chap糖基化工程和糖生物学应用PPT课件

1、糖基化工程糖基化工程 糖基化工程的含义和意义 影响糖基化的因素 糖基化工程的手段 糖基化的监测 常用表达体系的糖基化特点 糖基化工程技术及其应用第1页/共37页Protein Market (2000)167 productsRecombinant Protein Vaccines$2,135 MOthers$275 MHerceptin$440 MRituxan$650 MEnbrel $3.5 billionMonoclonal Antibodies/Other$535 MCerazyme/Ceredase$300 MAlpha-glucosidase $0.8 billionEnzyme

2、s$4,700 MEPO$3,000 MInterferons $7.5 billionComplex Proteins$350 MFactor IX$1,000 MFactor VIII$3,000 MInsulin $4.35 billionBlood Products$284 MFibrinogen$350 MCollagen$1,300 MHuman Serum Albumin $2 billionStructural ProteinsEPO2005年销售额超过百亿美元第2页/共37页Biogenerics: expiry date of patent and market第3页/共3

3、7页贫血贫血 贫血是指循环中红细胞的数量和血红蛋白浓度低于正常值，不足以维持血液组织正常氧和作用的代偿机制病症。最常见的是缺铁性贫血、再生障碍性贫血、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血等。 治疗治疗 (Pre-1989): 红细胞疗法（输血，连同维生素和矿物质）。 问题问题: 对某些贫血不太有效。第4页/共37页Erythropoietin，EPO 美国Amgens 于1989年开发了Epogen（recombinant human erythropoietin，rhEPO） 促红细胞生成素 (erythropoietin, EPO) 水平在经历了化学疗法的癌症患者体内很低（尤其是肾衰竭者）。EPO可

4、以刺激红细胞的生成， 并具有神经保护剂功能。 适应症适应症: 红细胞生成不足引起的贫血 (来自肿瘤化疗、AIDS、慢性肾衰竭等)第5页/共37页Erythropoietin Drug developmentFirst cloned and expressed in bacteria: E. coliBacterial EPO is fully active:binds to tightly to the EPO receptorstimulates erythroid developmenthas different binding kinetics than native hEPOwhile

5、 bacterial rhEPO is 500-fold less effective in vivo第6页/共37页N-linked glycans on EPOHigh mannose N-glycansComplex N-glycansno sialic acid3-4 sialic acid terminino negative charges3-4 negative chargesSialic acid modication varies from 0-4 residues per N-glycan3条N-糖链均为复杂型第7页/共37页have different numbers o

6、f glycosylation and sialation sites (%)Different Biotech FormulationSome hrEPOs with varying sites of glycosylation (a post-translation modification of protein) outlast others. 第8页/共37页Amgens Biotech Business Amgen的两大拳头产品： erythropoietin Epogen (epoetin alpha) colony stimulating factor Neupogen (fil

7、grastim). 继Epogen后开发的新一代EPO产品仍是市场领军者： Aranesp (darbepoetin alpha) ：增加了两个Asn，使每分子EPO的唾液酸基团数量增加到22个。 Neulasta (pegfilgrastim)：对Neupogen进行PEG化修饰PharmaFocus 2003第9页/共37页重组表达的药用糖蛋白重组表达的药用糖蛋白 世界生物医药市场主要品种大多为糖蛋白：rhEPO、GM-CSF、tPA等。全球产值约数百亿美元。 糖蛋白中的糖链对于药物在体内的稳定性、活性、靶向性及药代动力学有显著的影响，因此在开发这类药物时控制其糖基化具有较大的重要性。大多

8、数情况下，对产品的糖基化必须予以优化和质量控制。第10页/共37页唾液酸化程度对唾液酸化程度对EPO活性的影响活性的影响 天然的和重组的EPO含有三条唾液酸化的复杂型N-糖链。 唾液酸化程度对EPO的体内半衰期有很大影响。 培养基pH、前体或营养成分的可利用性、不同细胞因子和激素的存在、细胞株中糖基转移酶和糖苷酶活性的强弱等因素均能影响培养细胞产物糖基化程度、分支程度、唾液酸化程度、硫酸化程度等。第11页/共37页酶替代疗法中溶酶体酶的靶向酶替代疗法中溶酶体酶的靶向 溶酶体贮积性疾病 Gauchers disease（葡萄糖脑苷脂酶缺陷）的酶替代疗法需要通过细胞表面的Man受体靶向到巨噬细胞的

9、溶酶体。 可由哺乳动物生成的含有N-聚糖的酶经糖苷酶（唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶等）降解产生。 也可由杆状病毒-昆虫细胞表达系统加工生产。第12页/共37页糖基化工程的目的糖基化工程的目的 控制蛋白质上的寡糖链加工，使其 增加合成及分泌的效率 增加溶解度 延长体内半衰期：如rhEPO的Sia基团 增强对抗蛋白酶的稳定性 增加生物活性 降低抗原性 靶向导入：如在酶替代疗法中溶酶体酶的靶向 有助于蛋白质的纯化等第13页/共37页影响糖基化的因素影响糖基化的因素 多肽链自身结构 潜在糖基化位点的分布和数目 蛋白质的空间结构 宿主系统糖基转移酶的表达 细胞培养的环境条件第14页/共37页糖基化工程

10、的手段糖基化工程的手段 体内控制 利用不同表达系统的糖基化差异 利用基因工程改变肽链上的糖基化位点 与GPI信号肽融合表达 重组表达糖基转移酶和糖苷酶等 体外修饰 利用天然的和合成的糖基化抑制剂 利用糖苷酶切除不需要的糖基 体外合成糖链 精确控制培养条件第15页/共37页常用表达系统的糖基化差异（一）常用表达系统的糖基化差异（一） 原核表达体系： 对重组蛋白不能糖基化 真核表达体系： 酵母： 酿酒酵母：过度甘露糖基化。需进行改造。 甲醇营养型酵母：Pichia pastoris; Hansenula polymorph：与哺乳动物接近 丝状真菌：表达异源蛋白比较困难第16页/共37页酵母表达产

11、物的糖型酵母表达产物的糖型第17页/共37页常用表达系统的糖基化差异（二）常用表达系统的糖基化差异（二） 昆虫细胞/杆状病毒： 应用广泛的真核表达体系。但其生产的重组糖蛋白一般仅具有高甘露糖或寡甘露糖型糖链，难以生成复杂型糖链成为该系统的缺陷之一。 转基因植物：表达哺乳动物糖蛋白具有较高免疫原性 哺乳动物细胞： 广泛应用的CHO细胞株。 具有多种糖基化突变株。 转基因动物： 器官专一性。 需与乳汁中的其他寡糖分离。第18页/共37页植物糖蛋白中复杂型植物糖蛋白中复杂型N-聚糖结构聚糖结构 结构的不同导致植物N-糖链具有高免疫原性 核心1,3Fuc（哺乳动物中主要为1,6Fuc） 1,2Xyl

12、能否合成Sia末端尚不清楚 植物的糖基化工程改造 缺失GlcNAcT-1基因 敲除某些糖基转移酶 使重组蛋白C端带有内质网滞留信号H/KDEL第19页/共37页重组重组rhEPO的糖基化的糖基化 糖基化位点 糖链结构和功能 表达体系对糖基化的影响 培养条件对糖基化的影响 糖基化的检测与质量控制第20页/共37页rhEPO糖基化程度的检测糖基化程度的检测 SDS-PAGE（表观分子量） 等电聚焦电泳 高效液相色谱（HPLC） 核磁共振（1HNMR） 质谱（MS） 凝集素法（Lectin-binding assays for the isoforms of human erythropoietin

13、: comparison of urinary and four recombinant erythropoietins. Journal of Endocrinology, Vol 150, Issue 3, 401-412） ： 鸡冠刺桐凝集素(Erythrina cristagalli agglutinin，ECA);与无唾液酸末端的具有Gal beta1-4GlcNAc 外链的糖连结合 朝鲜槐白血球凝集素(Maackia amurensis leukoagglutinin，MAL)：NeuAc alpha 2-3Gal beta 1-4GlcNAc第21页/共37页SDS-PAGE检测

14、检测rhEPO的糖基化的糖基化BACK第22页/共37页思考思考 糖链在糖复合物中的功能 糖基化工程的技术和应用基因工程技术 糖基化的检测糖链分析方法 rhEPO综合应用实例第23页/共37页糖生物学糖生物学第十一章 糖生物学在医药、工农业中的应用第24页/共37页糖生物学对医药领域的启示糖生物学对医药领域的启示 医学 早期诊断：凝集素，糖芯片 药物设计 抗细胞粘附：精卵结合，炎症反应 抗感染 抗肿瘤转移 抗凝血 酶替代疗法治疗糖合成和代谢酶缺陷性疾病 酶抑制剂干扰有害糖代谢：糖尿病 提高靶向性 。 农药设计 杀真菌：干扰真菌细胞壁合成 杀虫：干扰昆虫体内特殊糖的代谢 激活植物自卫系统：寡糖素

15、 重组蛋白类药物的糖基化工程 天然药物的糖基杂化、糖的酶法合成 。第25页/共37页糖生物学对医药领域的启示糖生物学对医药领域的启示 寡糖类药物寡糖类药物 分子和细胞识别抑制剂： 病原性微生物及毒素的抑制剂：分子小，可溶，可经呼吸道或肠道进入人体 抗炎症药物 精卵结合抑制剂 免疫增强剂：-葡聚糖 疫苗：细菌疫苗，肿瘤疫苗 糖酶抑制剂：唾液酸酶抑制剂，阿卡波糖等 重组类糖蛋白药物重组类糖蛋白药物 延长体内半衰期 提高药物的靶向性 治疗用蛋白聚糖治疗用蛋白聚糖：抗凝血、聚透明质酸等 器官移植急性排斥中的糖生物学器官移植急性排斥中的糖生物学 中草药活性成分中草药活性成分第26页/共37页寡糖类抗感染

16、药物寡糖类抗感染药物 可口服或气管给药，不需注射 病原性微生物及毒素的抑制剂适应症（病原）抗黏附的糖制剂公司胃溃疡（幽门螺杆菌）唾液酸化乳糖Neose中耳炎（流感嗜血杆菌）唾液酸化四糖Neose肾衰竭（大肠杆菌毒素）Gal1-4GalSynsorb Biotech腹泻（难辨梭菌毒素）Gal1-3GalSynsorb Biotech腹泻（霍乱弧菌毒素）GM1Synsorb Biotech第27页/共37页寡糖类疫苗药物寡糖类疫苗药物细菌的糖疫苗：如Hib疫苗，使Hib感染发病率下降95%。肿瘤的糖疫苗：黑色素瘤、乳腺癌：GM2, GD2与蛋白载体缀合乳腺癌：Sialyl 2-6GalNAc -（

17、唾液酸Tn抗原）对选凝素介导的白细胞穿行的抑制：SiaLexFucTVII酶抑制剂抑制肿瘤转移：硫酸乙酰肝素抑制剂第28页/共37页拟糖类糖酶抑制剂药物拟糖类糖酶抑制剂药物适应症药物（机理）公司流感病毒A感染GS4104（唾液酸酶抑制剂）Gilead/Hoffman LaRoche流感病毒A感染Zanamivir（唾液酸酶抑制剂）Glaxo Wellcome/Biota肿瘤及肝炎苦马豆碱（甘露糖苷酶II抑制剂 ）GlycoDesign糖脂贮积症糖基转移酶抑制剂Oxoford GlycoSciences糖尿病阿卡波糖（肠道葡萄糖苷酶抑制剂）Bayer由宠物跳蚤引起的感染Lufenuron（几丁质

18、合成抑制剂）Ciba-Geigy第29页/共37页N-糖链加工中的酶第30页/共37页寡糖类酶抑制剂作为药物Clinical situation Drug/Mechanism Company流感病毒A感染GS4104 (唾液酸酶抑制剂)Glaxo Wellcome/Biota流感病毒A感染Zanamivir (Relenza) (唾液酸酶抑制剂)Gilead/Hoffman LaRoche肿瘤和肝炎Swainsonine苦马豆碱 (-mannosidase II inhibitor)GlycoDesign糖脂沉积症糖基转移酶抑制剂Oxford GlycoSciences糖尿病阿卡波糖Acarbose (intestinal -glucosidase inhibitor)Bayer由宠物跳蚤引起的感染Lufenuron (Program) (chitin synthesis inhibitor)Ciba-Geigy第31页/共37页 -葡萄糖苷酶抑制剂治疗糖尿病的原理食物中的淀粉等多糖寡糖葡萄糖血糖胰淀粉酶葡萄糖苷酶抑制剂葡萄糖及吸收减慢避免高血糖吸收进入血液葡萄糖苷酶第32页/共37页糖尿病药物中的糖基化抑制剂 -葡萄糖苷酶抑制剂研究现状 竞争性抑制剂：阿卡波糖、米格列醇等 非竞争性抑制剂（少）：染料木素等