Chapter高效液相色谱法原理解析实用PPT课件

1、HPLC 基础液相原理第1页/共71页目录 历史 色谱法原理 液相色谱系统 HPLC参数与术语 分离度公式 固定相与物理性质 了解范氏方程 色谱柱第2页/共71页色谱的定义 是一种分离科学 在液相或气相中使化合物达到分子水平的分离 Chromato - 颜色 Graphy - 图像 首先在俄国科学家Tswett(茨维特)的试验中进行了描述样品植物提取物 他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管，再加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带化合物得以分离第3页/共71页色谱法简介 色谱法（Chromatography）溯源 100多年前俄国植物学家 Tsw

2、ett（茨维特）分离植物色素时采用的实验方法 Tswett 用希腊语 chroma（色）和graphos（谱）描述他的实验方法，即现在的Chromatography（色谱法）第4页/共71页Tswett 的色谱系统第5页/共71页色谱发展史回顾 19031906 Tswett首次使用这套色谱系统 19301932 Karrer, Kuhn 和Strain用氧化钙、氧化铝和氧化铁做吸附剂 1941 Martin 和Synge引入了柱分离色谱 1944 Gonsden,Gorrdon 和Mardin 介绍了纸分离色谱 1951 Kirchner 引入了我们现在仍在使用的TLC 1952 James

3、 和Martin 发展了气相色谱 1964 L.C.Moor发展了现在仍在使用的凝胶渗透色谱（GPC） 1968 高效液相色谱出现了第6页/共71页色谱法简介色谱法简介色谱法的原理 是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解，分配，吸附等化学作用性能的差异，当两相作相对运动时，使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离。 两相中有一相是固定的，叫作固定相(Stationary Phase)，有一相是流动的，称为流动相(Mobile Phase)，流动相又叫洗脱剂,溶剂。相（Phase）： 物理化学术语，特指在某一系统中，具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分

4、的界面。第7页/共71页色谱法原理分离是一个物理过程。固定相固定相(Stationary Phase)流动相流动相(Mobile Phase)进样进样 (Injection)洗脱洗脱 (Elution)相互作用相互作用(Interaction)第8页/共71页按照分子量区分的色谱类型气相色谱液相色谱吸附/分离液相色谱离子交换体积排除色谱凝胶渗透/凝胶过滤第9页/共71页HPLC的系统 溶剂溶剂(流动相流动相) 泵泵进样器进样器 色谱柱色谱柱(固定相固定相)检测器检测器废液废液数据系统数据系统第10页/共71页什么是色谱图？ 色谱图（Chromatogram）： 色谱柱流出物通过检测器时所产生的

5、响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为时间色谱峰色谱峰时间时间(分分)基线基线峰高峰高峰宽峰宽响应值响应值第11页/共71页术语 流动相 在HPLC中流动相是液体 所有要分析的样品必须能溶解在流动相中 带着样品与固定相做相对运动第12页/共71页术语 固定相 色谱填料它在色谱柱里处于固定位置 执行化学分离 也被称为色谱填料或吸附剂第13页/共71页固定相与流动相 固定相与流动相具有相反的性质，正是由于这种性质的差别使他们对所分析的化合物具有竞争性第14页/共71页液相色谱图名词术语(1)(1) 色谱图名词术语: 色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号 峰底(

6、Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线 峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离 切线峰宽(Peak Width):在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离 半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧相交两点之间的距离第15页/共71页液相色谱图名词术语(2)(2) 色谱图名词术语: 峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值 标准偏差()(Standard Error):0.607倍峰高对应峰宽的一半 拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰(Le

7、ading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰 鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰第16页/共71页液相色谱图名词术语(3)(3) 色谱图名词术语: 基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号 基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓慢变化 基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起的基线波动 谱带扩展(Band Broadening):由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象第17页/共71页色谱参数 V - 保留体积 V0 -死体积 tr - 保留时间

8、k 保留因子或容量因子 - 选择或分离因子 N 塔板数 w - 峰宽 R 分离度第18页/共71页洗脱体积和峰宽 这些是导出理论和定义所必需的基本测量V0 = 无保留化合物的洗脱体积无保留化合物的洗脱体积,等于一个柱体积等于一个柱体积V1 = 化合物化合物1的洗脱体积的洗脱体积V2 = 化合物化合物2的洗脱体积的洗脱体积W2= 化合物化合物2的峰宽的峰宽(以体积计以体积计)，用切线法计算，用切线法计算第19页/共71页容量因子（保留因子，k ）：保留能力的量度 k 是样品与填料作用强度的直接量度 3.5.5 - 2 k2 0V0V1V k1 :公式1.5.5 - 1 k19.5.5 - 5 k

9、3 V0V1 V2V3 时间时间 .5 1 2 5描述了峰距离V0有多远与流速、时间和柱子尺寸无关第20页/共71页容量因子k k与组分在流动相和固定相之间的平衡有关 k是一个平衡常数第21页/共71页在正相与反相色谱中的容量因子k 容量因子的大小取决于流动相和固定相的极性 可以通过改变流动相中有机相的比例来改变流动相的极性 只适用于吸附和分配色谱第22页/共71页通过改变流动相的极性改变 k第23页/共71页分离因子（选择因子， ）：峰分离程度的量度 0V1V0V2V 1k2k 或3.5 - 1.5 - 2 12/的峰峰9 .5 - 1.5 - 5 13/ 的峰峰 V0V1 V2V3时间时间

10、 .5 1 2 5 1,2 1,3 相邻两个峰相邻两个峰k值的比值值的比值 描述的两个峰的相对位置描述的两个峰的相对位置 取决于系统的取决于系统的“化学化学”属性属性是两个化合物在同一套色谱系统上保留差异的数值表述第24页/共71页分离因子（ ）的影响因素流动相 取决于流动相的“化学”性质，即选择不同的有机相第25页/共71页分离因子（ ） 固定相第26页/共71页分离度（R）的定义式简单说来,分离度即是两峰相对于其峰宽分开得有多远第27页/共71页R:分离程度的量度此处是几个计算分离度的实例2112WW21t tR8.5.5211-5tR1-32.5.5211-2tR1-2 t0t1 t2t

11、3时间时间 .5 1 2 5第28页/共71页理论塔板数（N）： 柱效的量度理论塔板数计算公式： W 方法 Wtan16切线法 Wh5.54半峰高 W39 3 W4 16 4 W5 25 521WVN 第29页/共71页理论塔板数（N）:分离效率的量度理论塔板数或柱效是一个数值,它表示作为保留时间函数 的峰展宽的量度1600 N.5516 NWV16N22 100N2516NWV16N22 PW = .5PW = 2第30页/共71页柱效的计算5 方法第31页/共71页用 HETP 表示柱效 H = HETP (Height Equivalent to Theoretical Plate) 要

12、求要求 H H 尽可能小尽可能小, ,这样就可以往柱子里这样就可以往柱子里装装更多的更多的板板 N= # Plates(来自蒸馏理论来自蒸馏理论) 5 块板块板 10块板块板(较大的较大的 H) (较小的较小的 H)“较厚较厚” “较薄较薄”L 柱长柱长HETPL N PlateHETP第32页/共71页分离度方程式 1N141R分离因子分离因子柱效柱效容量因子容量因子分离度方程式描述了分离度与选择性,柱效和容量因子之间的关系它是评价一张色谱图以及决定如何解决、开发和优化分离方法的依据第33页/共71页分离度方程式如果如果N增加增加2倍或倍或3倍，倍，R会怎样？会怎样？ 1 141RN第34页

13、/共71页N对分离度（R）的影响第35页/共71页分离度方程式 如果k=1,2，10，20 分离度分别是多少？ 1 N141R第36页/共71页k对分离度的影响第37页/共71页分离度方程式 如果 1或 1.4分离度分别是多少？ 1N41R1第38页/共71页 对分离度的影响第39页/共71页 ，k，N:如何控制分离度?原始分离情况改变 k改变 改变 N第40页/共71页固定相物理性质 柱材料 颗粒形状 粒径 Van Deemter 曲线 孔径 柱体积第41页/共71页柱材料 不锈钢 玻璃 塑料 HDPE (High Density Polyethylene) PEEK (Polyethere

14、therketone)第42页/共71页色谱柱实例第43页/共71页色谱柱结构固固 定定 相相筛筛 板板第44页/共71页色谱柱的装填筛板筛板球形颗粒球形颗粒无定形颗粒无定形颗粒填充床填充床 ( (固定相固定相) )填充色谱柱的填充色谱柱的流动方向流动方向第45页/共71页规则/ /球形粒径/ /不规则粒径第46页/共71页填充材料的形状 制造颗粒技术最新原始的 柱效最高良 柱床稳定性最好好第47页/共71页柱填充材料和类型 石英（无机） 二氧化硅 与海砂相似 铝（无机） 氧化铝 锆（无机） 聚合物（有机） 塑料 杂化（无机/有机） 碳第48页/共71页 1um=10-6m 分析柱一般2.5-

15、5um（10um）粒径越小，柱效越高！填料的粒径第49页/共71页粒径分布 目前常用粒径范围 例如：5um (3um7um) 粒径分布范围窄，柱效高，但是成本高3574 5 6微米第50页/共71页HPLC常用颗粒 色谱硅胶是目前为止最常用的HPLC颗粒 很多公司生产很多种类的以硅胶为基础的填充才来 色谱的柱效归根结底是由颗粒的生产工艺决定的第51页/共71页颗粒的表面性质 大表面积颗粒 是全多孔色谱吸附剂高柱效的关键 多孔颗粒 （类似于海棉里的孔） 孔的大小以原子大小为单位，Angstroms （10-10m） 经典的分析型填料颗粒的粒径范围为60-125第52页/共71页颗粒的多孔性以海绵

16、为例第53页/共71页多孔性与大表面积的比较 有许多小孔 60-125 高表面积 300-500 m2/g 适用于小分子和药物的分析 很少的一些大孔 250-4,000 低的表面积 50-150 m2/g 适用于大分子和蛋白的分析第54页/共71页颗粒的表面积 颗粒表面积： m2/g 固体的硅胶球体 5 m2/g 色谱硅胶 300 m2/g足球场=6500m2 22 g第55页/共71页理论塔板数 vs 柱效每根柱子都有自己特别的曲线，取决于不同的尺寸和粒径只有一个流速可得到只有一个流速可得到最大柱效最大柱效优化的优化的第56页/共71页范第姆特（van Deemter）方程 范第姆特（van

17、 Deemter）方程能够推导出流动相的线速度对给定峰的理论板高（H）的影响其中其中 :A项项:叫作涡流扩散项叫作涡流扩散项,与填料的颗粒度及其分布和填充技术相关与填料的颗粒度及其分布和填充技术相关B项项:叫作轴向叫作轴向(纵向纵向)扩散项扩散项,与流速有关与流速有关C项项:叫作传质阻力项叫作传质阻力项,与填料颗粒度和流速有关与填料颗粒度和流速有关HETP = Height Equivalent to a Theoretical Plate) = 柱长柱长/塔板数塔板数 = L / N 线速度 CBAH第57页/共71页流动相的线速度u经典的定义：u0 = L / L0其中： L - 柱长，u

18、0 没有保留化合物的洗脱时间第58页/共71页被分析物谱带和van Deemter A 项XXXX谱带扩散谱带扩散样品分子样品分子填料填料溶剂溶剂XX柱内的不同流路可用来通过分子.被分析物谱带展宽较小颗粒可以装填得更致密 减少孔隙通道间的空间减少谱带展宽涡流扩散涡流扩散颗粒尺寸颗粒尺寸 A A 项项 H H 柱效柱效 空隙体积或通道空隙体积或通道第59页/共71页被分析物谱带和van Deemter B项 -轴向扩散BB较慢的线速度较慢的线速度 u, (或流速或流速), 更大的轴向谱带扩散更大的轴向谱带扩散= 宽峰宽峰 = 更大的更大的 “B” 项项较高的线速度较高的线速度 u, 谱带轴向扩散

19、的时间减少谱带轴向扩散的时间减少 = 较尖锐的峰较尖锐的峰 = 小的小的 “B” 项项u B 项项 H 柱效柱效 （谱带扩散）（谱带扩散）第60页/共71页被分析物谱带和van Deemter C项传质阻力项C 项由三部分贡献组成项由三部分贡献组成 : : 流动相流动时的传质阻力 流动相停滞时的传质阻力固定相的传质阻力（吸附/解吸动力学）XXX谱带展宽谱带展宽XXXXXX谱带展宽谱带展宽XX谱带展宽谱带展宽第61页/共71页样品/组分带与van Deemter 方程 C项-传质阻力项其中：Dm - 流动相的扩散相关系数Dsm - 流动相的停滞扩散系数Ds - 固定相的扩散系数dp 粒径df 固定相膜厚度 Cm,Csm,Cs是常数H=A + + Cu B uu C项项 H 柱效柱效 u C项项 H 柱效柱效 第62页/共71页Van Deemter 曲线注：若线速度（流速）超过了最佳线速度，则HETP增加，塔板数降低dpcbdpaH2)()(线速度线速度 HETP低低 HETP = 优化的塔板数优化的塔板数mm/sec C 项项(质量传递质量传递)B 项项(轴向扩散轴向扩散)C 项项B项项第63页/共71页Van Deemter 曲线减小粒径 粒径减小，柱效增加 随着粒径减小，保持高柱效的流速范围扩大 为同时提高分离度和流速提供了可能 颗粒成为