分子生物学课件之DNA复制

1、第三章：第三章：DNA复制复制 （DNA Replication）第一节：第一节： DNA 复制的基本原则复制的基本原则一、一、 Semiconservative Replication of Double-Strand DNA概概 念念 在复制过程中首先两条亲本链之间的氢键断裂在复制过程中首先两条亲本链之间的氢键断裂, ,双链分开，然后以每条亲本链（双链分开，然后以每条亲本链（parental strandparental strand）为模板，按碱基互补配对原则为模板，按碱基互补配对原则( (A:TA:T，G:C)G:C)，由由DNADNA聚聚合酶催化合成新的互补子链（合酶催化合成新的互补

2、子链（daughter stranddaughter strand）。）。复制结束后，每个子代复制结束后，每个子代DNADNA的一条链来自亲代的一条链来自亲代DNADNA，另一条链则是新合成的另一条链则是新合成的, ,并且，新形成的两个并且，新形成的两个DNADNA分分子与原来的子与原来的DNADNA分子的碱基序列完全相同。这种复制分子的碱基序列完全相同。这种复制方 式 称 为 半 保 留 复 制方 式 称 为 半 保 留 复 制 ( ( s e m i c o n s e r v a t i o ns e m i c o n s e r v a t i o n replication)rep

3、lication)。 DNA DNA合成的底物是脱氧核苷合成的底物是脱氧核苷55三磷酸（三磷酸（dNTPdNTP）：）：dATPdATP，dGTPdGTP，dCTPdCTP和和dTTPdTTP。复制的机制涉及到生长复制的机制涉及到生长链的链的33OHOH对与模板上的碱基互补的对与模板上的碱基互补的dNTPdNTP的的磷磷酸基团进行亲核进攻，释放出焦磷酸。聚合反应所酸基团进行亲核进攻，释放出焦磷酸。聚合反应所需的能量来源于需的能量来源于dNTPdNTP和焦磷酸的水解。和焦磷酸的水解。 二、二、DNADNA复制的化学复制的化学三、复制起点与复制子三、复制起点与复制子Replicon： 作为一个单位

4、进行复制的任何一段作为一个单位进行复制的任何一段DNADNA序列。序列。 它含有一个复制起点，有时还含有一个复制它含有一个复制起点，有时还含有一个复制终点。终点。Origin ：是复制子起始复制的一段是复制子起始复制的一段DNADNA序列。序列。 作为一个单位进行复制的任何一段作为一个单位进行复制的任何一段DNADNA序列。序列。 复复制子的复制通常从一个固定的位点开始的，这种起制子的复制通常从一个固定的位点开始的，这种起始始DNADNA复制的序列叫做复制起点。复制的序列叫做复制起点。DNADNA复制时，双螺复制时，双螺旋的两条链在复制起点处分开形成两条模板链。一旋的两条链在复制起点处分开形成

5、两条模板链。一旦复制开始，就会在旦复制开始，就会在DNADNA分子上形成两个复制叉分子上形成两个复制叉（replication forkreplication fork）。复制叉向着未复制的它们）。复制叉向着未复制的它们沿着沿着DNADNA相向移动，因此复制是双向的。所有的原核相向移动，因此复制是双向的。所有的原核生物的染色体，很多噬菌体和病毒的生物的染色体，很多噬菌体和病毒的DNADNA分子是环状分子是环状的，它们作为单个复制子完成复制。的，它们作为单个复制子完成复制。 真核生物染色体的线状真核生物染色体的线状DNADNA则含有多个复制子，每一则含有多个复制子，每一个复制子都有自己的复制起点

6、。一个典型的哺乳动个复制子都有自己的复制起点。一个典型的哺乳动物细胞有物细胞有50 00050 000100 000100 000个复制子，复制子的长个复制子，复制子的长度为度为4040200 200 KbKb。正在复制的真核生物基因组正在复制的真核生物基因组DNADNA分子上，会形成许多复制泡。随着复制叉沿着分子上，会形成许多复制泡。随着复制叉沿着DNADNA分分子向两个方向移动，复制泡不断变大，最终，两个子向两个方向移动，复制泡不断变大，最终，两个相邻复制泡的复制叉会相遇、融合，完成相邻复制泡的复制叉会相遇、融合，完成DNADNA的复制。的复制。 四、四、DNADNA的半不连续复制的半不连

7、续复制 在复制叉处，在复制叉处，DNADNA的两条链都作为模板同时合成两的两条链都作为模板同时合成两条新链。条新链。DNADNA分子的两条链是反向平行的，而分子的两条链是反向平行的，而DNADNA复制复制时无论以那条链做模板，新合成的链是按时无论以那条链做模板，新合成的链是按5353方方向进行的，所以只有一条模板链指导合成的新生链能向进行的，所以只有一条模板链指导合成的新生链能够沿着复制叉运动的方向连续复制，此新合成的链称够沿着复制叉运动的方向连续复制，此新合成的链称为前导链（为前导链（leading strandleading strand）。另一条模板链指导合）。另一条模板链指导合成的新生

8、链也是沿成的新生链也是沿5353方向进行，但与复制叉前方向进行，但与复制叉前进的方向相反，是分段合成的，这些片断于进的方向相反，是分段合成的，这些片断于19691969年首年首先在大肠杆菌中分离出来，被称为冈崎片段。先在大肠杆菌中分离出来，被称为冈崎片段。 在细菌中冈崎片段长约在细菌中冈崎片段长约100010002000 2000 核苷酸，但在核苷酸，但在真核生物中，相应片断的长度可能短得多，由真核生物中，相应片断的长度可能短得多，由100100400400个核苷酸组成。合成的片段即为冈崎片段。个核苷酸组成。合成的片段即为冈崎片段。这些冈崎片段以后由这些冈崎片段以后由DNADNA连接酶连成完整

9、的连接酶连成完整的DNADNA链，链，因此冈崎片段是因此冈崎片段是DNADNA复制中短暂的中间产物。这条复制中短暂的中间产物。这条链不连续合成的链称为滞后链链不连续合成的链称为滞后链(lagging strand) (lagging strand) 。这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界是普遍存在的，称为物界是普遍存在的，称为DNADNA合成的半不连续复制。合成的半不连续复制。 One strand replicated as continuous segment五、五、RNARNA引导引导 目前已知的目前已知的DNADNA聚合酶都只能延

10、伸已经存在的聚合酶都只能延伸已经存在的DNADNA链，而不能从头启动链，而不能从头启动DNADNA链的合成，这是因为它在合链的合成，这是因为它在合成成DNADNA时需要一个自由的时需要一个自由的3 OH3 OH。那么一个新的。那么一个新的DNADNA链的合成是如何开始的呢？研究发现，链的合成是如何开始的呢？研究发现，DNADNA复制时还复制时还需要另外一种酶来合成一段需要另外一种酶来合成一段RNARNA作为合成作为合成DNADNA的引物。的引物。在细菌中，引物合成依靠引物酶（在细菌中，引物合成依靠引物酶（primaseprimase），它是），它是一种与转录酶不相关的一种与转录酶不相关的RNA

11、RNA聚合酶。聚合酶。引物酶不需要用特异引物酶不需要用特异DNADNA序列来起始序列来起始RNARNA引物的合成，引物的合成，被激活后，即用最新暴露的后随链模板合成被激活后，即用最新暴露的后随链模板合成RNARNA引物。引物。每个引物的长约每个引物的长约5 5个核苷酸。一旦引物合成就由个核苷酸。一旦引物合成就由DNADNA聚聚合酶合酶IIIIII继续链的合成。在真核细胞中，引物酶由继续链的合成。在真核细胞中，引物酶由DNADNA聚合酶聚合酶的最小的亚基担任。前导链的合成只需要在的最小的亚基担任。前导链的合成只需要在复制起点引发一次，因为一旦引物合成，前导链就可复制起点引发一次，因为一旦引物合成

12、，前导链就可以连续复制直至结束。对后随链来说，引物的合成是以连续复制直至结束。对后随链来说，引物的合成是个重复的过程，因为每开始合成一个新的冈崎片断就个重复的过程，因为每开始合成一个新的冈崎片断就需要一段引物。需要一段引物。 第二节：细菌第二节：细菌DNADNA复制复制一、复制的起始一、复制的起始1. 1. 大肠杆菌的复制起点（大肠杆菌的复制起点（OriCOriC） 大肠杆菌的复制起点称为大肠杆菌的复制起点称为OriCOriC。 将大肠杆菌的染将大肠杆菌的染色体随机断裂后插入到缺乏复制起点的质粒中，由色体随机断裂后插入到缺乏复制起点的质粒中，由于质粒上含有选择标记，凡能存活的克隆，质粒中于质粒

13、上含有选择标记，凡能存活的克隆，质粒中都含有一段控制都含有一段控制DNADNA复制的序列。通过缺失分析鉴定复制的序列。通过缺失分析鉴定出大肠杆菌的复制起点约有出大肠杆菌的复制起点约有240 240 bpbp组成。组成。 该序列含有两个短的重复基序，两个基序的长度分该序列含有两个短的重复基序，两个基序的长度分别为别为9 9 bpbp和和13 13 bpbp。9 9 bpbp基序共有基序共有4 4个拷贝，分散于个拷贝，分散于整个整个OriCOriC的范围内，它是的范围内，它是DnaADnaA蛋白的结合位点。通蛋白的结合位点。通过过DnaADnaA蛋白与蛋白与OriCOriC的相互作用以及的相互作用

14、以及DnaADnaA蛋白之间的蛋白之间的相互作用，大约相互作用，大约3030个个DnaADnaA蛋白结合在复制起始区。蛋白结合在复制起始区。这种结合只能发生在负超螺旋这种结合只能发生在负超螺旋DNADNA分子上，而负超螺分子上，而负超螺旋是大肠杆菌染色体的正常存在状态。旋是大肠杆菌染色体的正常存在状态。 DNADNA分子在分子在DnaADnaA蛋白复合体上的缠绕，导致双螺旋蛋白复合体上的缠绕，导致双螺旋在串连排列的在串连排列的3 3个富含个富含ATAT的的13 13 bpbp基序处解开。一般基序处解开。一般认为螺旋解开是由于认为螺旋解开是由于DNADNA双螺旋在双螺旋在DnaADnaA蛋白复合

15、体蛋白复合体上缠绕后产生的扭转张力的结果。上缠绕后产生的扭转张力的结果。 DNA DNA双螺旋的进一步打开需要双螺旋的进一步打开需要DnaBDnaB蛋白。蛋白。DnaBDnaB蛋白蛋白是解旋酶（是解旋酶（HelicaseHelicase），其作用是解开），其作用是解开DNADNA双链。两个双链。两个DnaBDnaB蛋白在复制起点处分别与两条单链结合，并按蛋白在复制起点处分别与两条单链结合，并按5353相向而行打开相向而行打开DNADNA双链。在复制起点处双链。在复制起点处DNADNA双双链打开以后，链打开以后，DnaADnaA蛋白便会募集由蛋白便会募集由6 6个个DnaBDnaB和和6 6个个

16、DnaCDnaC构成的复合体与起始位点处的单链构成的复合体与起始位点处的单链DNADNA结合。结合。DnaCDnaC为为DnaBDnaB蛋白装载因子，依靠蛋白装载因子，依靠DnaCDnaC蛋白的单链蛋白的单链DNADNA结合域以结合域以及与及与DnaADnaA蛋白的相互作用，蛋白的相互作用，DnaBDnaB和和DnaCDnaC蛋白复合体结蛋白复合体结合在复制起始位点。合在复制起始位点。 Helicase (DnaB) continues to separate strands然后，然后，DnaCDnaC催化催化DnaBDnaB蛋白解环，并套在单链蛋白解环，并套在单链DNADNA上。上。在在Dn

17、aBDnaB和和DnaCDnaC蛋白复合体中，蛋白复合体中，DNADNA解旋酶保持非活性解旋酶保持非活性状态。状态。DNADNA解旋酶的安装导致装载因子从复合体中释解旋酶的安装导致装载因子从复合体中释放出来，并激活放出来，并激活DNADNA解旋酶。解旋酶。DNADNA解旋酶向前运动，在解旋酶向前运动，在其身后留下单链其身后留下单链DNADNA模板。模板。接着单链结合蛋白（接着单链结合蛋白（single-stranded binding single-stranded binding protein, SSBprotein, SSB）与解旋酶解开的单链结合，其作用）与解旋酶解开的单链结合，其作用

18、是防止单链降解，阻止单链退火。是防止单链降解，阻止单链退火。SSBSSB蛋白与单链蛋白与单链DNADNA的结合有协同效应的结合有协同效应(cooperative)(cooperative)，即一个，即一个SSBSSB的的结合会促进另一个结合会促进另一个SSBSSB与单链与单链DNADNA的结合。这种协同的结合。这种协同结合使单链结合使单链DNADNA被解旋酶释放出后，很快被被解旋酶释放出后，很快被SSBSSB所覆所覆盖。一旦被盖。一旦被SSBSSB覆盖，单链覆盖，单链DNADNA即处于伸直状态，有即处于伸直状态，有利于其作为模板进行利于其作为模板进行DNADNA合成或合成或RNARNA引物的合

19、成。引物的合成。 在大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞中，DNADNA解旋酶募集一个引物酶。解旋酶募集一个引物酶。引物酶负责合成一段短的引物酶负责合成一段短的RNARNA引物。引物。二、二、 Elongation 一旦复制起始，复制叉就沿着一旦复制起始，复制叉就沿着DNADNA分子前进，合成分子前进，合成与亲本链互补的两条新与亲本链互补的两条新DNADNA链。新生链的合成由链。新生链的合成由DNADNA聚合酶催化完成。从大肠杆菌细胞中分离出了聚合酶催化完成。从大肠杆菌细胞中分离出了5 5种种DNADNA聚合酶。聚合酶。DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII是大肠杆菌是大肠杆菌DNADNA复制中链复制

20、中链延伸反应的主要聚合酶。延伸反应的主要聚合酶。DNADNA聚合酶聚合酶I I专门用于专门用于RNARNA引引物的去处。另外物的去处。另外3 3种种DNADNA聚合酶主要参与聚合酶主要参与DNADNA修复和跨修复和跨损伤合成。损伤合成。1 1DNADNA聚合酶聚合酶I I DNA DNA polpol I I由一条多肽链组成，分子量为由一条多肽链组成，分子量为109 KD109 KD。酶分子中含有一个酶分子中含有一个ZnZn2 2，是聚合酶活性必需的。用枯，是聚合酶活性必需的。用枯草杆菌蛋白酶可将此酶水解成两个片段，大片段的分草杆菌蛋白酶可将此酶水解成两个片段，大片段的分子量为子量为76 KD

21、76 KD，通常称为，通常称为klenowklenow片段，小片段为片段，小片段为34KD34KD。大小片段具有不同的酶活性。大小片段具有不同的酶活性。1. easily cleaved into two fragments by proteinase:a. large fragment (Klenow fragment) contains polymerase and 3-5 exonuclease (proofreading domain). Used in vitro for synthesis reactions (DNA sequencing). E. coli DNA pol I

22、(polA)NCC（1 1）DNADNA聚合酶的聚合酶的5353聚合活性聚合活性 这是这是DNADNA聚合酶最主要的活性，按模板聚合酶最主要的活性，按模板DNADNA上的核上的核苷酸顺序，将互补的苷酸顺序，将互补的dNTPdNTP逐个加到引物逐个加到引物RNA3-OHRNA3-OH末端，即促进末端，即促进3-OH3-OH与与dNTPdNTP的的5-PO5-PO4 4形成磷酸二酯键，形成磷酸二酯键，酶的专一性表现为新进入的酶的专一性表现为新进入的dNTPdNTP必须与模板必须与模板DNADNA碱碱基配对时才有催化作用，基配对时才有催化作用，5353聚合活性存在于聚合活性存在于klenowklen

23、ow片段上。片段上。 DNADNA聚合酶聚合酶I I的延伸能力不强，每的延伸能力不强，每次与模板引物结合仅能添加次与模板引物结合仅能添加2020100100个核苷酸。个核苷酸。 （2 2）DNADNA聚合酶的聚合酶的3535外切核酸酶外切核酸酶（exonucleaseexonuclease) )活性活性 这种酶活性的主要功能是从这种酶活性的主要功能是从3 53 5方向识别方向识别并切除并切除DNADNA生长链末端与模板生长链末端与模板DNADNA不配对的核苷酸，不配对的核苷酸，这种功能称为校对功能（这种功能称为校对功能（proofreadingproofreading），），这是保这是保证其聚

24、合作用的正确性不可缺少的，因此对于维持证其聚合作用的正确性不可缺少的，因此对于维持DNADNA复制的真实性（复制的真实性（replicationalreplicational fidelity fidelity）至至关重要。关重要。 Proofreading by DNA polymerase(3)(3)DNADNA聚合酶的聚合酶的5353外切核酸酶活性外切核酸酶活性 这种酶活性是从这种酶活性是从DNADNA链的链的55端向端向33末端水解已末端水解已配对的核苷酸，本质是切断磷酸二酯键，每次能切配对的核苷酸，本质是切断磷酸二酯键，每次能切除除1010个核苷酸。因此，这种酶活性在个核苷酸。因此，

25、这种酶活性在DNADNA损伤的修损伤的修复中可能起重要作用，对完成的复中可能起重要作用，对完成的DNADNA片段去除片段去除55端端的的RNARNA引物也是必须的。引物也是必须的。 DNA DNA polpol的的5353聚合活性和聚合活性和5353外切酶活外切酶活性协同作用，可以使性协同作用，可以使DNADNA一条链上的切口从一条链上的切口从5353方向移动，这种反应叫做缺刻平移方向移动，这种反应叫做缺刻平移(nick (nick translation) translation) 2. DNA Polymerase III (DNA聚合酶聚合酶 III） DNADNA聚合酶聚合酶IIIII

26、I由由1010个不同的亚基构成。其中个不同的亚基构成。其中、和和亚基构成核心酶。亚基构成核心酶。亚基具有亚基具有53 53 聚合酶活聚合酶活性，性，亚基具有亚基具有3535外切活性，外切活性，亚基功能尚不清亚基功能尚不清楚，可能仅仅起结构上的作用，使两个核心亚基以及楚，可能仅仅起结构上的作用，使两个核心亚基以及其他各辅助亚基装备在一起。其他各辅助亚基装备在一起。DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII具有两个具有两个拷贝的核心酶。拷贝的核心酶。 (Note: no beta subunits are shown; without beta, this form of the complex is

27、called DNA pol III*) 两个拷贝的两个拷贝的亚基围绕亚基围绕DNADNA双螺旋形成一个环状的二双螺旋形成一个环状的二聚体。一旦聚体。一旦亚基二聚体与亚基二聚体与DNADNA紧密结合，它的作用紧密结合，它的作用就像一个就像一个“滑动夹子滑动夹子”(sliding clamp)(sliding clamp)携带着核心携带着核心聚合酶沿着聚合酶沿着DNADNA链自由滑动。这样，聚合酶的活性位链自由滑动。这样，聚合酶的活性位点就可以一直定位在生长中的复制叉附近。另一方点就可以一直定位在生长中的复制叉附近。另一方面，核心酶与滑动夹结合后，其延伸能力也显著提面，核心酶与滑动夹结合后，其延

28、伸能力也显著提高。高。DNADNA聚合酶的延伸能力（聚合酶的延伸能力（processivityprocessivity）定义为）定义为每次聚合酶与模板引物结合时所能添加的核苷酸每次聚合酶与模板引物结合时所能添加的核苷酸的平均数。与滑动夹的结合是如何改变的平均数。与滑动夹的结合是如何改变DNADNA聚合酶的聚合酶的延伸能力的呢？在无滑动夹的情况下，延伸能力的呢？在无滑动夹的情况下，DNADNA聚合酶平聚合酶平均每合成均每合成2020100100个核苷酸就从个核苷酸就从DNADNA模板上脱落下来。模板上脱落下来。 Beta forms a donut shaped ring around the

29、DNA and helps to anchor the holoenzyme to the DNA during replication . By acting as a sliding clamp, beta helps the holoenzyme to replicate long stretches of DNA without falling off the strand (this is called processivity). 但是，滑动夹可以阻止聚合酶脱落，从而大大增加但是，滑动夹可以阻止聚合酶脱落，从而大大增加了了DNADNA聚合酶的延伸能力。聚合酶的第聚合酶的延伸能力。聚

30、合酶的第3 3个组成部分个组成部分是由是由5 5个亚基构成的一个所谓的个亚基构成的一个所谓的复合体。复合体。复合体复合体又称夹子装载因子（又称夹子装载因子（clamp loaderclamp loader），催化滑动夹），催化滑动夹打开，并将其结合在引物模板上。介导打开，并将其结合在引物模板上。介导亚基与亚基与模板引物双螺旋的结合。最后，两个拷贝的模板引物双螺旋的结合。最后，两个拷贝的亚亚基使核心聚合酶形成二聚体。基使核心聚合酶形成二聚体。 (Note: no beta subunits are shown; without beta, this form of the complex is

31、called DNA pol III*)The subunits of E. coli DNA polymerase IIISubunit Functiona ae eq qt tb bg gd dd dc cy y5 to 3 polymerizing activity3 to 5 exonuclease activitya a and e e assembly (scaffold)Assembly of holoenzyme on DNASliding clamp = processivity factorClamp-loading complexClamp-loading complex

32、Clamp-loading complexClamp-loading complexClamp-loading complexCoreEnzymedimerHoloenzyme3 3在复制叉处先导链和后随链的合成同时进行在复制叉处先导链和后随链的合成同时进行 RNA RNA引物合成以后，引物合成以后，DNADNA的延伸过程便开始了。先的延伸过程便开始了。先导链被连续合成，而后随链是不连续合成的。在复导链被连续合成，而后随链是不连续合成的。在复制叉上，制叉上，DNADNA解旋酶在后随链模板上沿着解旋酶在后随链模板上沿着5353运动。运动。DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII全酶通过全酶通过亚基和

33、解旋酶相互作用，亚基和解旋酶相互作用，两个两个亚基分别与一个核心酶结合，其中一个核心亚基分别与一个核心酶结合，其中一个核心酶复制前导链，另一个核心酶复制后随链。酶复制前导链，另一个核心酶复制后随链。 DNADNA引物酶周期性地与引物酶周期性地与DNADNA解旋酶结合，并在后随链解旋酶结合，并在后随链模板上合成新的引物。当负责后随链合成的核心酶模板上合成新的引物。当负责后随链合成的核心酶完成一个冈崎片段的合成后，即从滑动夹和完成一个冈崎片段的合成后，即从滑动夹和DNADNA上脱上脱落下来。随后，落下来。随后，DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII的滑动夹装载因子在的滑动夹装载因子在新形成的模板接头

34、位置上，组装新的滑动夹。新组新形成的模板接头位置上，组装新的滑动夹。新组装的滑动夹与核心酶结合，起始下一个冈崎片段的装的滑动夹与核心酶结合，起始下一个冈崎片段的合成。合成。 新合成的冈崎片段与上一个冈崎片段被一切口分开。新合成的冈崎片段与上一个冈崎片段被一切口分开。冈崎片段的冈崎片段的RNARNA引物长约引物长约5 5个核苷酸，而它的个核苷酸，而它的DNADNA部分长部分长约约1 0001 0002 000 2 000 bpbp。DNADNA聚合酶聚合酶I I与切口结合，并利用与切口结合，并利用其其5353外切酶活性切去下游冈崎片断的外切酶活性切去下游冈崎片断的RNARNA部分，与部分，与此同时上游的冈崎片断，这一过程相当于切口平移。此同时上游的冈崎片断，这一过程相当于切口平移。当当RNARNA引物被切除后，由引物被切除后，由DNADNA连接酶催化磷酸二酯键的连接酶催化磷酸二酯键的形成，从而把冈崎片断连接起来形成连续的不含形成，从而把冈崎片断连接起来形成连续的不含RNARNA序序列的后随链。列的后随链。 三、三、 Termination and segregation 细菌基因组的复制是从单一位点双向进行的。大