流式细胞术FlowCytometryFCM

1、流式细胞术流式细胞术（flow cytometry,fcm)flow cytometry,fcm)作者：笛风1、流式细胞仪(flow cytometer):是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。2、流式细胞术(flow cytometry):利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。基本概念基本概念流式细胞仪结构流式细胞仪结构 激光光源及光束形成系统激光光源及光束形成系统 流动室及液流驱动系统流动室及液流驱动系统 光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源，

2、光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源， 收集不同波长的荧光信号。收集不同波长的荧光信号。 信号检测与分析：光电倍增管（信号检测与分析：光电倍增管（pmt）、补偿）、补偿 电路。荧光信号转换为电信号，并将信号放大。电路。荧光信号转换为电信号，并将信号放大。 存储、显示、分析系统：计算机。存储、显示、分析系统：计算机。 细胞分选系统细胞分选系统流式免疫分型技术要点w标本的获取和运输w标本的制备和染色w仪器的校准和质控w流式细胞仪数据获取与储存fcm的主要测定指标fsc, ssc, fl1, fl2, fl3 (fl4)其中：fsc：反映细胞的大小ssc：反映细胞内颗粒性fcm标记方法单标：一种单

3、抗/tube: fl1, fsc, ssc（三参数）双标：（两种单抗/tube）：fl1, fl1, fsc, ssc（四参数）三/四标：（三种单抗/tube）（四种单抗/tube）：fl1-fl3/4, fsc, ssc荧光素种类wfitc(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nmwpe（藻红蛋白）：橙黄色 575nmwpercp(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色675nmwpi(碘化丙啶）：橙红色 620nmn488nm波长的氩离子激光激发wapc(别藻兰蛋白）：红色 660nmn630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发q pe最强，适用于弱表达抗原q fitc最便宜，适用于强表达抗原，适用范

4、围广q biotin-avidin不适合 弱抗原的检测抗体的选择抗体的选择数据显示方式w单参数直方图w双参数二维点图w等高图w二维密度图w三维图流式常见图形流式常见图形 (histogram plot)流式细胞的主要信息流式细胞的主要信息:fluorescencewfl1wfl2wfl3wfl4最常用的标记方法是荧光素分子标记最常用的标记方法是荧光素分子标记的抗体与细胞抗原结合的抗体与细胞抗原结合流式常见图形流式常见图形 (histogram plot)适用于：单参数分析适用于：单参数分析流式常见图形流式常见图形 (dot plot)适用于：多参数分析适用于：多参数分析第二节第二节 流式细胞术

5、的科研应用流式细胞术的科研应用w分析群体细胞分析群体细胞w所需时间短所需时间短w多参数分析多参数分析w定性或定量定性或定量流式应用常见范围流式应用常见范围w细胞大小细胞大小w细胞的颗粒度细胞的颗粒度w细胞表面分子：细胞表面分子：cd 系列系列w细胞浆内分子：胞内细胞因子细胞浆内分子：胞内细胞因子w细胞核内分子：细胞核内分子：p53w细胞功能检测：细胞周期、凋亡细胞功能检测：细胞周期、凋亡抗体标记的方法抗体标记的方法抗体的选择抗体的选择w首选直接标记抗体首选直接标记抗体w荧光分子荧光分子 pe最强，适用于弱表达抗原最强，适用于弱表达抗原 fitc最便宜，适用于强表达抗原最便宜，适用于强表达抗原w

6、间接标记：间接标记：适用范围广适用范围广, biotin-avidin不适不适合弱抗原的检测合弱抗原的检测实验对照的设计实验对照的设计w空白对照：空白对照：allw阴性对照：阴性对照：常用同型抗体对照常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）（用于仪器校正）w阳性对照：阳性对照：检测阴性时检测阴性时空白对照和阴性对照的比较：空白对照和阴性对照的比较：实验标本的处理实验标本的处理w单细胞悬液的制备：胰酶消化单细胞悬液的制备：胰酶消化w抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应抗体或标记分子的染色：抗原抗

7、体反应w非特异结合的去除：洗涤和封闭非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体封闭：血清和同型抗体流式检测应用实例流式检测应用实例w凋亡凋亡w细胞内分子检测细胞内分子检测凋亡检测凋亡检测-每一步都有检测试剂盒每一步都有检测试剂盒细胞周期细胞周期g1mg2squiescent cellsg0细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞 sub-g0/g1 peaks - pi stainingcaspasesannexin v assay建议用于悬浮细胞建议用于悬浮细胞annexin v assay能够区分死亡与凋亡能够区分死亡与凋亡流式流式“tunel”intracel

8、lular cytokine-protocolsorting（细胞分选）（细胞分选）dimer x antigen specific t cell assay method for monitoring cellular response cba(cytometric bead array)traditional analysis - percent positivedetermination of the cd4 pe abc on lymphocytes 110100100010000linear fluorescence in fl2102103104cell and bead negl

9、ymph fl2;(49,000 abc)molecules pe per bead105第三节第三节 流式细胞术的临床应用流式细胞术的临床应用w白血病免疫分型白血病免疫分型whla-b27: 强直性脊柱炎强直性脊柱炎w淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群w造血干细胞计数：造血干细胞移植造血干细胞计数：造血干细胞移植w网织红细胞网织红细胞wpnh诊断（诊断（cd55、cd59）w血小板活化试验血小板活化试验流式细胞白血病免疫分型流式细胞白血病免疫分型流式细胞的免疫分型流式细胞的免疫分型w是白血病分型的重要指标是白血病分型的重要指标 fab标准，形态学和免疫表型结合标准，形态学和免疫表型结合w适合于白血病的

10、分型诊断，但不适合用适合于白血病的分型诊断，但不适合用于确诊是不是白血病。于确诊是不是白血病。wminimal residual diseases (mrd)fcm应用w1、细胞增殖周期测定和dna倍体分析w2、凋亡检测w3、免疫功能的检测w4、血液学应用w5、hla-b27的检测：用于诊断强直性脊柱炎。w6、其他：溶液中细胞因子的测量。w7、细胞分选 细胞增殖周期测定和dna倍体分析w1）细胞增殖周期：分为g0、g1、s、g2、m期。s期是dna合成期，在s期w内，dna进行复制，使细胞的dna含量由2倍体（2c 46条染色体）变为4倍w体（4c）。g1和g2期为dna合成前、后间期，此期无

11、dna的合成，但rna和w蛋白质进行合成。m期为有丝分裂期，在此期一个细胞分裂为2个细胞。w细胞内的92条染色体分裂成2组46条染色体，使每个细胞内具有46条染色w体。在m期分裂成两个子细胞之前，g2和m期细胞的dna含量均为恒定的4cw。m期以后部分细胞进入g1期，继续进行增殖，部分细胞进入g0期，即静w止期，不再继续增殖。因此，fcm分析一个群体细胞峰dna倍体与细胞周w期时，将dna含量直方图分为三部分，即g0/g1,s,g2/m期三个细胞峰。wg0/g1和g2/m细胞峰dna的含量成正态分布，s期细胞峰则是一个加宽的正w态分布。w2）利用dna的荧光染料，如pi（propidium i

12、odide碘化丙啶），与细胞内的dna结合，可反映细胞内dna含量。采用dna直方图显示。具有2c dna含量细胞为g0/g1期细胞，4c dna含量细胞为g2/m期细胞，dna含量介于两者之间的细胞为s期细胞。w3）dna倍体：主要比较g0/g1期细胞dna含量的变化。用dna指数（di）表示。wdna指数=测量样本g0/g1期dna含量/正常人淋巴细胞g0/g1期dna含量 以正常人淋巴细胞作为对照。w正常细胞dna指数为1.00，dna指数1，为超2倍体，1为亚2倍体，两者可统称为非整倍体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，实体肿瘤中出现频率较高。第四节 凋亡检测w1）fcm-dna检测（

13、dna亚g1峰的检测）：利用pi染色，检测具有亚g1期dna含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。其原理为在凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将dna降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的dna片段从细胞内流出，造成总体dna含量减少，成为亚2倍体。注：检测的凋亡细胞数代表晚期的凋亡细胞比例，且易受标本中的死细胞和碎片的干扰，影响结果的准确性。w可参看文章：whttp:/ 第五节 免疫功能的检测w（1）利用多参数流式细胞术，对pb中淋巴细胞比例，及淋巴细胞中t、b、nk细胞的比例，及t细胞亚群进行检测。如cd3+（总t细胞）；cd19+（总b细胞），cd3

14、-/（cd16+5（nk细胞）。3+/cd4+（th/ti）：辅助/诱导；cd3+/cd4+/cd5ra+：nave辅助/诱导t细胞；cd3+/cd4+/cd45r0+：记忆性辅助/诱导t细胞；d3+/cd8+（ts/tc）：抑制/杀伤；cd3+/cd8/45ra+：nave抑制/杀伤t细胞；cd3+/cd8+/cd45r0+：记忆性抑制/杀伤t细胞。胞内细胞因子的检测：cd4+/il-4+，th1细胞，cd4+/ifn-+。w（2）临床应用：原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判断、移植免疫检测等。第六节 fcmfcm在在血液学中的应用w1）白血病和淋

15、巴瘤的免疫分型，目前对白血病和淋巴瘤的诊断，国际上提出mic分型，即通过形态（m）、免疫分型（i）、细胞遗传学（c）检测，对白血病和淋巴瘤进行综合诊断，免疫分型是重要的检测项目之一。现在多应用多参数的流式细胞术，不同抗体分别被几种荧光素标记：第一荧光（fl1）：fitc（异硫氰酸荧光素，fluorescein isothiocyanate），fl2：pe（藻红蛋白，phycoerythrin）fl3：percp（多甲藻黄素叶绿素蛋白，peridinin chlorophyll protein），fl4：apc（别藻兰蛋白allophycocyanin,）w2）cd34+造血干/祖细胞的检测。主

16、要用于干细胞移植及基因治疗方面的检测。w3）活化血小板及网织血小板的检测，在栓塞性疾病，如脑血管和心肌梗塞的患者，可出现活化的血小板增多。而血小板减少的患者，如果出现网织血小板增多，则说明血小板减少的原因为血小板破坏过多所致。w4）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（pnh）的发病机制为x染色体上的pig-a基因发生突变，引起糖化肌醇脂（gpi）锚合成障碍，使gpi锚连蛋白缺乏，已证实的gpi锚连蛋白有10余种，用于pnh诊断的主要为cd55和cd59两种，如果在红细胞或wbc上出现cd55或/和cd59的减少，可诊断为pnh。w5）网织红细胞计数w6）白细胞分类计数第七节 其他应用w溶液中细胞因子的测

17、量: 利用吸附有特异性抗体的微球，与溶液中的细胞因子结合，而检测溶液中是否存在该种因子whla-b27的检测：用于诊断强直性脊柱炎。第八节 细胞分选 wfcm可将样本中所需要的细胞亚群从群体细胞中分离出来，即所谓分选(sorting)。被测细胞的任何参数均可作为分选的依据。分选的方式一般有静电分选和捕获管分选，分选方式不同则决定分选的速度，分选纯度一般可达99%以上。除细胞分选外还可进行染色体分选。w 分选的细胞可用于克隆化培养、原位杂交、分子生物学研究等。从孕妇外周血中分离富集胎儿有核红细胞用于产前诊断，染色体分选可用于基因诊断。w淋巴20-25%: t: 70%, b: 20%, nk:1

18、0%;w单核2-6%+w粒细胞:40-60%w有核红:20-25%正常bm各系细胞比率是白细胞（包括血小板、血管内皮细胞等）是白细胞（包括血小板、血管内皮细胞等）在正常分化成熟的不同阶段以及活化过程中在正常分化成熟的不同阶段以及活化过程中在这些不同谱系（在这些不同谱系（lineage）细胞胞浆或细胞）细胞胞浆或细胞膜表面出现或消失的标记，参与机体重要的膜表面出现或消失的标记，参与机体重要的生理和病理过程。八十年代在生理和病理过程。八十年代在who和国际和国际免疫学联合会免疫学联合会(iuis)组织下，将识别同一分组织下，将识别同一分化抗原的来自不同实验室的单克隆抗体归为化抗原的来自不同实验室的

19、单克隆抗体归为一个分化群一个分化群cd: cluster of differentiation/ cluster designation 白细胞分化抗原白细胞分化抗原1. 系列交叉系列交叉(cross-lineage): aml表达表达cd2,cd192. 表达不同步表达不同步(asynchronous): 早期与晚期抗原同时表达早期与晚期抗原同时表达3. 表达量异常表达量异常(over- or under-expression):4. 与细胞大小不匹配与细胞大小不匹配(abnormal light scatter profile):如大如大cd2+细胞或小细胞或小cd13+细胞细胞al免疫表

20、型特点免疫表型特点: 紊乱表型紊乱表型 鉴别淋髓系列鉴别淋髓系列 区分亚型区分亚型 双表型、杂合型双表型、杂合型 mo、m7、aul 提示细胞遗传学异常提示细胞遗传学异常 部分与预后相关部分与预后相关 mdr监测监测al免疫表型检测意义免疫表型检测意义gatingfcm设门法wfsc/ssc:不能将淋巴、单核及幼稚细胞区分开wcd45/ssc:cd45是wbc抗原,rbc.plt为阴性。cd45在成熟细胞表达强，幼稚细胞表达弱。在淋巴，单核及粒细胞表达强度不同。优点：能将淋巴单核及幼稚细胞区分开，特异分析白血病细胞免疫表型。 r2r3r4r5r6正常血细胞分化发育过程中免疫标志变化特点以及白血

21、病细胞免疫标志特点常用各系血细胞cd抗原1、t系：cd1-cd8（cd6不用）2、b系：cd10, cd19-cd24, fmc73、髓系：cd11b,cd13-cd16,cd33,cd644、干祖：cd34, cd117, cd38, hla-dr正常b细胞标志cd19cd22tdtcd34cd10cd20fmc7cd23dri期+ii期+-+-/+iii期+-+iv期 +-+ 泛b标志：cd19,hla-dr,ccd79a/cd22幼稚b标志：cd34,tdt,cd10成熟b标志：cd23,fmc7b-all的分型亚型cd19cd34tdtcd10cylgsmig急性早期b前体细胞白血病e

22、arly b-precursor all+-急性前b细胞白血病pre b-all+-/+-急性b细胞白血病b-all+-/+正常t细胞标志：根据在胸腺内发育阶段分类cd7cd2cd5cd34cd1acd3c/mcd4cd8i期+/-ii期+-+/-iii期+-+/+iv期 +-+/+/-+/-泛t:cd2,cd5,cd7,ccd3幼稚t:cd34,tdt,cd1a,cd4/8成熟t:cd3,cd4,cd8t-all的分类分型cd7cd2tdtcd3c/m急性早期t前体细胞白血病early t precursor all+-+/-急性t细胞白血病t-all+-+/+t-all特点：1，幼稚t细胞

23、数量增多：cd34+,tdt+2，泛t标志丢失3，cd4/8双阳或cd4/8单阳正常单核细胞标志w全单核细胞标志：cd33,cd13,hla-drw幼稚单核细胞标志：cd34,cd117w成熟单核细胞标志：cd14,cd64hla-drcd33cd13cd34cd117cd14cd64幼稚单+-成熟单+-+正常粒细胞标志cmpocd13cd34cd117hla-drcd33cd11bcd15cd64cd10幼稚粒+ +-成熟粒+-+全粒细胞标志：cd13,cd33,cmpo幼稚粒细胞标志：cd34,cd117,hla-dr成熟粒细胞标志：cd15,cd11b,cd10,cd64成熟粒、单核细胞主要区别成熟粒细胞：cd33+ hl