04NK活性测定

1、淋巴细胞功能测定淋巴细胞功能测定的体外试验 淋巴细胞增殖试验 3h-tdr3h-tdr、mttmtt、形态学计数、形态学计数 细胞毒试验nk 51cr51cr、ldhldh释放法、释放法、细胞凋亡检测法细胞凋亡检测法 分泌功能检测分泌功能检测 细胞因子分泌细胞的检测（细胞因子分泌细胞的检测（elispotelispot） 抗体形成细胞的检测（溶血空斑试验）抗体形成细胞的检测（溶血空斑试验） t t细胞功能检测细胞功能检测 t t细胞亚群的检测细胞亚群的检测 il-2il-2活性的测定活性的测定 淋巴细胞转化实验淋巴细胞转化实验 b b细胞功能检测细胞功能检测 抗体形成细胞检测（溶血空斑试验）抗

2、体形成细胞检测（溶血空斑试验） eaea花环试验（测定花环试验（测定fcfc受体）受体） smigsmig的测定（直接免疫荧光法）的测定（直接免疫荧光法） nknk细胞活性检测（细胞毒试验）细胞活性检测（细胞毒试验） 吞噬细胞功能检测吞噬细胞功能检测 属淋巴细胞；无特异性属淋巴细胞；无特异性tcr；无须致敏即直接杀伤靶细胞。；无须致敏即直接杀伤靶细胞。l表面标记表面标记 cd3-、cd56+、cd16+l表面受体表面受体（1）杀伤细胞活化受体（）杀伤细胞活化受体（kar） 结合靶细胞表面糖类配体，促使结合靶细胞表面糖类配体，促使nk发挥杀伤作用。发挥杀伤作用。（2）杀伤细胞抑制受体（）杀伤细胞

3、抑制受体（kir） 识别自身细胞表面识别自身细胞表面mhc-i类分子，产生抑制信号。类分子，产生抑制信号。l主要生物学功能主要生物学功能 抗感染与抗肿瘤；免疫调节抗感染与抗肿瘤；免疫调节自然杀伤细胞自然杀伤细胞 nk细胞不杀伤正常细胞细胞不杀伤正常细胞 nk细胞杀伤靶细胞细胞杀伤靶细胞 nk细胞通过细胞通过adcc作用杀伤病作用杀伤病毒感染的靶细胞毒感染的靶细胞nk细胞杀伤靶细胞电镜图细胞杀伤靶细胞电镜图胞胞 核核 125i释放法释放法 荧光染料释放法荧光染料释放法nk细胞细胞+靶细胞靶细胞靶细胞溶解、破裂释放靶细胞溶解、破裂释放胞浆内酶类胞浆内酶类 ldh释放法释放法胞浆内蛋白胞浆内蛋白51

4、cr释放法释放法实验原理实验原理 效应细胞效应细胞 靶细胞靶细胞 释放释放ldh 丙酮酸丙酮酸乳酸乳酸乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(ldh)nad+nadh+h+pmsnbt实验材料实验材料1、ldh底物溶液（临用前配制）底物溶液（临用前配制） 2、1% np-403、1mol/l柠檬酸终止液柠檬酸终止液nbt（硝基氯化四氮唑蓝）（硝基氯化四氮唑蓝） 4mgnad+（氧化型辅酶（氧化型辅酶i ） 10mgpms（吩嗪二甲酯硫酸盐）（吩嗪二甲酯硫酸盐） 1mg混匀后取混匀后取1.6ml，加，加1mol/l乳酸钠乳酸钠0.4ml加入加入2mlddh2o溶解溶解加入加入0.1mol/l ph7.4的的pbs

5、至至10ml实验步骤实验步骤效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）靶细胞的制备靶细胞的制备效效-靶细胞相互作用靶细胞相互作用酶促反应酶促反应结果判读结果判读 取培养取培养2448hr的靶细胞的靶细胞(k562), 洗洗涤涤3次（次（1000rpm10min）, 最后用完最后用完全全rpmi-1640培养液调整细胞浓度至培养液调整细胞浓度至1105/ml, 备用。备用。靶细胞的制备：靶细胞的制备：效应细胞的制备效应细胞的制备（外周血单个核细胞分离）（外周血单个核细胞分离）采集静脉血采集静脉血2ml，加，加0.2ml肝素溶液（肝素溶液（125-250u/ml）

6、抗凝）抗凝吸取吸取2ml淋巴细胞分层液置淋巴细胞分层液置10ml离心管中，离心管中，将管倾斜将管倾斜45，沿管壁缓缓注入抗凝血，沿管壁缓缓注入抗凝血离心离心2000rpm20min密度梯度离心分离外周血单核细胞密度梯度离心分离外周血单核细胞用完全用完全rpmi-1640定容细胞，计数后调整细胞浓度定容细胞，计数后调整细胞浓度（加入（加入0.2ml完全完全rpmi-1640 ，混匀），混匀）将所得将所得pbmc用用5倍体积的倍体积的1640洗涤一次洗涤一次2000rpm5min将毛细吸管直接伸到灰白色层（在血浆和分层液间），将毛细吸管直接伸到灰白色层（在血浆和分层液间），轻轻轻轻 地吸取该层细胞

7、（即为地吸取该层细胞（即为pbmc）效效-靶细胞作用靶细胞作用 将效应细胞和靶细胞各将效应细胞和靶细胞各0.1ml(e/t=100:1)加入加入96孔细胞培养板的孔中孔细胞培养板的孔中, 每份标本设每份标本设2个复孔个复孔,同时设靶细胞自然释放对照组同时设靶细胞自然释放对照组 (0.1ml靶细胞靶细胞+0.1ml rpmi-1640液液)最大释放对照组最大释放对照组 (0.1ml靶细胞靶细胞+0.1ml1np-40液液), 1000r/min, 2min后后, 置置37、5co2温箱温箱中孵育中孵育2-4h。a 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 实验组实验组 自然释放组自然

8、释放组 最大释放组最大释放组 1 2 3 4 5 6 效应细胞（效应细胞（100l） + + - - - -靶细胞（靶细胞（100l） + + + + + +rpmi1640 （100l） - - + + - - 1%np-40 （100l） - - - - + + 酶促反应酶促反应置置37预温预温10min, 加入新鲜配制的底物溶液加入新鲜配制的底物溶液0.1ml, 37避光反应避光反应1015min。终止酶促反应终止酶促反应（用毛细吸管滴一滴（用毛细吸管滴一滴1mol/l柠檬酸柠檬酸30l）a 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12结果计算结果计算 用酶标检测仪在用酶标检测仪在570nm波长下读取各孔波长下读取各孔od值值, 并计算并计算nk细胞活性。细胞活性。实验组实验组od值值-自然释放对照组自然释放对照组od值值nk细胞活性（细胞活性（%）最大释放对照组最大释放对照组od值值-自然释放对照组自然释放对照组od值值=100%1、无论采用何种试验方法、无论采用何种试验方法, 靶细胞的质量是影响细靶细胞的质量是影响细 胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因 素。一般要求靶细胞的自然释放率素。一般要求靶细胞的自然释放率10。2、分离、分离pbmc时，应用毛细吸管