第四基因精细结构的遗传分析

1、第四章第四章 基因精细结构的遗传分析基因精细结构的遗传分析l基因是一个基因是一个特定的特定的dna或或rna片段，片段，但并非一段但并非一段dna或或rna都是基因。都是基因。第一节 基因的概念l一、基因概念的发展一、基因概念的发展（一）遗传（一）遗传“因子因子”：孟德尔认为，生物性状的遗：孟德尔认为，生物性状的遗传由遗传因子所控制，性状本身不遗传。传由遗传因子所控制，性状本身不遗传。（二）染色体是基因的载体：摩尔根实验证明基因（二）染色体是基因的载体：摩尔根实验证明基因位于染色体上，并呈直线排列，提出了遗传学是位于染色体上，并呈直线排列，提出了遗传学是连锁交换规律，建立了遗传的染色体学说，为

2、细连锁交换规律，建立了遗传的染色体学说，为细胞遗传学奠定了重要基础。并由此提出基因既是胞遗传学奠定了重要基础。并由此提出基因既是一个功能单位，是一个突变单位，也是一个交换一个功能单位，是一个突变单位，也是一个交换单位的单位的“三位一体三位一体”概念。概念。经典遗传学认为：基因是一个最小的单位，不经典遗传学认为：基因是一个最小的单位，不能分割；既是结构单位，又是功能单位。能分割；既是结构单位，又是功能单位。（三）（三）dna是遗传物质：是遗传物质：1928年年griffith首先发首先发现了肺炎球菌的转化，证实现了肺炎球菌的转化，证实dna是遗传物质是遗传物质而非蛋白质；而非蛋白质；avery用

3、生物化学的方法证明转用生物化学的方法证明转化因子是化因子是dna而不是其他物质。而不是其他物质。（四）基因是有功能的（四）基因是有功能的dna片段片段20世纪世纪40年代年代beadle和和tatum提出一个基因提出一个基因一个酶的假说，沟通了蛋白质合成与基因功能一个酶的假说，沟通了蛋白质合成与基因功能的研究的研究1953年年watson和和crick提出提出dna双螺旋结构双螺旋结构模型，明确了模型，明确了dna的复制方式。的复制方式。1957年年crick提出中心法则，提出中心法则，61年提出三联体遗传密年提出三联体遗传密码，从而将码，从而将dna分子结构与生物体结合起来分子结构与生物体结

4、合起来1957年年benzer用大肠杆菌用大肠杆菌t4噬菌体为材料，分析了噬菌体为材料，分析了基因内部的精细结构，提出了顺反子（基因内部的精细结构，提出了顺反子（cistor)的概念，的概念，证明基因是证明基因是dna分之上一个特定的区段，是一个功能分之上一个特定的区段，是一个功能单位，包括许多突变位点（突变子），突变位点之间单位，包括许多突变位点（突变子），突变位点之间可以发生重组（重组子）可以发生重组（重组子）v理论上，一个基因有多少对核苷酸对就有多少突变子理论上，一个基因有多少对核苷酸对就有多少突变子和的重组子，实际上，突变子数少于核苷酸对数，重和的重组子，实际上，突变子数少于核苷酸对数

5、，重组子数小于突变子数。组子数小于突变子数。总之：顺反子学说打破了总之：顺反子学说打破了“三位一体三位一体”的基因概念，把基的基因概念，把基因具体化为因具体化为dna分子上特定的一段顺序分子上特定的一段顺序- 顺反子，其内顺反子，其内部又是可分的，包含多个突变子和重组子。部又是可分的，包含多个突变子和重组子。近代基因的概念：近代基因的概念： 基因是一段有功能的基因是一段有功能的dnadna序列，是一个遗传功能单位，序列，是一个遗传功能单位，其内部存在有许多的重组子和突变子。其内部存在有许多的重组子和突变子。 突变子：指改变后可以产生突变型表型的最小单位。突变子：指改变后可以产生突变型表型的最小

6、单位。 重组子：不能由重组分开的基本单位。重组子：不能由重组分开的基本单位。l（五）操纵子模型（五）操纵子模型 1961年法国分子生物学家年法国分子生物学家jacob和和monod通过对大肠杆菌乳糖突变体研究，提出了操纵通过对大肠杆菌乳糖突变体研究，提出了操纵子学说（子学说（operon theory)。阐明了基因在乳糖。阐明了基因在乳糖利用中的作用。利用中的作用。（六）跳跃基因（转座子）和断裂基因（六）跳跃基因（转座子）和断裂基因的发现的发现 20世纪世纪50年代以前认为每一基因组的年代以前认为每一基因组的dna是固定的，而且其位置和他们的功能无关。是固定的，而且其位置和他们的功能无关。50

7、年代初芭芭拉在玉米的控制因子的研究中指出年代初芭芭拉在玉米的控制因子的研究中指出某些遗传因子可以转移位置，之后在真核生物某些遗传因子可以转移位置，之后在真核生物和原核生物中发现基因组中某些成分不固定性和原核生物中发现基因组中某些成分不固定性是普遍现象，称跳跃基因。是普遍现象，称跳跃基因。70年代后发现大多年代后发现大多真核生物基因都是不连续的，被不编码序列隔真核生物基因都是不连续的，被不编码序列隔开，称断裂基因。开，称断裂基因。二、基因的类别及其相互关系l根据基因的功能和性质，可将其分为以下几类：根据基因的功能和性质，可将其分为以下几类：l（一）结构基因（一）结构基因（structural g

8、ene)和调节基因和调节基因(regulatory gene):既可转录又可翻译。既可转录又可翻译。l（二）核糖体（二）核糖体rna基因（基因（rrna基因简称基因简称rdna）和转）和转移移rna基因（基因（trna基因简称基因简称tdna ）：只可转录不可）：只可转录不可翻译。前者专门转录翻译。前者专门转录rrna， rrna与响应蛋白质结合与响应蛋白质结合形成核糖体；后者专门转录形成核糖体；后者专门转录trna， trna作用是激活作用是激活氨基酸。氨基酸。l（三）启动子（三）启动子（promotor0和操纵基因和操纵基因(operator):既既无转录功能又无翻译功能，确切说，它们不能

9、称为基无转录功能又无翻译功能，确切说，它们不能称为基因。因。l大肠杆菌生长在无乳糖的培养基上时，每个细胞中含分解乳糖的酶，如-半乳糖苷酶的分子还不到5个，一旦加入乳糖后2-3分钟，每个细胞中的-半乳糖苷酶的含量可增加上千倍，每个细胞约含该酶分子5000个，而这时若将乳糖去掉，那么，2-3分钟后，细胞中的-半乳糖苷酶的含量又恢复到初始水平。可见，乳糖能诱导相应的酶大量合成，因此，这种底物称为诱导物诱导物（inducer），相应的酶称为诱导诱导酶酶（inducible enzyme）。 l1961年，法国分子生物学家f.jacob和j.monod通过不同的大肠杆菌乳糖代谢突变体来研究基因的作用，从

10、而提出操纵子学说（operon theory），1965年获诺贝尔奖。 l一个操纵子操纵子（operon）除了同一个转录单位的结构基因结构基因(structure gene)外，还有直接参加其转录调控的dna序列。laco ， lacp，即乳糖操纵子由5个紧密连锁，但功能不同的dna区段组成。 l(1)结构基因z ：- 半乳糖苷酶基因 酶催化 乳糖半乳糖+葡萄糖。 l(2)结构基因y ：- 半乳糖苷透性酶基因 膜结合蛋白，使乳糖进入细胞。 l(3)结构基因a ：编码- 半乳糖转乙酰基酶，该酶可将一个乙酰基从乙酰辅酶a转移至- 半 乳糖上，其在乳糖利用上的生物学意义尚不清楚。 l(4)启动基因p

11、 ：是rna多聚酶与dna结合的启始部位。(initiator) l(5)操纵基因o ：是阻遏蛋白结合的部位，它的功能象一个开关。(operator) l调节基因i 产生阻遏蛋白，调节结构基因的活性，与(1)-(5)不相邻。(regulatory gene) l调节基因i 产生阻遏蛋白，调节结构基因的活性，与(1)-(5)不相邻。(regulatory gene) l操纵基因与由它操纵的几个结构基因连锁在一起，几个结构基因由一个启动子转录成为一个mrna分子，然后翻译成几种蛋白质，这样的结构成为一个操纵子操纵子(operon)。调节基因通过产生阻遏物来调节操纵基因，进而控制结构基因的功能。这样

12、，这些基因构成了一整套基因功能的调节控制系统。 l调节基因和操纵基因都有控制结构基因的作用，它们的差别是：(1)调节基因可以调节不同染色体上的结构基因，而操纵基因则只是操纵同一染色体上的结构基因。(2)后者无基因产物。 l操纵子模型进一步丰富了基因概念。三、基因与dnal一个基因大约有一个基因大约有500-6000个核苷酸对，但并非个核苷酸对，但并非dna分子上任一含有几千个核苷酸对的区段都是分子上任一含有几千个核苷酸对的区段都是一个基因，基因是一个含有特定遗传信息的一个基因，基因是一个含有特定遗传信息的dna分子区段。分子区段。l如何判断一段核苷酸序列是否是某个基因？如何判断一段核苷酸序列是

13、否是某个基因？ 要看这个特定的核苷酸序列是否与其转录产物要看这个特定的核苷酸序列是否与其转录产物rna核苷酸序列或翻译产物多肽链的氨基酸序列核苷酸序列或翻译产物多肽链的氨基酸序列相对应，这样就必须同时测定某一段相对应，这样就必须同时测定某一段dna的核苷的核苷酸序列和相应产物的序列。酸序列和相应产物的序列。（一）基因的化学本质（一）基因的化学本质l1928年，griffith首先发现了肺炎双球菌的转化现象，1944年，o.t.avery等证实肺炎双球菌的转化因子是dna，才首次证明基因是由dna构成。 l1953年，watson和crick提出了dna的双螺旋结构模型。crick，1957年提

14、出“中心法则”，1961年，又提出“三联体密码”，从而阐明了dna的结构、复制和遗传物质如何保持世代连续的问题。l从化学本质上看基因是含有特定遗传信息的dna分子片断，每个基因平均相当于1000(500-6000)对核苷酸的特定序列。估计大肠杆菌含有10007500个基因，人的基因至少有100万个（按分子量算）。 l(1)基因的自体复制dna的复制。 l(2)基因决定性状dnamrna蛋白质。 l(3)基因突变dna核苷酸的改变。（二）基因与基因组（二）基因与基因组l基因组基因组（genome）这个名词最早出现在1922年的遗传学文件中，指的是单倍体细胞中所含有的整套染色体，所以又被译作染色体

15、组。近年来，学界更多地把genome定义为整套染色体所包含的全部基因。原核生物基因组就是原核细胞内构成染色体的一个dna分子；真核生物的核基因组是指单倍体细胞内整套染色体所含的dna分子。 l基因组测序的结果指出，基因组中不仅包含着整套基因的编码序列，同时还包含着大量非编码序列，这些序列同样包含着遗传指令。因此，基因组应该是整套染色体所包含的dna分子以及dna分子所携带的全部遗传指令。 l基因组研究的迅猛发展已形成了一个新的学科，即基基因组学因组学（genomics），这是1986年出现的述语。用以表述研究生物体基因和基因组的结构组成、不稳定性及功能性的一门学科。随后又把基因组学分成结构结构

16、基因组学基因组学和功能基因组学功能基因组学（structural genomics and functional genomics），前者研究基因和基因的结构，各种遗传元件的序列特征，基因组作图和基因定位等；后者着重研究不同的序列结构具有的不同的功能，基因表达的调控，基因和环境（包括基因与基因之间，基因与其他dna序列之间，基因与蛋白质之间）的相互作用等。 一）基因组的序列复杂性l1c值悖理：值悖理： l生物体的单倍体基因组所含dna总量称为c值。 lc值悖理值悖理：生物基因组的大小同生物在进化上所处的地位高低无关：l(1)显花植物和两栖类动物的基因组最大，软骨鱼硬骨鱼甚至昆虫和软体动物的基因

17、组都大于包括人类在内的哺乳动物的基因组。肺鱼的c值比人类高100倍。l (2)每类生物的最小基因组的大小基本上对应生物在进化上所处的地位的高低。 2序列复杂性(06d/14/4)l同一类生物中基因组大小相差悬殊，其主要差别在于多余（excess）dna量的差别。 l(1)重复序列 l基因组不同序列的总长度称为序列复杂序列复杂性性（sequence complexity）。用bp来表示。序列复杂性的高低反映了序列包括的遗传信息量的多少。l(2)外显子数目的多寡，从进化的角度看，更多的外显子有助于形成更多的外显子组合，对生物在多种环境下生存是有利的。 3. dna复性协力学l反映基因组内单一序列和

18、重复序列的组成情况。 l(1)dna的变性和复性。 l变性变性（denaturation）：:将双链dna在中性盐溶液（食盐0.18mol/l、枸橼酸钠0.018mol/l）中加热（100，10分钟）。使两条多核苷酸链互补碱基对间的氢键打开，分成两条单链。 l复性复性（renaturation）或退火退火（annealing）：变性后成为单链的dna，在适当的条件下（慢慢冷却10小时以上）又回复成双链dna。 l解链温度解链温度（melting temperature，tm）：使溶液中dna分子的50%成为单链时，所需的温度。因为dna分子中，氢键越多越稳定，所以gc含量多，解链温度高，dna

19、稳定性高。l2)复性速率（reassociation rate）与重复顺序 ldna复性速率复性速率与基因组中碱基顺序的复杂情况和重复程度有关。两种不同复杂性的dna分子，在总量相同的情况下，复杂性高的序列，复性速度慢，反之亦然。 l复性速率可以用下列公式表示 l l lc在时间t时单链dna浓度，k二级反映常数 解微分方程得： 当复性反应完成一半时，所对应的cot值定义cot1/2l可用分光光度计，在260nm波段测量光密度的变化，此外，复性速率也受到反应液中dna初始浓度的影响。因此，以未复性的单链百分数为纵轴，初始浓度（co）时间（t）为横轴，作成cot复性曲线，用来估计重复顺序和单拷贝

20、顺序的相对比例。 le.coli dna没有重复顺序。它的曲线可以看作是一条理想曲线，小牛dna的复性速率初期比e.coli 快得多。因为小牛基因组中少数基因有大量拷贝数。后期的复性速率大大低于e.coli，因为小牛基因组中单一顺序单一顺序（unique）远比e.coli复杂。 （二）基因组dna序列的分类 l1基因序列和非基因序列：基因序列和非基因序列： l(1)基因序列基因序列是指基因组里决定蛋白质（或rna产物）的dna序列。atg开始，终止密码子结束。在分析基因组序列时，当一个dna序列以atg开始，随后是一个个密码子，但还未发现其蛋白质产物，此时这种dna序列称为可可读框读框 l(2

21、)非基因序列非基因序列是基因组中除基因以外的所有dna序列，主要是两个基因间的插序列。 l2.编码序列和非编码序列：编码序列和非编码序列： l(1)编码序列编码序列是指编码rna和蛋白质的dna序列（不含内含子）。 l(2)非编码序列非编码序列包括内含子序列及居间序列的总和。 l3单一序列和重复序列单一序列和重复序列 l(1)单一序列单一序列（unique）是基因组里只出现一次的dna序列。（非基因序列中也有单一序列）， 复性时间很慢。 l(2)重复序列重复序列（repetitive）是在基因组中重复出现的dna序列。基因组内的重复序列有的是散在分布，有的是成簇存在。重复序列又可分为： la轻

22、度重复序列轻度重复序列：一般指个基因组内有2-10个拷贝。但有时2-3个拷贝的dna也被视作非重复序列，如组蛋白基因和酵母trna基因。 lb 中度重复序列中度重复序列：一般指10到几百拷贝的dna序列，复性时间以分计。通常是非编码序列，平均长度300bp，往往构成序列家族，与单一序列相隔排列，分散在基因组中。可能在基因调控中起作用。 lc高度重复序列高度重复序列：约为300bp的重复顺序，一个基因组中有几百份甚至几百万份拷贝，复性时间以秒计。既有重复几百分拷贝的基因，如rrna基因和某些trna基因，更多的则是很短的非编码序列。呈头尾衔接的串联重复串联重复序列序列（tandem repeat

23、） l按照基因组的分子量计算，哺乳动物的基因组中极大部分是重复序列。在非重复序列中，编码肽链的基因估计不超过百分之几。重复顺序是真核生物dna区别于原核生物的一个重要特征。 三）重复序列家族l重复序列家族重复序列家族(sequence family)是指一类核苷酸序列高度相似的重复序列，包括基因和基因以外的序列。 l真核生物基因组中来源相同、结构相似、功能相关的一组基因可归为一个基因家族基因家族（gene family）。但重复序列主要是基因以外的dna序列，根据其在基因组中的组织形式，可分为串联重复序列和散在重复序列串联重复序列和散在重复序列。多数来源于反转录转座子。 l1卫星卫星dna（s

24、atellite dna） ldna片段在氯化铯密度梯度离心中，按其大小在离心管内，形成不同的条带，根据荧光强度分析，可以看到在一条主带以外还有一个或多个小的卫星带，称卫星卫星dna，这种dna的gc含量较少，密度低。 卫星dna按其浮力密度的大小可以分成、四类（1.687， 1.693， 1.700g/cm3），都是由各种不同的重复序列家族组成，通常是串联重复序列。l卫星dna按其重复单元的多少可分为两类: l(1)小卫星小卫星dna(minisatellite dna)，由几百个核苷酸对的单元重复组成。（又：由11-60个bp的串联重复序列组成）。 l(2)微卫星微卫星dna（micros

25、atellite dna），由2-20bp重复成百上千次组成。（又：1-5bp） ldna指纹指纹（dna fingerprints）：利用微卫星dna的某些位置上的这种串联，成簇的重复单位数目不同，在串联重复序列两侧用限制性内切酶酶切后，就会产生重复单位数目不等的片段，具有丰富的多态性。这种多态性亦称vntr序列序列（variable number of tandem repeat可变可变串联重复序列串联重复序列）。以 vntrs中的特异序列为探针进行 southern杂交，杂交带谱具有高度的特异性。 l倒位重复序列：这是两个序列的互补拷贝在同条dna链上的反向排列，如 lgcacttcga

26、agtgc lcgtgaagcttcacg l2散在重复序列散在重复序列 l以散在方式分布于基因组内，一般都是中度重复序列。分为 l(1)短分散重复序列短分散重复序列（short inter spersed nuclear elements）sines长度在500bp以下。人类基因组中，重复拷贝数达10万以上。 l人类基因组中所有sine之间的平均距离约为2.2kb。如alu序列家族，人类基因组中约有50万-70万拷贝，平均每隔4 kb就有一个alu。一个典型的alu序列长282bp，有一个限制性内切酶alu的识别序列acct。 l(2)长散在重复序列长散在重复序列（long interspe

27、rsed nuclear elements， lines）重复序列单元长度1000bp。第二节 重组测验（06a16/4 ）l一、拟等位基因一、拟等位基因 黑腹果蝇中黑腹果蝇中wa代表杏色眼基因代表杏色眼基因,w代表白色眼基因，且都位于代表白色眼基因，且都位于x染色染色体上体上 p wa wa wy 杏色杏色 白色白色 f1 wa w wa y(杏色眼）杏色眼） f2 wa wa wa w wa y wy 若若wa 和和w为等位基为等位基因因 ，f2应该只有亲本应该只有亲本两种表型，两种表型，但在大量但在大量的的f2群体中却出现了群体中却出现了1/1000野生型红眼出野生型红眼出现，红眼不是突

28、变产现，红眼不是突变产生，因为不可能出现生，因为不可能出现如此高的频率如此高的频率为什么？l进一步研究证明：这是由于杏色眼基因和白眼基因在进一步研究证明：这是由于杏色眼基因和白眼基因在染色体上所占的位置（座位）相同，但属于不同的位染色体上所占的位置（座位）相同，但属于不同的位点，因而它们之间可以发生交换。点，因而它们之间可以发生交换。 p wa+/ wa+ +w/ y f1 wa+/ +w wa+/ y （配子）（配子） （配子）（配子） wa+ +w wa w + wa+ y f2出现出现 +/ wa+ 和和+ /y（红眼野生型）（红眼野生型）l顺反位置效应（顺反位置效应（cis-trans

29、 position effect)： lwa+/ +w两个突变分别在两条染色体上，称为两个突变分别在两条染色体上，称为反反式（式（trans)， wa w /+两个突变体同时排在一条两个突变体同时排在一条染色体上，而另一条染色体上两个位点均正常，染色体上，而另一条染色体上两个位点均正常，称为称为顺式（顺式（cis)。反式表现为突变型，顺式排列。反式表现为突变型，顺式排列为野生型，这种由于排列方式不同而表型不同的为野生型，这种由于排列方式不同而表型不同的现象成为顺反位置效应。现象成为顺反位置效应。l二、噬菌体突变型二、噬菌体突变型1、噬菌斑形态的突变型、噬菌斑形态的突变型2、寄主范围的突变型、寄

30、主范围的突变型3、条件致死突变型、条件致死突变型概念：条件致死突变（概念：条件致死突变（p101）lbenzer实验所用的实验所用的t4的的r突变就是一个条件突变就是一个条件致死突变型。（见致死突变型。（见p101表表4-1）表表4-1 4-1 野生型与几种突变型的区别野生型与几种突变型的区别类类 型型野生型野生型 ri ri rii rii riiiriii不同大肠杆菌平板上噬菌斑表型不同大肠杆菌平板上噬菌斑表型 b b 小噬菌斑小噬菌斑大噬菌斑大噬菌斑大噬菌斑大噬菌斑大噬菌斑大噬菌斑 k( k( ) )小噬菌斑小噬菌斑小噬菌斑小噬菌斑无噬菌斑（致死）无噬菌斑（致死）小噬菌斑小噬菌斑 s s

31、小噬菌斑小噬菌斑小噬菌斑小噬菌斑小噬菌斑小噬菌斑小噬菌斑小噬菌斑l三、三、 benzer的重组实验的重组实验两种两种r突变类型：突变类型：rx、r y r+rxr y r+ 混合感染混合感染e.coli b株株接种接种b株株k()株株 计数计数 r + r y、r x r+r+r+r+r+、rxry仅生长一仅生长一四种基因型四种基因型 种重组型种重组型 均能生长均能生长 r在k()株中是致死l重组值计算：重组值计算：rxry的数量与的数量与r+r+ 相同，计算时相同，计算时r+r+ 噬菌体数噬菌体数2。l此种测定方法称为重组测验（此种测定方法称为重组测验（recombination test)

32、 ，它以遗传图的方式确定突变子之间关，它以遗传图的方式确定突变子之间关系，此方法测定重组频率非常灵敏可以获得小系，此方法测定重组频率非常灵敏可以获得小到到0.001，即十万分之一的重组值。，即十万分之一的重组值。第三节 互补测验l一、互补测验的原理和方法一、互补测验的原理和方法 互补测验（顺反测验）互补测验（顺反测验）：根据功能确定等位基因的测验。：根据功能确定等位基因的测验。即根据顺式表现型和反式表现型来确定两个突变体是否即根据顺式表现型和反式表现型来确定两个突变体是否属于同一个基因（顺反子）属于同一个基因（顺反子） 彼此互补（彼此互补（complementation)：用：用 r 突变型成

33、对组突变型成对组合同时去感染大肠杆菌合同时去感染大肠杆菌k()株，若被双重感染的细菌中株，若被双重感染的细菌中产生两种亲代基因型的子代噬菌体（也有少量重组型的产生两种亲代基因型的子代噬菌体（也有少量重组型的噬菌体），那么就必定是一个突变型补偿了另一个突变噬菌体），那么就必定是一个突变型补偿了另一个突变型所不具有的功能，这两个突变型就称为彼此互补。型所不具有的功能，这两个突变型就称为彼此互补。1. 果蝇眼型遗传试验果蝇眼型遗传试验(e. b. lewis)llewis分离到果蝇染色体2末端一个位点的两个突变型：l显性星眼突变型(s)：杂合体s/+比野生型眼稍小l隐性拟星眼(ast)：纯合体ast

34、/ast眼更小l基因定位发现两个突变在同一区域，且s/ast杂合体眼型最小l几种基因型眼型表现为：+/+ s/+ ast/ast s/ast；将四种表现型分别用：a、b、c、d表示l功能和位置关系研究表明：s和ast是等位基因llewis得到一个果蝇品系：s基因两侧具有al和ho两个隐性突变标记( al s ho )，并获得杂种al s ho/+ ast +试验结果试验结果结果分析与拟等位基因结果分析与拟等位基因(psendoallele)l野生型的个体是如何产生的l研究发现回复突变频率很低，不能产生如此高频率(万分之2.8)的野生型l进一步分析发现：16个野生型个体均表现为+ + ho，表明

35、在al-ho间发生了交换l基于基因不可分性(交换只发生在基因间)，lewis认为：ls和ast是两个紧密连锁基因，而不是一对等位基因l由于它们功能相似，均控制果蝇的眼型，所以称为拟等位基因(psendoallele)l据此lewis认为野生型产生于拟等位基因s和ast间交换图示与分析图示与分析l拟等位基因假设能解释果蝇眼型遗传试验结果；同时也能解释其它研究结果，如：果蝇菱形眼突变型遗传l但拟等位基因并不能直接证明，因为即使s与ast确是拟等位基因，也难以分离它们：表型相似、紧密连锁2. t4突变型突变型(rii)遗传研究遗传研究lseymour benzer(1955)用e. coli烈性噬菌

36、体t4突变型遗传研究证明：拟等位基因的说法是不正确的lt4野生型在e. coli菌苔上产生小而不规则噬菌斑lt4突变品系按表型可分为：ri、rii、riii三类。其中rii在e. coli b上产生快速溶菌现象，形成大而圆噬菌斑，在e. coli k()上不能生长试验方法与结果试验方法与结果l试验方法：l最初得到8个不同的r突变型品系，8个突变基因均定位于t4dna的一个区段内(rii区段)l将8种突变型两两组合混和感染e. coli b菌株(双重感染, double infection)l从混和培养物中提取噬菌体颗粒感染e. coli k()l试验结果：l在菌苔上获得了许多小而粗糙的野生型噬

37、菌斑双重感染试验双重感染试验benzer benzer 以t4噬菌体为材料进行了研究工作 ，正式提出“顺反子”这个术语 riia mutant riib mutant单独感染e.coli k单独感染e.coli k混合感染e.coli k能正常生长不能正常生长不能正常生长benzer 顺反子概念和基因内重组顺反子概念和基因内重组 discovery of recombination within the gene m 1riia chromosome carring mutation 1m 2riia chromosome carring mutation 2recombination wit

38、hin the genechromosome carring mutation 1 and 2wild type benzer将两个riia突变型对b株进行混合感染，再让释放的子代噬菌体感染k株。 出现了野生型噬菌体。 野生型的产生与基因内重组野生型的产生与基因内重组l结果分析：l回复突变的频率很小，所以野生型只能由重组产生l用拟等位基因可以解释试验结果；但同时意味着：rii区段内至少存在8个拟等位基因lbenzer先后分离到400多个不同的rii突变。在rii区段内存在如此多的基因显然是不可能的l结论：l这些基因并不是所谓的拟等位基因，而就是rii区段(一个基因)突变形成的复等位基因l野生型

39、产生于基因内重组，基因是由更小的重组单位构成，从而推翻了经典遗传学基因不可分性的性质*双重感染法绘制双重感染法绘制rii区段连锁图区段连锁图l操作方法：l用两种rii突变型双重感染b品系，收集溶菌液l取等量溶菌液接种到b品系、k()品系菌苔上l考察两个品系菌苔上的噬菌斑数目，就可以计算两个突变位点间的重组值l绘制连锁遗传图l由于采用了条件致死选择系统即在e. coli k()上rii不能生长，分辨率极高，可以检测到十万分之一的重组值b品系双重感染的结果品系双重感染的结果顺反测验顺反测验 cis/trans complementation test顺反测验顺反测验 cis/trans compl

40、ementation test3. 最小的结构单位最小的结构单位l重组值检测精度可达十万分之一，但实际结果不会低于0.01%基因内存在最小重组单位l本泽尔将最小重组单位定义为重组子(recon)lrii区段存在复等位基因已经表明l基因也并非最小突变单位l基因突变的最小单位突变子(muton)l理论上讲突变子不必等于重组子。但以后研究显示：突变子和重组子都是一个核苷酸对或者碱基对(bp)。所以基因内每个碱基均可能发生突变，任意两个碱基间均能发生交换重组4. 双突变杂合体的互补作用双突变杂合体的互补作用l对于两个独立起源的、表型相似的隐性突变，如何判定是属于同一基因(功能单位)还是两个基因突变产生

41、的呢l在二倍体生物中，可以建立双突变杂合体。双突变体杂合体有两种形式：顺式(cis)和反式(trans)基因的精细结构基因的精细结构 2重组型噬菌体数 总噬菌体数 2k菌台上的噬菌斑数 b菌台上的噬菌斑数rf=100%rf=100% r106 r51 + + r106 + + r51l 顺反测验 r47 106 + + r47 + + r106 k菌株 b菌株 顺式测验 反式测验 突 变 位 点在 同 一 顺反子内 a b + a b 突 变 位 点在 不 同 的顺反子内 + a b + a b 图 5-20 顺反测验结果的图解。当顺式有功能，而反式没有功能时，突变 位点突变位点在同一顺反子内

42、；当顺式有功能，而反式也有功能时，突变 位点突变位点在不同顺反子内。 顺反测验顺反测验 cis/trans complementation testrii顺反测验顺反测验lrii区段突变的性质：lrii突变具有共同性状，按经典遗传学理论，rii区段为一个基因(功能单位)lbenzer通过顺反测验表明：l100多个rii突变型可以分为a、b两组，组间突变型间能够互补，而组内的突变型间不能互补l与rii区段连锁图对照发现：两组突变分别位于rii区段的两端：| a | b |rii的两个顺反子的两个顺反子l经典遗传学意义上的一个基因(rii区段)实际上有两个顺反子(功能单位)l基因也很可能不是遗传的

43、最小功能单位l有些基因具有一个顺反子，有些基因具有多个顺反子l在多顺反子情况下，基因是几个功能单位的复合体lbenzer提出“一个顺反子一条多肽链”若双重感染的细菌不产生子代噬菌体，那么若双重感染的细菌不产生子代噬菌体，那么这两种突变型一定有一个相同功能受到损这两种突变型一定有一个相同功能受到损伤。伤。l凡是属于凡是属于r a的突变之间不能互补的突变之间不能互补,同理凡是同理凡是属于属于r b的突变之间也不能互补的突变之间也不能互补,只有只有r a和和r b的突变之间可以互补的突变之间可以互补,即双重感染大肠即双重感染大肠杆菌杆菌k()株株后可产生子代。后可产生子代。l说明说明: r a和和r

44、 b是两个独立的功能单位是两个独立的功能单位,分分别具有不同的功能别具有不同的功能,但它们的功能又是互补的。但它们的功能又是互补的。 互补试验的原理互补试验的原理 表型表型 有无功能互补有无功能互补 结论结论 反式反式: a: a+ + b b a b a b+ + 反式反式: : a a+ + b b a b a b+ + 突变型突变型 属同一顺反子属同一顺反子野生型野生型 属不同顺反子属不同顺反子l顺反子：顺反子：不同突变之间没有互补的功能区，不同突变之间没有互补的功能区，一一个顺反子就是一个基因，就是一个基因座位，个顺反子就是一个基因，就是一个基因座位，包含多个基因位点，包含多个基因位点

45、，是遗传上的一个作用（功是遗传上的一个作用（功能）单位，但不是一个突变单位或重组单位。能）单位，但不是一个突变单位或重组单位。l 顺反试验：顺反试验：指将两个拟突变分别处于顺式和指将两个拟突变分别处于顺式和反式，根据其表型确定两个突变是否是同一基反式，根据其表型确定两个突变是否是同一基因的试验。因的试验。判断两突变是否处于同一顺反子的方法判断两突变是否处于同一顺反子的方法: : 顺式顺式 反式反式 分析结论：两突变分析结论：两突变 + +/- - + -/- + + +/- - + -/- + 表现型表现型 野生型野生型 野生型野生型 属于两个顺反子属于两个顺反子 表现型表现型 野生型野生型

46、突变型突变型 属于同一顺反子属于同一顺反子l遗传上的突变单位和重组单位是突变子遗传上的突变单位和重组单位是突变子（muton)和重组子和重组子(roecon)，突变子是基因，突变子是基因内改变后可以产生突变表型的最小单位。它只内改变后可以产生突变表型的最小单位。它只相当与一个核苷酸对，不能将其定义为一个基相当与一个核苷酸对，不能将其定义为一个基因。重组子是基因内不能有重组分开的遗传单因。重组子是基因内不能有重组分开的遗传单位，也不能将其定义为一个基因。位，也不能将其定义为一个基因。l所以：所以：基因可分，可分为很多突变子和重组子。基因可分，可分为很多突变子和重组子。l三、三、 基因内互补基因内

47、互补1 1、 基因内互补的机理基因内互补的机理2 2、 基因内互补与基因间互补的区别基因内互补与基因间互补的区别基因间互补基因间互补基因内互补基因内互补发生机率发生机率普遍存在普遍存在仅少数能发生仅少数能发生缺失突变缺失突变能发生互补能发生互补不能发生不能发生酶活性酶活性同野生型一样同野生型一样明显低于野生型（仅明显低于野生型（仅25%）第四节第四节 缺失作图缺失作图l一、点突变和缺失突变（point mutation） lbenzer在研究r突变型中发现其中一些突变是由于核苷酸对的改变，称为点突变点突变。而另一些突变是由于缺失了相邻的许多核苷酸，因此称为缺失突变缺失突变。尽管r区这两种突变形

48、成相同的表现型效应，它们的区别 ： l (1)点突变是单个位点的突变，缺失突变是多个位点的突变。 l (2)点突变可以发生回复突变，缺失突变是不可逆的。 l (3)不同点突变之间可以发生重组，同一区段内的缺失突变不能发生重组。l二、缺失作图：二、缺失作图：benzer根据这一原理很方便地把数根据这一原理很方便地把数千个独立的千个独立的r突变定位在突变定位在r遗传图上更小的区段内，遗传图上更小的区段内，此方法称缺失作图。此方法称缺失作图。l凡是能和某一缺失突变进行重组的，他的位置一定不凡是能和某一缺失突变进行重组的，他的位置一定不在缺失范围内，凡是不能重组的，它的位置一定在缺在缺失范围内，凡是不

49、能重组的，它的位置一定在缺失范围内。失范围内。 缺失缺失 1 缺失缺失 2 a b c 细线表示缺失区，二者分别与各种突变体杂交，缺失细线表示缺失区，二者分别与各种突变体杂交，缺失2只有与只有与a区中区中突变体杂交才能产生野生型重组体，缺失突变体杂交才能产生野生型重组体，缺失1只有与只有与 c区突变体杂交区突变体杂交才能产生野生型重组体，但才能产生野生型重组体，但2个缺失与个缺失与b区的突变体杂交均不能产区的突变体杂交均不能产生野生型重组体。生野生型重组体。deletion mappingdeletion mapping1. benzer 最终在rii定位了3000个以上的突变位点。 a. 某

50、些突变体不会发生恢复突变，与不能与rii区段上的突变位点发生重组产生 r+ 噬菌体，这些突变体为缺失突变体。 (figure 18.19). b. 对每个未知rii 突变体与七个标准缺失突变体进行系统杂交，可将突变体确定在rii的七个主要区域。i.点突变位点与其所在区域的缺失亲本杂交不会产生重组体；ii. 不生产重组体，同时指明了点突变所在的位置。c. 点突变的位置强度后，可以同一系列更小的缺失体杂交，确定更精确的位点。fig. 18.19 benzers experiment: segmental subdivision of the rii region of phage t4 by me

51、ans of deletion七个标准缺失体更小的缺失体(47个)更精细的缺失体（30000多个）2.将 rii 区域进一步分为47个区段 (figure 18.20). a.任何 rii上的点突变都可通过与系列三级缺失体的杂交确定其精确的位点； b.定位后的位置更为精确。3. benzer用 3,000多个突变体将 rii区域分为可重组的 300多个位点，区域中的某些位点具有独立的高突变率。 (figure 18.21). fig. 18.20 map of deletions used to divide the rii region into 47 small segmentsfig.

52、18.21 fine-structure map of the rii region derived from benzers experiments 它比重组作图简便而精确，因为重组作图工作量大，为了确定一个新突变的位置，往往要进行大量杂交分析。 缺失作图必须有一组重复缺失突变系重复缺失突变系作为工具，把所要测定的突变型和这一系列缺失突变型分别进行重组试验。 l三、缺失作图方法简介 l0.5ml大肠杆菌b培养物中加入1滴缺失型噬菌体和一滴待测的r突变体，几分钟后，取一滴加在灭菌的纸条上，铺在长有大肠杆菌k（）菌株的平板上。如覆盖区域有噬菌斑产生说明有重组发生。空白对照出现几个噬菌斑是点突变的

53、回复突变所致。（10-3%）。 l第一步第一步是将待测的突变型与图4-7最上方的7个“大缺失”突变型分别进行杂交以确定这一突变位点所属的大范围。 l第二步第二步将待突变型进一步与有关的“小缺失”突变型进行杂交，以缩小这一突变位点所属的范围。如r548，在a5中，第二步a5中的a，b，c1，c2，或d。 第五节 断裂基因与重叠基因(06a)l一、外显子与内含子一、外显子与内含子l1977年法国的年法国的chambon等和等和berget等首次报道基因内部有间等首次报道基因内部有间隔顺序（隔顺序（spacer sequence)，并，并由此提出断裂基因（由此提出断裂基因（split gene）的概

54、念。在成熟的概念。在成熟mrna上反映出上反映出的的dna区段，即区段，即dna序列中被转序列中被转录成为录成为mrna的片段称为外显子的片段称为外显子（exon或或extron)在成熟在成熟mrna上上未反映出的未反映出的dna区段称为内含子区段称为内含子(intron)l二、断裂基因的意义二、断裂基因的意义l1、有利于储存较多的信息，增加信息量；、有利于储存较多的信息，增加信息量；l2、有利于变异和进化；、有利于变异和进化；l3、增加重组机率；、增加重组机率；l4、可能是基因调控装置、可能是基因调控装置 l三、重叠基因三、重叠基因l1978年英国剑桥大学分子生物学年英国剑桥大学分子生物学s

55、arger分析了分析了 x174dna全序列后，发现它的核苷酸实际数比全序列后，发现它的核苷酸实际数比理论数少理论数少614个氨基酸。个氨基酸。 同实验室的同实验室的barrell等发现其基因组中有些密码是等发现其基因组中有些密码是重叠的，从而形成重叠基因。重叠的，从而形成重叠基因。l重叠基因的几种重叠基因的几种重叠方式：重叠方式：l1、大基因内包、大基因内包含小基因含小基因l2、前后两个基、前后两个基因首尾重叠因首尾重叠l3、三个基因之、三个基因之间三重重叠间三重重叠l4、反向重叠、反向重叠l5、重叠操纵子、重叠操纵子l普遍认为：普遍认为：重叠基因不仅是能经济和有效的利重叠基因不仅是能经济和

56、有效的利用用dna遗传信息量，节约碱基，而且更重要遗传信息量，节约碱基，而且更重要的是便于对基因表达起调控作用。如色氨酸操的是便于对基因表达起调控作用。如色氨酸操纵子中纵子中trpd基因的翻译依赖与上游基因基因的翻译依赖与上游基因trpe的的翻译，原因是翻译，原因是trpe的终止密码子与的终止密码子与trpd的起始的起始密码子重叠。密码子重叠。第六节 基因的功能l一、一、garrod的先天性代谢缺陷的先天性代谢缺陷 二十世纪初，英国医生二十世纪初，英国医生garrod首先发现人类中几种首先发现人类中几种先天性代谢缺陷疾病，如苯丙酮尿症（先天性代谢缺陷疾病，如苯丙酮尿症（pku），它由常），它由

57、常染色体隐性基因决定。这是因为这种隐性基因不能产生染色体隐性基因决定。这是因为这种隐性基因不能产生苯丙氨酸羟化酶，因而不能把提内多余的苯丙氨酸转化苯丙氨酸羟化酶，因而不能把提内多余的苯丙氨酸转化为酪氨酸，因此血液中的苯丙氨酸积累起来，只能通过为酪氨酸，因此血液中的苯丙氨酸积累起来，只能通过苯丙氨酸转移酶的作用，从另一代谢途径转变成有毒的苯丙氨酸转移酶的作用，从另一代谢途径转变成有毒的苯丙酮酸，苯丙酮酸从尿液中排除，可通过尿检而确诊，苯丙酮酸，苯丙酮酸从尿液中排除，可通过尿检而确诊，所以称为苯丙酮尿症。所以称为苯丙酮尿症。l19081908年，年，garrod agarrod a在皇家伦敦医学院

58、发表了题为在皇家伦敦医学院发表了题为“先先天性代谢缺陷天性代谢缺陷”的著名报告，他公布了四种人类罕见的著名报告，他公布了四种人类罕见疾病：疾病： 尿黑酸尿症尿黑酸尿症 戊糖尿症戊糖尿症 胱氨酸尿症胱氨酸尿症 白化病白化病 garrod garrod 对对尿黑酸尿症尿黑酸尿症的开拓性的研究开辟了生化遗的开拓性的研究开辟了生化遗传学这一领域传学这一领域一、“先天代谢缺陷”概念提出 尿黑酸尿症l临床特征临床特征：黑尿、大关节、脊柱椎间盘：黑尿、大关节、脊柱椎间盘 退行性关节炎退行性关节炎褐黄病。褐黄病。 上腭出现兰色或黑色的色素斑，上腭出现兰色或黑色的色素斑， 眼巩膜、肋软骨出现黑色沉淀眼巩膜、肋软

59、骨出现黑色沉淀（内源性尿黑酸自身氧化形成的产物沉淀所致（内源性尿黑酸自身氧化形成的产物沉淀所致）临床症状新生儿和儿童期：新生儿和儿童期： 尿黑酸尿是唯一的特点；尿黑酸尿是唯一的特点；成人期：成人期： 除了尿黑酸尿以外，由于尿黑酸增多，并在除了尿黑酸尿以外，由于尿黑酸增多，并在结缔组织中沉着，而导致褐黄病（结缔组织中沉着，而导致褐黄病（ochronosisochronosis），如），如果累及关节的话则进展为褐黄病性关节炎果累及关节的话则进展为褐黄病性关节炎（ochronotic arthritisochronotic arthritis）。）。推测病因 代谢代谢 转化转化正常人：正常人：苯丙苯

60、丙aa、色、色aa尿黑酸尿黑酸 另一代谢产物另一代谢产物 不蓄积不蓄积尿黑酸患者：尿黑酸患者：苯丙苯丙aa、色、色aa 尿黑酸尿黑酸/另一代谢产物另一代谢产物 大量贮积，尿中排出大量贮积，尿中排出实验分析 尿黑酸患者尿黑酸患者 服食尿黑酸服食尿黑酸尿中定尿中定 量排出量排出 高蛋白饮食（含苯丙高蛋白饮食（含苯丙aa、 色色aa）内源性尿黑酸内源性尿黑酸 受试者受试者 正常人正常人 服食尿黑酸服食尿黑酸不排出不排出 高蛋白饮食（含苯高蛋白饮食（含苯aa、 色色aa）无尿黑酸检出无尿黑酸检出证实病因尿黑酸氧化酶 缺乏l 假设假设5050年后被证实：患者的肝脏中检测不到尿黑年后被证实：患者的肝脏中检