浅议双歧杆菌脂磷壁酸延缓细胞衰老的作用

1、浅议双歧杆菌脂磷壁酸延缓细胞衰老的作用【摘要】目的探讨双歧杆菌脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)在延缓 H2O2诱导细胞衰老中的作用。方法 H2O2诱导和38细胞衰老,B半乳糖苷酶 细胞化学染色计算衰老细胞百分率变化，RT MR和Western印迹检测衰老细胞 p21、细胞周期蛋白E(cyclin E)和周期蛋白依赖性蛋白激酶2(CDK2表达水平的 变化。结果 双歧杆菌LTA处理后，B 半乳糖苷酶细胞化学染色阳性细胞百分率 较衰老模型组降低(P)。与年轻对照组相比,衰老模型组细胞中p21的表达增 高,cyclin E和CDK2表达降低,而双歧杆菌LTA能够逆转上述变化(P)

2、。结论 双 歧杆菌能延缓H2O2诱导的细胞衰老，机制可能与改变p21,cyclin E和CDK2表达 水平有关。Effect mecha nism of lipoteichoic acid of Bifidobacterium ondelay ing cell aing卩TAG Yan 【 WANG Yue, I.TU Jian Long, et d.Key Laboratory of Laboratory Medical Diag no stics of Min istry ofEducati on, Departme nt of Laboratory Medic ine, Chongqin

3、g MedicalUniversity, Chongqing 400016, China【Abstract 】 Objective To explore the effect of lipoteichoic acid (LTA) of Bifidobacterium on delay ing cell aging in duced by H2O2.Methods “丨：用 匚山-討ml by 11202. p g；;(p 口:c：?tuc;i：iri .st ryf i rg wus3 门讥和 i_.;：i 比 l.hi.q；心i.；：i丁屈cell the mRNA protein leve

4、ls of p21, cyclin E CDK2 were detected byUT PCUblot* Itesulis Treatment with LTA(5, 10 卩 g/ml)led toa sig nifica ntin crease in the proporti on of p i w 一丨丨严 ilJjmarkedly decreased the mRNA protein levels of p21 in creased the mRNA piOLcin levels of cyclin E CDK2 in Ml 3S colls Lw model group (all P

5、). Con clusi ons LTA of Bifidobacterium can delay cell agi ng in duced by H202, whose mecha nism may have relati on with cha nge the expressi ons of p21, cyclin E CDK2.【Key words 】Bifidobacterium; Lipoteichoic acid; Cellagi ng;H2O2在体外,人胚肺二倍体成纤维细胞已成为经典的复制性细胞衰老模型，而多种刺激物能诱导年轻细胞出现与复制性衰老相似的特征，被称为应激诱导早 熟性

6、老化i iiiluCJil prurijj.irc- s（.rcsc（vi（.：. S11S） ?其中 H2O2是 最常用的氧化应激引发细胞SIPS诱导剂1,2。双歧杆菌的表面分子脂磷壁酸 （lipoteichoic acid,LTA）已被证实具有抗氧化的作用，能够有效延缓衰老3, 但其机制并不是很清楚。本研究用H20新导人胚肺成纤维细胞町阴出现SIPS, 观察双歧杆菌LTA是否具有抗细胞衰老的作用，以及僦 隔细胞中p21、CDK2 和cyclin E mRNA和蛋白表达水平的变化,探讨双歧杆菌LTA抗细胞衰老的细胞 周期调控机制。1 材料和方法材料双歧杆菌LTA由本实验室参考Sutcliff

7、e 法4从两歧双歧杆菌中提 取,人胚肺成纤维细胞和3S细胞（20 代）购于中国科学院细胞库,胎牛血清和 MEM培养基购自美国 Gibco公司,H2O2购自Sigma公司;p21、CDK2 cyclin E和 GAPD引物序列由Invitrogen 公司合成，RT卩CR试剂盒购自Promega公司,p21、 cyclin E 单克隆抗体和CDK2多克隆抗体购自北京中山公司,衰老特异性B 半 乳糖苷酶原位染色试剂盒,购自上海杰美公司Western印迹化学发光检测试剂 盒购自美国KPL公司。方法细胞培养H 33细胞接种于含10%台牛血清的 MEM培养基 （另外加入2 mmol/L 谷氨酰胺,mmol

8、/L丙酮酸钠,mmol/L非必需氨基酸），置37C ,5% CO2条件下培 养至2235代用于实验。细胞处理5和分组 模型组将细胞接种于24孔培养板，每孔2X 105 个细胞,待细胞长满培养板的70流右（避免细胞汇合）,加160卩mol/L H2O2作 用2 h,用无血清培养基清洗3次,再加入10%台牛血清的培养基培养72 h;双歧 杆菌LTA处理组在加160卩mol/L H2O2同时分别加入5、10、20卩g/ml LTA,同 时做年轻对照组。B半乳糖苷酶细胞化学染色按照说明书操作，染成蓝色的细胞为B 半乳糖苷酶染色阳性细胞，每 组同时做4个复孔,每孔计数400个细胞,计算B 半乳糖苷酶染阳

9、性百分率。p21、cyclin E 和 CDK2 mRN表达水平逆转录参阅Promega RT说明书:2卩g RNA+卩g olig（dT）+ 无RNAase 水,终体积w 15卩l,70 C变性5 min,立即放进冰中冷却，随后在上述体系中加 入1! 1LV 1卩l,dNTP 卩l,RNAase J小 训）;3X缓冲液5卩l,加水至25 卩 1,42 C 60 min,95 C5 min,冰浴 5 minPCF的反应体系：PCR缓冲液 5 卩 l,MgCI2卩I,灭菌水 卩I, Promega Taq酶卩I,上游引物1卩I,下游引物1卩I, dNTP卩l,cDNA 2卩I,共30卩I。引物序

10、列见表1。PCR反应条件：为94C 3 min预 变性;94 C 35 s,59 C 35 s(p21,cyclin E 和 CDK2), 61 C 30 s(GAPDH),72 C 45 s,32个循环;72 C 5 min;取PCR扩增产物5卩I上样于10 g/L琼脂糖电泳，在 liio禹1凝胶成像仪上观察并保存结果，光密度分析。表1引物序列及扩增产物大小(略)p21、cyclin E 和CDK2蛋白表达水平处理后的细胞用预冷的细胞裂解液提取蛋白，用蛋白提取液样品作SDS电泳后转膜，封闭，转至pvdGM,室温下封闭2 h后，一抗(1 : 200稀释)4 C下孵育过夜，mol/L PBST洗

11、涤5次，每次5 min,与二抗(1 : 1 000稀释) 室温下孵育2 h,洗涤后用ECL化学发光系统检测，待条带显示清楚后终止反应。 结果用quantity one 软件分析。统计学处理实验数据以xs表示，采用SPSS软件分析，多组间均数比较用单因素 方差分析。2结果双歧杆菌LTA对H2O2诱导细胞衰老的影响衰老模型组的B 半乳糖苷酶阳性细胞率(71%)明显高于青年对照组(10%)和5卩g/ml LTA处理组(21%)及10卩g/ml LTA处理组(35%)(P),表明双 歧杆菌LTA能够延缓由H2O2诱导的细胞衰老，但20卩g/ml LTA处理组(69%)无 明显作用。见图1。双歧杆菌LT

12、A对僦 38细胞中p21、cyclin E和CDK2mRNAS达的 影响与年轻对照组比较，模型组和38细胞的p21 mRNAS达显着增加(P),cyclin E 和CDK2 mRN表达明显下降(P);经5卩g/ml和10卩g/ml双歧 杆菌LTA处理后，其细胞内p21 mRNA表达较模型组明显下降(P),cyclin E 和 CDK2 mRN表达较模型组明显增高(P),其中尤以5卩g/ml LTA组变化最明显。 见表2、图2。表2 双歧杆菌LTA对和 38细胞中p21、cyclin E和CDK2mRNA 表达的影响(略)双歧杆菌LTA对H2O2诱导和38细胞衰老过程中蛋白表达的影响 与年轻对照

13、组比较，模型组和38细胞的p21蛋白表达显着增加 (P),cyclin E 和CDK2蛋白表达明显下降(P);经5卩g/ml和10卩g/ml双歧 杆菌LTA处理后,CDK2 p21 mRNA表达的影响 其细胞内p21蛋白表达较模型组明显下降(P),cyclin E和CDK2蛋白表达较模型组明显增高(P),其中尤以5卩g/ml LTA组变化最明显。见表3、图3。表3 双歧杆菌LTA对和38细胞p21、Cyclin E、CDK2蛋白表达的影响(略)3讨论氧化应激是指机体活性氧的产生过多或(和)机体抗氧化能力下降,活性氧(ROS)清除不足,导致ROS在体内增多并引起细胞氧 化损伤的病理过程。ROS包

14、括超氧阴离子0门、羟自由基(OH - )、H2O2等。在 体外,H2O2引发细胞氧化应激损伤，诱导细胞衰老，是最常用的诱导剂。本实验结 果发现,用亚致死量的160卩mol/L H2O2处理和 囲细胞可诱导细胞SIPS,其 B 半乳糖苷酶细胞化学染色阳性细胞百分率较年轻对照组明显增高，而用双歧 杆菌LTA处理后,B 半乳糖苷酶阳性细胞百分率较模型组明显降低,其中尤以 5、10卩g/ml双歧杆菌LTA处理组降低最为明显,而20卩g/ml双歧杆菌处理 组无明显变化,显示出一定的浓度依赖性,表明双歧杆菌LTA能延缓H2O2诱导的 细胞衰老。细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞在周期时相的变迁中进入增

15、 殖、分化、衰老和死亡等生理状态。细胞周期沿着G1期S期吃期M期的顺序进行运转。G1期是启动细胞周期循环的关键，当细胞复制性衰老时，生长停 滞，主要分布在G1期。当细胞被诱导衰老时,也具有相同的特征。Gorbunova等 6认为H2O2诱导的细胞衰老主要是由于 DNA损伤引起。对DNA损伤所引起的 反应 细胞阻滞于G1期。在整个G1期,细胞在不同时相受到各自周期蛋白 (cyclin)和周期蛋白依赖激酶(CDK)的凋节,其中cyclin E是调控细胞周期从G1 期进入S期的关键。cyclin E首先激活的磷酸化活性使Rb磷酸化,释放转录因子E2F,促使DNA合成,导致细胞由G1期进入S期,进行有

16、 序的运转。因此，提高cyclin E和CDK2的表达,可以促进细胞由G1期进入S期。 而抑制CDK2的活性,也能阻止细胞进入S期7。p21作为一个广谱的CDKW制 剂和细胞周期的负调控因子，能抑制的磷酸化活性，使细胞停滞在G1期,从而诱发细胞衰老的特征性改变8。本研究发现,经H2O2诱导的 和 33细胞出现SIPS,其细胞中p21表达明显增加,cyclin E 和CDK2表达显着 下降,而双歧杆菌LTA能够明显逆转上述细胞周期调节因子的变化，表明其可以 通过增强细胞周期的正向调节并抑制细胞周期的负向调节，从而发挥延缓细胞衰老的作用【参考文献】1 Toussaint O, Medrano EE

17、, von Zglinicki T. Cellular molecularnochanisnis of stress ialucod ijicjnciiuro scncsccnccof huir.andiploid fibroblasts melanocytes J【pG iml, 20XX : 35 ：2了 伍2 DuanJ, DuanJ, Zhang Z, et al. Irreversible cellularsenesceneegenes telomere shorteningJ.Int J Biochem Cell Biol,20XX;37(7):107 20,3付玉荣,王跃,陈淑惠

18、,等.双歧杆菌脂磷壁酸对衰老小鼠脑组织自由 基代谢和器官指数的影响J.中国老年学杂志，20XX;24(1：制 入4 Sutcliffe IC, Hogg SD. Extraction of lipoteichoic acid fromSTreprococcus wrans 賈ith the non onif de二ergern. TritonX 114J .JVliL-obiu- Muthod, 1993; 17(3) :215 25.5 Dumont P,Royer V,Pascal T, et al. Growth kinetics rather thanstress accelerate telomere shorte ning in