Ch 重组DNA技术PPT教学课件

1、5.1 5.1 概述 DNA克隆克隆(DNA cloning)：应用酶学的方法，在：应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复结合成一具有自我复制能力的制能力的DNA分子分子复制子，继而通过转化或转复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。分子的过程。DNA克隆又称基因克隆（克隆又称基因克隆（gene cloning）。）。 基因工程（基因工程（genetic engineering）：实现基因克：实现基因克隆所

2、采用的方法及相关的工作。又称重组隆所采用的方法及相关的工作。又称重组DNA技技术（术（recombinant DNA technology）第1页/共48页5.1.1 克隆体系：目的基因、载体DNA、工具酶、宿主细胞等 目的基因（target gene）：cDNA或基因组DNA 载体(vector)：质粒、噬菌体、柯斯质粒载体、病毒和人工染色体等 cDNA （complementary DNA）：指体外经反转录合成的，与RNA （常指mRNA）互补的单链DNA,单链cDNA进而合成双链cDNA。基因组DNA（genomic DNA）：代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列，称为基因组

3、DNA。第2页/共48页质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，在细胞中可以独立进行复制并在细胞分裂时恒定地传给子代细胞。 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease): 存在于细菌体内，能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶。 工具酶：限制性核酸内切酶、连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端聚合酶、RNA酶、DNA酶，等 常用的是IIII类限制性内切酶 许多限制性核酸内切酶IIII的识别序列属于回文结构第3页/共48页配伍末端（配伍末端（compatible end）：不同限制性内切酶产）：不同限制性内切酶产生的相

4、同粘性末端生的相同粘性末端 DNA聚合酶聚合酶：DNA复制复制 DNA连接酶连接酶T4 连接酶：可用于粘端与平端的连接连接酶：可用于粘端与平端的连接 宿主细胞宿主细胞：大肠杆菌、酵母、动物细胞：大肠杆菌、酵母、动物细胞 第4页/共48页5.1.2 DNA克隆的基本过程克隆的基本过程 分、切、接、转、筛、表达分、切、接、转、筛、表达“分分”：目的基因及载体的制备：目的基因及载体的制备 分离基因的方法：化学合成、分离基因的方法：化学合成、PCR、基因组文库、基因组文库、cDNA文库文库 聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）：）：在反应体系中加入模

5、板在反应体系中加入模板DNA、dNTP、特别设计的特、特别设计的特异引物及耐热的异引物及耐热的DNA聚合酶（常用聚合酶（常用Taq酶），经多次酶），经多次变性、退火、延伸循环反应，使目的变性、退火、延伸循环反应，使目的DNA呈指数合呈指数合成的过程成的过程 第5页/共48页cDNA文库文库(cDNA library)：以：以mRNA为模板，利用为模板，利用反转录酶合成与反转录酶合成与mRNA互补的互补的DNA，再复制成双链，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有体菌包含了所有cDNA信息，总称信息，总称cDNA文库文库

6、 。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)：利用限制：利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组有基因组DNA信息，总称基因组信息，总称基因组DNA文库文库 第6页/共48页 常用载体：质粒、噬菌体、病毒常用载体：质粒、噬菌体、病毒DNA 克隆载体（克隆载体（cloning vector）：用于目的基因的克隆、）：用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等扩增、序列分析和体外定点

7、突变等 表达载体表达载体(expression vector)：用于在宿主细胞中表达：用于在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物外源目的基因，获得大量表达产物 “切切”：限制性内切酶切割目的基因和载体：限制性内切酶切割目的基因和载体DNA “接接”：重组体的构建：重组体的构建 “转转”：重组：重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞 转化（转化（transformation）：将质粒或其它外源）：将质粒或其它外源DNA导导入宿主细胞入宿主细胞(常用大肠杆菌常用大肠杆菌)，并使其获得新的表型的，并使其获得新的表型的过程过程 第7页/共48页 转染（转染（transfection）：将外

8、源）：将外源DNA导入真核细胞的导入真核细胞的过程过程 感染（感染（transfection）：以）：以l l噬菌体、柯斯质粒和病毒噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。也称为转导（并在细胞内扩增。也称为转导（transduction） “筛筛”：筛选出含重组：筛选出含重组DNA的受体细胞的受体细胞 直接选择法：遗传标记直接选择法：遗传标记【抗药性标志选择、营养缺抗药性标志选择、营养缺陷型的互补筛选法及分子标记（陷型的

9、互补筛选法及分子标记（PCR、分子杂交）、分子杂交）】 非直接选择法：免疫化学法、酶联免疫检测法非直接选择法：免疫化学法、酶联免疫检测法 第8页/共48页“表达表达”：使克隆基因在宿主细胞中复制、表达：使克隆基因在宿主细胞中复制、表达 第9页/共48页5.2 载体 5.2.1 质粒载体第10页/共48页质粒载体第11页/共48页质粒载体理想载体的条件： 1、具有自主复制能力； 2、具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体DNA分开； 3、分子量相对较小，能够容纳目的基因； 4、具有较多单一限制性内切酶位点； 5、有一个或多个筛选标记； 6、具有较高的遗传稳定性。 第12页/共48页 质粒载体19

10、77年由Boliver等人自E.coli的天然质粒建成。1、克隆载体第13页/共48页An example of an E. coli expression vector. 质粒载体2、表达载体第14页/共48页5.2.2 噬菌体载体第15页/共48页5.2.3 其它类型载体质粒（cosmid）逆转录病毒载体Ti质粒第16页/共48页其它类型载体酵母人工染色体（YAC）第17页/共48页5.3 工具酶5.3.1 限制性核酸内切酶第18页/共48页限制性核酸内切酶第19页/共48页限制性核酸内切酶第20页/共48页限制性核酸内切酶第21页/共48页The interaction of EcoRI

11、 endo-nuclease with its target sequence. The dimeric enzyme (with its two subunits in gray and light blue) is shown bound to DNA. In the top view the DNA binding site is facing the viewer. In the bottom view the bound DNA is facing away from the viewer and is not visible. 限制性核酸内切酶第22页/共48页限制性核酸内切酶 第

12、23页/共48页限制性核酸内切酶 第24页/共48页工具酶工具酶 功功 能能 限制性内切酶限制性内切酶 识别特异序列、切割识别特异序列、切割DNADNA DNADNA连接酶连接酶 连接连接DNADNA片段片段 DNADNA聚合酶聚合酶I I 合成合成DNADNA 反转录酶反转录酶 合成合成cDNAcDNA 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 5 末端磷酸化末端磷酸化 末端转移酶末端转移酶 在在3 3 羟基末端进行多聚物加尾羟基末端进行多聚物加尾 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 切除末端磷酸基切除末端磷酸基 第25页/共48页5.4 基因工程的基本步骤1、分2、切3、接5、筛4、

13、转6、表达第26页/共48页基因工程的基本步骤第27页/共48页基因工程的基本步骤第28页/共48页基因工程的基本步骤第29页/共48页5.4.1 目的基因的获得第30页/共48页目的基因的获得OH 3 OH 3 OH 3 Oligo dT primerDouble-strand cDNAOH 3 TTTnT 5 TTTnT 5 3 OHAAAnA5 Poly A tailmRNAReverse transcriptase dNTPsTTTnT 5 AAAnA5 OH 3 cDNAAlkali digestion of mRNA templatecDNADNA polymerase IdNTP

14、sAAAnATTTnT 5 OH 3 AAAnATTTnT 5 5 3 S1 nucleaseSingle-stranded hairpin susceptible to S1 nucleasemRNAC. cDNA文库的建立第31页/共48页目的基因的获得D. DNA聚合酶链反应（PCR）第32页/共48页5.4.2 重组体构建A. 第33页/共48页DNA片段A DNA片段B 535A G A T C T3353T C T A G A5 不同的限制性内切酶水解混合后经DNA连接酶连接BamHI BglII G A T C T A G A T C TA 粘端配伍末端连接第34页/共48页第35页/共48页Complementary homopolymeric tails are added to the ends of the two fragments to be joined. The optimal substrate for terminal transferase is the 3 OH at the end of a single strand of DNA at least three nucleotides long. 粘端的生成第36页/共48页第37页/共48页5.4.3 重组体导入细胞导入 直接 诱导 (理化因素)第38页