第四章2基因工程

1、基 因 工 程目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建c pcr法b cdna法a 鸟枪法d 化学合成法e 基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建 基因工程或dna重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。n 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：n 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从

2、基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；n 另一类是利用pcr扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。a 鸟枪法鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组dna片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离 鸟枪法克隆目的基因的基本战略染色体dna的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开， 大小不可控 部分酶切： 片段长度可控

3、，含有粘性末端，目的基因完整 与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为转化受体细胞 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立） 鸟枪法操作的改进使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体dna，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重

4、组子中目的重组子的出现频率 使用特征性限制性内切酶切开染色体dna 鸟枪法操作的改进例如，已知某目的基因位于1.8 kb的sali片段中，将染色体dna用sali切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收dna片段，然后与载体进行拼接在连接前将dna片段进行分级分离 2.0 kb1.6 kb1.8 kb鸟枪法操作的改进冻融法滤纸法吸附法低融点凝胶法溶解法凝胶dna片段回收技术 鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构b cdna法法 cdna法克隆

5、目的基因的基本战略cdna法分离目的基因的基本程序cdna法法克隆目的基因的局限性cdna基因克隆基因克隆 cdnacdna文库是指得到文库是指得到足够多足够多的的分别分别克隆的克隆的cdnacdna片段，汇集这些克隆应包含某种细胞中各片段，汇集这些克隆应包含某种细胞中各种种mrnamrna的相应顺序，每种顺序至少有一份拷贝的相应顺序，每种顺序至少有一份拷贝，这种克隆片段的汇集体称为某种细胞的，这种克隆片段的汇集体称为某种细胞的cdnacdna文库。文库。 cdna librariescdna librariesmrna isolation, purificationcheck therna

6、integrity fractionate and enrich mrna synthesis of cdna treatment of cdna ends ligation to vectorcdna文库文库1. 1. 没有原核生物的没有原核生物的cdna cdna 文库文库 原核生物的原核生物的 mrna mrna 非常不稳定；非常不稳定； 原核生物的基因组文库比较容易构建，原核生物的基因组文库比较容易构建，能包含所有基因的序列。能包含所有基因的序列。2.2.cdna cdna 文库对于真核生物的基因分析文库对于真核生物的基因分析 cdnacdna文库是只含有编码蛋白的基因文库文库是只含有

7、编码蛋白的基因文库 cdnas cdnas 没有内含子没有内含子 基因可以在基因可以在e. colie. coli 中直接表达中直接表达 用于新基因的鉴别用于新基因的鉴别 组织或特殊类型细胞（基因的特异表达）组织或特殊类型细胞（基因的特异表达）cdna 文库文库cdna cdna 文库文库- -mrna mrna 分离分离 大部分真核生物的 mrnas 有 3 poly（ a ）尾巴 oligo (dt) 能与poly(a) 尾巴互补，由此来获得mrna.aaaaaaaaaan5 cap5 cap1. 1. 传统的分离方法是用oligo (dt)-纤维素柱分离总rna2.2. 把oligo(d

8、t) -磁珠同总rna混合，在强磁场下分离mrna3.3.用蔗糖梯度离心mrna核糖体复合体（溶解细胞）来分离mrna三种三种分离mrna的方法用纤维素纯化poly(a)mrna的流程图确定确定 mrna mrna 没被降解没被降解 方法:mrnamrna的翻译的翻译 : 用体外蛋白质合成检测mrnas 。（麦胚无细胞转译体系或兔网织细胞裂解物转译体系） 通过凝胶电泳分析通过凝胶电泳分析mrnas mrnas : 用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳cdna cdna 文库文库- - 检测检测mrnamrna的完整性的完整性克隆特殊的克隆特殊的 mrnasmrnas克隆一个特殊的基因比建立完整的cdn

9、a文库更有用凝胶分离凝胶分离: : 通过琼脂糖凝胶电泳回收 mrnasmrnas（根据（根据mrnamrna的大小）的大小） 富集富集: : 通过杂交来实现cdnacdna 的合成的合成: :第一链第一链 的合成的合成: : mrna, mrna, 反转录酶，反转录酶，oligo(dt) oligo(dt) ， 核酸末端转移酶，核酸末端转移酶，dntpsdntps 1. oligo(dt) 1. oligo(dt) 引导的引导的cdnacdna合成法合成法 2. 2. 随机引物随机引物引导的引导的cdnacdna合成法合成法第二链的合成第二链的合成: : 根据在第一链3-3-末端加尾末端加尾

10、（c c），用补充引物合成第二链），用补充引物合成第二链 cdna法克隆目的基因的基本战略mdnacdna第一链的合成 5ppp5g g aaaaaaaaaaaaaaoh 35ppp5g g aaaaaaaaaaaaaaoh 3ttttttttttttttp 55ppp5g g aaaaaaaaaaaaaaoh 3ttttttttttttttp 5cdna第一链引物退火逆转录酶dntpscdna第二链的合成 煮沸naoh自身引导法：获得的双链cdna 5端会有几对碱基缺失aaaaaaaaaaaaaa5ppp5g g aaaaaaaaaaaaaaoh 3ttttttttttttttp 5tttt

11、ttttttttttp 5ttttttttttttttp 5aaaaaaaaaaaaaaoh 3ttttttttttttttoh 3klenowdntpss1cdna第二链的合成 dnapol dntpsrnaesh置换合成法：获得的双链cdna 5端也会有几对碱基缺失5ppp5g g aaaaaaaaaaaaaaoh 3ttttttttttttttp 5aaaaaaaaaaaaaap 55s1 aaaatttoh 3ttttttttttttttp 55ttttttttttttttoh 3aaaaaaaaaaaaaa 55tttttttttttttt 33t4-dna ligasecdna第二

12、链的合成 dctptdt引导合成法：获得的双链cdna 能保留完整的5端序列5ppp5g g aaaaaoh 3tttttp 53 ho5ppp5g g aaaaacccccccoh 33 hoccccccctttttp 53 hoccccccctttttp 53 hoccccccctttttp 55 pggggggg3 hoccccccctttttp 55 pgggggggaaaaaoh 3naoh退火klenowdntpscdna法克隆目的基因的基本战略双链cdna的克隆 双链平头的cdna通常可以使用下列三种方法克隆入载体中： 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接

13、同聚物尾，最好是at同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和s1核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收 cdna法分离目的基因的基本程序完备分离程序 提取细胞总mrna，合成总cdna，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子 筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于mrna分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子viii基因等 cdna法分离目的基因的基本程序特异分离程序 提取细胞总mrna，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标mrna，由此合成双链cdna，

14、然后进行克隆 特异分离程序较适用于mrna丰度极高的目的基因克隆如血红蛋白基因等 cdna法分离目的基因的基本程序差异分离程序 利用两组细胞mrna种类的差异，分离克隆差异mrna所对应的cdna，因而这种程序较适用于分离克隆新基因 例如：正常的大鼠fr3t3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能 差异分离程序 多瘤病毒感染的fr3t3细胞正常的fr3t3细胞总mrna总mrnacdna双链cdna单链cdna提取mrna合成cdna合成第二链克隆提取mrna共价交联上柱原位杂交病毒诱导表达的基因cdna克隆cd

15、nacdna克隆的优越性克隆的优越性 1. 1. 以以mrnamrna为材料；为材料； （一些（一些rnarna病毒，不经过病毒，不经过dnadna中间体，对其研中间体，对其研 究，究，cdnacdna是唯一可行的方法）是唯一可行的方法） 2. 2. 基因文库的筛选比较简单易行；基因文库的筛选比较简单易行； 3. 3. 由于每一个由于每一个cdnacdna克隆都含有一种克隆都含有一种mrnamrna序列，序列， 在选择中出现假阳性的几率比较低；在选择中出现假阳性的几率比较低； 4. 4. 克隆在细菌中表达的基因，用作基因序列的测定，克隆在细菌中表达的基因，用作基因序列的测定， 和发育过程中或组

16、织中基因特异表达和发育过程中或组织中基因特异表达 cdna法克隆目的基因的局限性并非所有的mrna分子都具有polya结构 细菌或原核生物的mrna半衰期很短mrna在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因 c pcr法目的基因的克隆与基因文库的构建 pcr（polymerase chain reaction）法，又称为聚合酶链反应或pcr扩增技术，是一种高效快速的体外dna聚合程序 使用pcr法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或dna片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必 需的双引物 pcr法定向扩增目的基因的基本原理55目的基因5变性加热55

17、引物退火55底物聚合5555加热变性5555555555555555555555555退火 引物底物聚合加热变性引物退火底物聚合123 由taq dna聚合酶扩增的pcr产物中，其3末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是a，因为taq dna聚合酶对datp具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取tdt末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的t载体克隆 pcr克隆目的基因的基本程序55aatt55pcr扩增产物t 载体t7lacz mcsoriaprd 化学合成法目的基因的克隆与基因文库的构建化学合成法的基本战略化学合成的单元操作dna化学合成的用

18、途化学合成法的基本战略全基因合成化学合成目的基因的前提条件是基因的dna序列已知，有三种战略：小片段粘接法： 混合退火根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链dna小片段t4-dna连接酶连接克隆入合适的载体 化学合成法的基本战略全基因合成补钉延长法： 混合退火根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链dna小片段以及20-30碱基长的单链dna中片段t4-dna连接酶连接克隆入合适的载体 klenow酶聚合化学合成法的基本战略全基因合成大片段酶促法： 混合退火根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链dna片段t4-dna连接酶连接克隆入合适的载体 kl

19、enow酶聚合化学合成法的基本战略全基因合成 上述三种方法各有利弊： 化学合成dna的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高； 在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的dna单链大片段的总收率只有7.7%化学合成法的基本战略探针等寡聚核苷酸合成 在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸氨基酸序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其编码的dna序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cdna法得到的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子 由

20、于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时必须考虑下列问题：生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间探针内部不应出现可能的互补区域化学合成法的基本战略探针等寡聚核苷酸合成某段连续的氨基酸序列cys met asp glu met lys arg asn ile所有可能的dna序列tgtatggacgaaatgaaaagaaacata c t gatg g g t t c cga cgg cgt cgc设计的简并探针序列tgtatggacgaiatgatgtatggatgaiatgatgcatggacgaiatgatgcatggatgai

21、atga a g此外还可以参考各种生物体的est数据库进行倾向性简并序列设计expressed sequence tag化学合成的单元操作 化学合成dna的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。 从反应机理上来讲，dna化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，dna合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的化学合成的单元操作ohghhhhoch2odmtpomenchmemechmemeoh

22、ghhhhoch2odmtpomenchmemechmemehdmt： 二甲氧基三苯甲基激活缩合氧化脱取代基玻璃珠连接臂dna化学合成的用途合成天然基因修饰改造基因 设计新型基因 制备探针、引物、接头 如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等 基因等e 基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建基因文库的基本概念基因文库的构建程序基因组文库重组克隆的排序基因组文库的构建基因组文库的构建 基因文库（基因文库（gene librarygene library）：）：用重组dna技术将某种生物细胞的总dna或染色体dna的所有片段随机地连接

23、在载体上，然后转移到适当的宿主细胞中通过细胞增殖而构成各个片段的克隆。当制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就称为某种生物的基因文库。同一定义也适用于线粒体或叶绿体的基因文库。由于制备片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的片段即可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近顺序。 基因文库的构建就是利用所谓的基因文库的构建就是利用所谓的“鸟抢法鸟抢法”，使基因组的使基因组的dnadna片段随机地插入适当的载体中，片段随机地插入适当的载体中，引入细胞进行大量繁殖而构建的。引入细胞进行大量繁殖而构建的。基因文库的基本概念基

24、因库与基因文库基因库（gene pool） 特定生物体全基因组的集合（天然存在） 基因文库（gene library or gene bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式基因组文库（含有全部基因） 存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为： cdna文库（含有全部蛋白质编码的结构基因） 基因文库的基本概念基因文库构建的基本战略用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体dna用cdna法构建cdna文库，材料来自mrna在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mrna种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cdna文库一般还有组织细胞的界定，如肝

25、组织cdna文库或胚胎组织cdna文库等。很显然， cdna文库的信息量远小于基因组文库 eukaryotes prokaryotes与载体连接 构建基因文库的基因组构建基因文库的基因组dnadna必须进行纯化后，必须进行纯化后，才能用来制备适用于载体插入片断大小的随机片断才能用来制备适用于载体插入片断大小的随机片断基因组基因组 dnadna的纯化的纯化 : 原核生物:直接从细胞中体取基因组dna去除蛋白（蛋白酶消化）去除蛋白（蛋白酶消化）, , 脂类和其它脂类和其它“杂质杂质”。真核生物真核生物 : :从细胞核中从细胞核中基因文库的构建程序基因组dna的制备 为了最大限度地保证基因在克隆过程

26、中的完整性， 用于基因组文库构建的dna在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的dna分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的dna片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高aaaa用常规方法制备的染色体dna的长度一般在100 kb左右如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有sds、蛋白酶k、rnase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb大小的dna片段基因文库的构建程序基因组dna的切割 用于基因组文库构建的dna片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是： 第一，保证dna片段之间存在部分重叠区 第二，保证dna片段大小均一超声波处理后的dna片段呈

27、平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：sau3ai或mboi等，这样dna酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的dna片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的dna片段随机连为一体！ 用于构建基因文库片段的产生大致有两种方法：用于构建基因文库片段的产生大致有两种方法： 一、限制性内切酶完全消化基因组dna这个方法有两个特点：这个方法有两个特点： 1、假如所需的基因含有所用限制酶的识别位点，那么这一基因将被克假如所需的基因含有所用限制酶的识别位点，那么这一基因将被克隆在两个或数个片段中，给研究带来一定的困难。隆在两个或数个片段中，给研究带来一

28、定的困难。 2、一般常用的限制酶大多识别六个一般常用的限制酶大多识别六个bpbp序列，切割序列，切割dnadna所产生的片段的所产生的片段的平均大小相对比较小（约平均大小相对比较小（约4kb4kb即即4 46 64096bp4096bp），因此整个基因文库要含），因此整个基因文库要含有非常大量的重组体，这样应用分子杂交法进行筛选就十分费事费时。有非常大量的重组体，这样应用分子杂交法进行筛选就十分费事费时。虽然可以用限制虽然可以用限制酶进行部分消化，产生约酶进行部分消化，产生约20kb20kb的片段，但这种方法必的片段，但这种方法必须掌握好酶解的条件。须掌握好酶解的条件。 hae 、 alu 二

29、、机械随机切割二、机械随机切割 这种方法可以制备大片段的这种方法可以制备大片段的dnadna（用噬菌体（用噬菌体作载体约作载体约20kb20kb，以，以cosmidcosmid作载体约作载体约45kb 45kb ），从而克服上述的两处缺点。但），从而克服上述的两处缺点。但是这种方法的不是之处是：所制备的片段的末端顺序是随机的是这种方法的不是之处是：所制备的片段的末端顺序是随机的，还必须经过末端修复，人工制造接头等手续才能与载体，还必须经过末端修复，人工制造接头等手续才能与载体进行连接。进行连接。 用于基因文库构建的载体常用噬菌体用于基因文库构建的载体常用噬菌体或或cosmidcosmid载体，

30、因为它载体，因为它们的容量比较大，可克隆大片段们的容量比较大，可克隆大片段的的dnadna。虽然。虽然cosmidcosmid载体比载体比载体的容量大，但由于文库的保存（载体的容量大，但由于文库的保存（cosmidcosmid载体在载体在e.colie.coli中，中， 载体在噬菌体中）载体在噬菌体中） 比比cosmidcosmid容易容易，因此，因此载体用的更多些载体用的更多些。文库的大小文库的大小 ( (确定有足够的克隆数确定有足够的克隆数) ) 必须包括一定数量的重组子才可能克隆基因组中的任必须包括一定数量的重组子才可能克隆基因组中的任何碱基序列。何碱基序列。计算重组子数量的公式：计算重

31、组子数量的公式：n = ln (1-p) ln (1-f) p: p: 重组体群体中出现目的基因的序列的几率（一般期望重组体群体中出现目的基因的序列的几率（一般期望99% 99% ） f : f : 限制片断的平均大小与基因组限制片断的平均大小与基因组dnadna总量之比总量之比 nn：一个完整基因文库所应包含的重组：一个完整基因文库所应包含的重组dnadna的转化子的克隆数的转化子的克隆数基因文库的基本概念基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数n之间的关系可用下式表示：n = ln ( 1 p ) / ln ( 1 f )其中：

32、 p = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率 f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因组的大小 例如，人的单倍体dna总长为2.9 x 109 bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆for example : 期望值为0.99，插入片断为20kb20kb的的 e.coli (4.6106 bp) 和 human (3109 bp) 基因组的克隆数的计算n e.coli= =1.1 103 ln( 1-0.99) ln1-(2104/4.6106)nhuman=

33、 = 6.9 105 ln(1-0.99) ln1-(2 104/3 109) 这个例子说明用质粒载体（插入片断5-10kb ）就可以建立很好的原核生物基因文库，只需要几千个克隆；而真核生物则需要更大承载能力的载体。 有一些序列不能被克隆example: 1. 序列缺乏酶切位点; 2.目的基因包容在一个其大小范围超出载体承载能力的dna片断上 too long for the vector used基因文库的基本概念基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆克隆与克隆

34、之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选基因文库的构建程序载体和受体的选择 出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-dna或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用yac或bac载体l-dna 由于绝大多数真核生物的mrna小于10 kb，因此用于cdna文库构建的载体通常选质粒 上述几种载体的最大装载量如下：质粒考斯质粒15 kb25 kb45 kbbac300 kbyac400 kb 用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌基因文库的构建程序从基因文库中筛选目的基因 大型基因

35、组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮操作步骤基因文库的构建程序从基因文库中筛选目的基因密集铺板（1-10万）杂交挖取铺板铺板目的重组克隆基因文库的构建程序基因文库构建的技术性问题在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：严禁外源dna片段之间的连接！为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合： 将待连接的dna片段根据载体的装载量分级分离用碱性磷酸单酯酶除去dna片段的末端磷酸基团 用tdt酶在dna片段

36、的末端上增补同聚尾末端 基因组文库重组克隆的排序 大型基因文库（包括人的基因文库）的构建在技术上并不十分困难，如果一个yac基因文库的插入片段总和为整个基因组的十倍以上时，一般就能从基因文库中调出任何一段dna序列。然而基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排列成一个像天然染色体dna上所表现出的信息顺序。这项工作的工作量可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后期制作基因组文库重组克隆的排序 将单一的yac克隆插入dna片段用限制性内切酶分布均匀地水解成若干片段，末端标记同位素 然后再用sau3ai或mboi将末端标记的dna片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝胶电泳，每10个yac克隆走在

37、同一块板上，形成10个克隆的特征性dna指纹图谱 电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆dna的指纹图谱有部分相同的，则其两个yac片段就有互相重叠的可能性，于是这两个yac克隆的dna片段克隆在染色体上是排列一起的 酶切片段末端标记法酶切片段末端标记法hhhhs s sssssssssssss ssss单一克隆指纹图谱十克隆指纹图谱载体dna克隆dna基因组文库重组克隆的排序 将若干yac克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成20种不同序列的短探针，其序列是随机的 用20种探针随机定位杂交（一对一）20份yac克隆薄膜 如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这两个克隆有可能是相互

38、重叠的。若将杂交阳性结果记为“1”，而阴性结果记为“0”，可清晰地列成一张表，最终排出上述yac克隆的排列顺序 随机探针联合杂交法0102030405060708091011121314151617181920a b cd e fg01 02 03 04 0506 07 08 09 10 1112 13 14 15 16 17 18 19 20dabcefg11111111111111111111111111111101 04 12 06 1314 02 14 07 19 1115 05 08 16 03 10 09 20 18dabcefg11111111111111111111111111

39、1111fcadgeb基因组文库重组克隆的排序 从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在0.5 - 2.0 kb范围内 分别以上述亚克隆dna片段为探针，杂交同一基因文库，杂交阳性克隆中的插入dna片段必定与起点克隆所含的dna片段连锁在一起 然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至线型染色体dna的端点 染色体走读法（chromosome walking）染色体走读法（chromosome walking）走读的起点克隆片段亚克隆旁测序列探针标记第一轮杂交阳性克隆阳性克隆第二轮杂交第二轮杂交染色体走读法（chromosome wal

40、king）走读的起点克隆片段克隆基因的分离与筛选克隆基因的分离与筛选 1.应用核酸探针 2.应用差别杂交或扣除杂交法 3.应用mrna差别显示技术 4.应用表达文库 5.酵母双杂交体系 步骤：步骤： 1. 1.获得探针获得探针2.2.转膜转膜3.3.杂交杂交transfer the dna in the plaque or colony to anylon or nitrocellulose membranephage dna bind to the membrane directly bacterial colonies must be lysed to release dna on the

41、 membrane surface. hybridization (in a solution containing nucleic acid probe)wash to remove unhybri-dization probe and visualize x-ray film(radio-actively labeled ) antibody or enzyme(modified nucleotide labeled line up the hybridizated region orrepeated hybridization (alkali treatment)探针的来源探针的来源 1

42、. 1. 某种生物实验体系中分离到的基因序列，可作为某种生物实验体系中分离到的基因序列，可作为从其它生物中从其它生物中分离相关基因分离相关基因的核酸探针。的核酸探针。 2.2.根据蛋白质家族保守性，合成核酸探针。根据蛋白质家族保守性，合成核酸探针。 功能相同或相近的蛋白质，存在着具有共同氨基功能相同或相近的蛋白质，存在着具有共同氨基酸序列的区段（保守区），酸序列的区段（保守区）， 往往由彼此相邻的往往由彼此相邻的6767个氨基酸组成。个氨基酸组成。 寡核苷酸探针的人工合成寡核苷酸探针的人工合成 1. 探针的长度探针的长度: 要使探针与目的基因序列严格互补，最少的探针长度要使探针与目的基因序列严

43、格互补，最少的探针长度1516个核苷酸，实验中为保证足够的特异性，通常使用个核苷酸，实验中为保证足够的特异性，通常使用1720个核苷酸。个核苷酸。 2. 简并性简并性: 根据蛋白质氨基酸组分合成的寡核苷酸探针，通常是根据蛋白质氨基酸组分合成的寡核苷酸探针，通常是混合物的形式。在这种探针库中，只有一种是与目的基混合物的形式。在这种探针库中，只有一种是与目的基因完全互补的。因完全互补的。 由于探针库中只有一种是与目的基因完全互补的，其它由于探针库中只有一种是与目的基因完全互补的，其它的探针有可能与不相关的片断杂交，产生假阳性信号。的探针有可能与不相关的片断杂交，产生假阳性信号。 1. 1.猜测体探

44、针猜测体探针 2.pcr-2.pcr-猜测体探针猜测体探针应用差别杂交或扣除杂交法应用差别杂交或扣除杂交法 分离克隆的目的基因分离克隆的目的基因差别杂交差别杂交（differential hybridizationdifferential hybridization） 又称差别筛选又称差别筛选 (differential screening )(differential screening ) 适用于分离经特殊处理而被诱发表达的适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mrnamrna的的cdnacdna。 扣除杂交扣除杂交（subtractive hybridization subtractive

45、hybridization ）又叫扣除又叫扣除cdnacdna克隆（克隆（ subtractive cdna cloningsubtractive cdna cloning） 通过构建扣除文库得以实现。通过构建扣除文库得以实现。差别杂交：差别杂交： 需要两种不同的细胞群体（目的基因正常表达需要两种不同的细胞群体（目的基因正常表达、目的基因不表达），分别制备两种不同、目的基因不表达），分别制备两种不同mrnamrna提取物，以两种总提取物，以两种总mrnamrna探针平行杂交，对有表探针平行杂交，对有表达目的基因的细胞总达目的基因的细胞总mrnamrna构建的克隆文库进行构建的克隆文库进行筛选。

46、筛选。差别杂交的局限性：差别杂交的局限性： 1. 1.杂交灵敏度低，对于低峰度的杂交灵敏度低，对于低峰度的mrnamrna尤为明显尤为明显 2.2.工作量大，重复性差，两套平行滤膜之间的工作量大，重复性差，两套平行滤膜之间的dnadna保有保有量有差别，导致杂交信号不一致。量有差别，导致杂交信号不一致。 扣除杂交：扣除杂交： 去除普遍共同存在的、或是非诱发产生的去除普遍共同存在的、或是非诱发产生的cdnacdna序列，从而使欲分离的目的基因的序列得序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集。到有效的富集。应用应用mrnamrna差别显示技术（差别显示技术（ddrt-pcrddrt-pcr

47、） 分离克隆的目的基因分离克隆的目的基因 (differential display reverse transcription polymerase chain reaction)原理原理： 用用3 -3 -端锚定引物和反转录酶合成端锚定引物和反转录酶合成cdnacdna的第的第一链；用一链；用3 -3 -端锚定引物和端锚定引物和5-5-端端10-mer10-mer随机引随机引物组成引物对，以反转录第一链为模板进行物组成引物对，以反转录第一链为模板进行pcrpcr扩增（扩增（ddrt-pcrddrt-pcr），在标准的序列胶中电泳），在标准的序列胶中电泳2323小时，可显示出小时，可显示出5

48、010050100条长度在条长度在1005000bp1005000bp之间的之间的dnadna条带。条带。3 -3 -锚定引物：锚定引物： p.liangp.liang等人设计合成了全部等人设计合成了全部1212种不同的引物，用种不同的引物，用以反转录以反转录mrnamrna，合成第一链，合成第一链cdnacdna。这种引物通常。这种引物通常叫作叫作3-3-端锚定脱氧核苷酸引物，并用端锚定脱氧核苷酸引物，并用5-t11mn5-t11mn或或5-5-t12mnt12mn通式表示。其中通式表示。其中mm为除了为除了t t以外的任何一种核以外的任何一种核苷酸（即苷酸（即a a、g g或或c c），而

49、），而nn则为任何一种核苷酸（即则为任何一种核苷酸（即a a、g g、c c或或t t），故），故mnmn共有共有1212种不同的排列组合方种不同的排列组合方式。式。mrna: 5-mrna: 5-nmnmaaaaaaaaaaaaaa-3(12aa-3(12种序列种序列) ) 3- 3-nmnmtttttttttttttttt-5 tt-5 5-5-随机引物随机引物： 10-mer10-mer，更好的同第一链结合，从而呈现出更多，更好的同第一链结合，从而呈现出更多种的种的mrnamrna。一般用。一般用2020种随机引物和种随机引物和1212种种3-3-端锚端锚定引物组成的全部定引物组成的全部

50、240240组引物对组引物对pcrpcr扩增后，所产生扩增后，所产生的大约的大约20 00020 000条条带，基本涵盖了在一定的发育阶条条带，基本涵盖了在一定的发育阶段某种类型细胞中所表达的全部的段某种类型细胞中所表达的全部的mrnamrna。 ddrt-pcrddrt-pcr（mrna differential disply reverse mrna differential disply reverse transcription polymerase chain reactiontranscription polymerase chain reaction） 由于在由于在cdnacdn

51、a群体中，代表特定细胞类型或发育群体中，代表特定细胞类型或发育阶段的阶段的mrnamrna的含量非常低，所以要把一种只在的含量非常低，所以要把一种只在某一阶段或某种细胞类型中表达、而在另一发育某一阶段或某种细胞类型中表达、而在另一发育阶段或某种细胞类型中不表达的目的基因分离出阶段或某种细胞类型中不表达的目的基因分离出来，就需要来，就需要pcrpcr扩增。扩增。基本过程：基本过程： 1. 1. 从一对处于不同发育阶段（或不同基因型）从一对处于不同发育阶段（或不同基因型）的细胞群体中分离总的细胞群体中分离总mrnamrna，并用，并用3-3-端锚定引物端锚定引物作反转录合成第一链作反转录合成第一链

52、cdna;cdna; 2. 2.用用5-5-端随机引物和端随机引物和3-3-端锚定引物组成的引物端锚定引物组成的引物对，在加入放射性同位素标记的对，在加入放射性同位素标记的dntpdntp的条件下，的条件下，以第一步反转录产物作模板进行以第一步反转录产物作模板进行pcrpcr扩增。扩增。 3.3.将扩增样品在变性的将扩增样品在变性的dnadna测序胶中进行电泳分离测序胶中进行电泳分离；4.4.将有关的差别表达的将有关的差别表达的dnadna条带从测序胶上切割下来条带从测序胶上切割下来回收其回收其dnadna片断；片断；5.5.胶块中的胶块中的dnadna量非常少，不能用于克隆，需进行二量非常少

53、，不能用于克隆，需进行二次扩增；次扩增；6.6.将克隆的特定的将克隆的特定的dnadna分别同基因组分别同基因组dnadna及总及总mrnamrna作作southernsouthern或或northernnorthern杂交，测序；杂交，测序；7.7.以此目的片断作探针从以此目的片断作探针从cdnacdna文库中或基因组文库中文库中或基因组文库中筛选全长的筛选全长的cdnacdna克隆或基因组克隆。克隆或基因组克隆。优点： 1. 1.可以同时比较多个样品表达的差异；可以同时比较多个样品表达的差异； 2.2.可以同时检测可以同时检测“上游上游”及及“下游下游”的基因；的基因； 3.3.检测灵敏度

54、高，所需样品少，经检测灵敏度高，所需样品少，经pcrpcr扩增一些低扩增一些低峰度的峰度的mrnamrna也可以被检测出来；也可以被检测出来； 4.4.结合使用了结合使用了pcrpcr和序列胶电泳分析两项技术，使和序列胶电泳分析两项技术，使本方法显得较单方便。本方法显得较单方便。局限性： 1.假阳性比例高（假阳性比例高（50%50%75%75%）；）； 同一长度的条带，含有多种同一长度的条带，含有多种dnadna序列；邻近条序列；邻近条带回收时，造成人为误差；带回收时，造成人为误差； mrna3-mrna3-端序列保守性高，而常用端序列保守性高，而常用3-3-端端cdnacdna作探针。作探针

55、。 2.2.扩增的差别条带分子长度比较短小（扩增的差别条带分子长度比较短小（110110450bp450bp）；）； 应用表达文库应用表达文库 分离克隆的目的基因分离克隆的目的基因表达文库分离克隆的目的基因表达文库分离克隆的目的基因 当没有可用的核苷酸序列供作筛选基因文库的当没有可用的核苷酸序列供作筛选基因文库的探针时，将探针时，将cdnacdna克隆在表达载体上，再导入大肠克隆在表达载体上，再导入大肠杆菌寄主细胞然后通过对蛋白质产物的鉴定，分杆菌寄主细胞然后通过对蛋白质产物的鉴定，分离克隆的真核目的基因。离克隆的真核目的基因。特点：1.表达的蛋白质以融合蛋白质的形式存在，其中原表达的蛋白质以

56、融合蛋白质的形式存在，其中原核蛋白质的氨基酸序列是整合在真核蛋白质的一核蛋白质的氨基酸序列是整合在真核蛋白质的一个末端，不易被原核细胞中的有关蛋白酶消化降个末端，不易被原核细胞中的有关蛋白酶消化降解，因而显得比较稳定，可以得到较高的表达水解，因而显得比较稳定，可以得到较高的表达水平。平。2. cdna片断必须置于启动子序列下游，在其控制片断必须置于启动子序列下游，在其控制之下；按正确的取向和读码结构插入，确保产生之下；按正确的取向和读码结构插入，确保产生正确的蛋白质。正确的蛋白质。 筛选的方法筛选的方法： 1. 1. 利用抗体筛选表达文库；利用抗体筛选表达文库； 2. 2. 测定蛋白质的功能；

57、测定蛋白质的功能； 3. 3. 用放射性同位素标记的、带有特定蛋白质结合用放射性同位素标记的、带有特定蛋白质结合位点的位点的dnadna片断作探针筛选表达文库。片断作探针筛选表达文库。将菌落或噬菌斑原位复制到膜上处理之后蛋白质暴露，与第一抗体温育漂洗未结合的抗体，加入经标记的第二抗体能与第一抗体结合2.测定蛋白质的功能测定蛋白质的功能 生物化学研究表明，存在生物化学研究表明，存在caca离子的条件下，离子的条件下，钙调蛋白能与许多种酶结合形成稳定的复合物。钙调蛋白能与许多种酶结合形成稳定的复合物。 将放射性同位素标记得钙调蛋白用作探针筛选将放射性同位素标记得钙调蛋白用作探针筛选cdnacdna

58、表达文库，鉴定能够表达出与它特异性结合表达文库，鉴定能够表达出与它特异性结合的目标蛋白质的阳性克隆。的目标蛋白质的阳性克隆。 3.3.用放射性同位素标记的、带有特定蛋白质结合位用放射性同位素标记的、带有特定蛋白质结合位点的点的dnadna片断作探针筛选表达文库片断作探针筛选表达文库 鉴定能够表达出与特定鉴定能够表达出与特定dnadna片断（片断（真核启动真核启动子中与转录因子结合的子中与转录因子结合的dnadna元件元件）结合的目标蛋）结合的目标蛋白质的克隆。白质的克隆。酵母双杂交体系酵母双杂交体系 （two-hybrid system）酵母双杂交体系又叫相互作用陷阱酵母双杂交体系又叫相互作用

59、陷阱 (interaction trap)(interaction trap) 有效的分离能与已知的靶蛋白质相互作用的蛋白质有效的分离能与已知的靶蛋白质相互作用的蛋白质的编码基因。的编码基因。 应用于真核基因地表达调控，细胞粘合因子间的应用于真核基因地表达调控，细胞粘合因子间的相互作用、信号转导通路以及细胞周期与分化、反式相互作用、信号转导通路以及细胞周期与分化、反式因子的鉴定与分离等研究因子的鉴定与分离等研究基本原理：基本原理： 许多真核生物的转录激活因子都是由两个结构上可以分许多真核生物的转录激活因子都是由两个结构上可以分开的、功能上相互独立的结构域组成（开的、功能上相互独立的结构域组成（

60、exampleexample）；）； 应用重组应用重组dnadna技术，也可以将来自同一个转录因子的技术，也可以将来自同一个转录因子的、或者两种不同转录因子的、分开的两种结构域，在体、或者两种不同转录因子的、分开的两种结构域，在体内重新组装成具有功能的转录因子，从而激活内重新组装成具有功能的转录因子，从而激活uasuas（上（上游激活序列）下游启动子调节的报告基因的表达。游激活序列）下游启动子调节的报告基因的表达。example: 酿酒酵母的半乳糖苷酶基因的转录激活因子酿酒酵母的半乳糖苷酶基因的转录激活因子gal4gal4，在，在nn端端1 1147147位氨基酸区段有一个结合域（位氨基酸区段