any specific part of the template DNA4. dNTPs5. TaqlTwo modifications made to typical thermal cycling when RAPD is being done:lAnnealing temperatures are generally very low, around 36 C - This allows very short primers to anneal to

13、template DNAlMore thermal cycles are used, typically 45 - This compensates for the inefficiency which results from using such short primers.Template DNAlPrimer binds to many locations on the template DNAlOnly when primer binding sites are close and oriented in opposite direction so the primers point

14、 toward each other will amplification take placeRAPDTemplate DNAPrimers point away from each other, so amplification wont happenRAPDTemplate DNAPrimers point in the same direction, so amplification wont happenRAPDTemplate DNAPrimers too far apart, so amplification wont happen 2,000 basesRAPDTemplate

15、 DNAPrimers are just the right distance apart, so fragment is amplified100 - 1,500 basesRAPD3.限制性片段长度多态性技术限制性片段长度多态性技术（RFLP）Restriction Fragment Length Polymorphism保护细菌不受外来保护细菌不受外来DNA侵入侵入来自细菌的一种内切酶来自细菌的一种内切酶识别识别4-8 bp特定序列特定序列 (site specific)两股两股DNA上各上各产产生一生一个个切口切口回回文序列文序列 (palindrome sequence)5- GTT

16、ACATGA GATC ACGGATTC -33- CAATGTACT CTAG TGCCTAAG -5产生粘性末端产生粘性末端 (cohesive end, sticky end)5- GTTACATGAG3- CAATGTACTCTTAAEcoR I5- TTACATGC3- AATGTACG GCMsp IAATT CACGGATTC -3 GTGCCTAAG -5CG GACGGAT -3 CTGCCTA -55- GTTACATGAG3- CAATGTACTCTTAAAATT CACGGATTC 3 GTGCCTAAG -55- TTACATGC3- AATGTACG GCCG GA

17、CGGAT -3 CTGCCTA -55-ACGGATTCGTT3-TGCCTAAGCAAHpa I5- AACTGTCGG3- TTGACAGCCHae IIIAACGTTACATGA 3TTGCAATGTACT 5CCAGGCTG -3GGTCCGAC -5产生平末端产生平末端(blunt end)5-ACGGATTCGTT3-TGCCTAAGCAAAACGTTACATGA 3TTGCAATGTACT 55- AACTGTCGG3- TTGACAGCCCCAGGCTG -3GGTCCGAC -5R F LP 限 制 脢 圖 譜 多 形 性Original geneSingle base m

18、utationGene insertion/duplicationElectrophoresisprobeRestriction enzyme digestionJuang RH (2004) BCbasics一种检测有动力的沙门氏菌的方法一种检测有动力的沙门氏菌的方法优点：将血清学反应和生化增菌过程结优点：将血清学反应和生化增菌过程结 合起来，特异性强；合起来，特异性强； 不需特殊实验室条件，简便不需特殊实验室条件，简便 ； 8-14小时内得出结果，快速小时内得出结果，快速 。缺点：不能检测非运动型沙门氏菌，缺点：不能检测非运动型沙门氏菌， 免疫条带的判断有主观因素。免疫条带的判断有主观因素

19、。 Enzyme Linked Immunosorbent Assay1971年年Engvall和和Perlmann（ ELISA） can measure antibodies or antigens inexpensive, rapid, quantitative, specific sensitive (pg/ml) expensive equipment not required can be automated ELISA ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。抗原或抗体的酶标记。 结合在固相载体结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。性，又保留酶的活性。原理：原理：待测样品与固相载体表面的抗原或抗体起反待测样品与固相载体表面的抗原或抗体起反应，加入酶标记的抗原或抗体也结合在固相应，加入酶标记的抗原或抗体也结合在固相载体上。此时载体上。此时固相上的酶量与样品中受检物固相上的酶量与样品中受检物质的量呈一定的比例质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，