第二章分光光度法

1、1l分光光度法1概述2朗白比尔定律3显色反应4显色剂5测量误差及测量条件6示差分光光度法7分光光度计2 第一节第一节 分光光度法概述分光光度法概述l1、电磁辐射电磁辐射l光是电磁辐射。电磁辐射具有粒子的性质，也具有波动的性质，其波动性可用波长（）来表示。所谓波长即指在波传播路线上具有相同振动位相的相邻两点之间的距离。电磁辐射的粒子性的主要特征是每个光子具有能量，其与波长之间的关系为：l / 。chchch 3l电磁辐射按波长顺序排列，称为电磁波谱波谱区名称 波长范围频率范围(mhz)跃进能级类型 射线 0.0050.14nm6101421012核能级x射线0.000110nm310143101

2、0 内层电子能级远紫外光10200nm 310101.5109 内层电子能级近紫外光200400nm1.51097.5108原子及分子的阶电子或成键电子能级可见光 400750nm7.51084.0108原子及分子的阶电子或成键电子能级近红外光 0.752.5m4.01081.2108分子振动能级中红外光 2.550m1.21086.0106分子振动能级远红外光 501000m6.01063105分子转动能级4 2 2、吸收光谱、吸收光谱 电磁辐射是物质内部运动变化的客观反应，任一波长的光子能量与物质内能（原子的、分子的或原子核的）的变化e相对应，即 e / 5 3 3、比色法和吸光光度法比色

3、法和吸光光度法 利用比较溶液颜色深浅的方法来确定溶液中有色物质的含量，这种方法就称为比色分析法比色分析法。用眼睛观察比较溶液颜色深浅来确定物质含量的分析方法称为目视比色法。目视比色法。利用光电效应测量通过有色溶液后透过光的强度，求得被测物质含量的方法称为光电比色法。光电比色法。 分光光度法分光光度法是以棱镜或光栅为分光器，并用狭缝分出很窄的一条波长的光，并同样测量透过光的强度来求得被测物质的含量；由于光的波长范围窄，其测定的灵敏度，选择性和准确度都比比色法高。 6第二节第二节 朗伯比尔定律及其影响因素朗伯比尔定律及其影响因素 1 1、朗伯比尔定律朗伯比尔定律 实验发现透过光强度与有色溶液中吸收

4、物质的分子数量实验发现透过光强度与有色溶液中吸收物质的分子数量c以及透过溶液的厚度以及透过溶液的厚度l有关。其数学表达式如下：有关。其数学表达式如下： -log t/o =kcl 其中k为比例系数，其数值只取决于吸光物质的特性，而与吸收层厚度及浓度无关。式中又称为吸光度a，上式又可写为akcl； 上式称为朗伯比尔定律朗伯比尔定律，是紫外可见吸收法定量分析的基础。 7 2、吸光系数和摩尔吸光系数吸光系数和摩尔吸光系数 在-log t/o =kcl中，如果有色物质溶液的浓度c用gl表示，吸收厚度以cm表示，比例常数k称为吸光系数。如果浓度c用moll表示，吸收厚度以cm表示，则比例常数k称为摩尔吸

5、光系数。摩尔吸光系数的单位为l(mol.cm)。它表示物质的浓度为1摩尔升，液层厚度为1cm时溶液的吸光度。符号常用表示，因此朗伯比尔定律又可写成： acl 8员工队伍规划员工队伍规划现有员工队的描述未来的员工队伍预测差距分析 3 3、吸光度可加性原理吸光度可加性原理 某一波长的入射光通过几个相同厚度的不同溶液，其总的吸光度为各溶液吸光度之和。同样如果溶液中含有不同的吸光物质，只要各组分间没有相互作用，溶液的总吸光度为各组分吸光度之和。这就是吸光度可加性原理吸光度可加性原理。 吸光度可加性原理是十分有用的，例如进行光度分析时，试剂或溶剂有吸收，则可从所测总吸光度中直接进行扣除，这就是以试剂或溶

6、剂做空白的依据。9 4、影响朗伯比尔定律正确性的因素影响朗伯比尔定律正确性的因素 入射光非单色光 严格讲朗伯比尔定律只适用于单色光。但目前各种方法所得到的入射光，实际上是一定波长范围内的光，因而产生了对朗伯比尔定律的偏离。 溶液中的化学反应 溶液中的吸光物质常因离解、缔合、形成新的化合物或互变异构体等的化学变化而改变了浓度，因而导致对朗伯比尔定律的偏离。 漫射：当介质的微粒不太小的情况下，将发生漫射，如胶溶液、乳胶液和悬浮物等。这些溶液透过光的强度不仅与吸收物质的吸收有关，还与溶液的漫射性质有关。10 第三节第三节 显色反应及其影响因素显色反应及其影响因素 1、分光光度法对显色反应的要求、分光

7、光度法对显色反应的要求择性好、干扰少或干扰容易消除。敏度高。分光光度法一般用于微量组分的测定，故一般选择生成有色化合物的摩尔吸光系数高的显色反应。 有色化合物的组成恒定，符合一定的化学式。 有色化合物的化学性质应足够稳定，至少保证在测量过程中溶液的吸光度变化很小。 有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大。 11 2、影响显色反应的因素、影响显色反应的因素 显色剂的用量溶液的酸度 显色温度显色时间 溶剂 溶液中共存离子的影响 12 第四节第四节 显色剂显色剂 1、无机显色剂无机显色剂 无机显色剂在比色分析中已经应用不多，主要因为生成的络合物不够稳定，灵敏度和选择性也不高。目前主要应用较多的有硫氰酸

8、盐、钼酸铵和过氧化氢等。13 2、 有机显色剂有机显色剂 大多数有机显色剂与金属离子生成极稳定的鳌合物，而且具有特征的颜色，因此选择性和灵敏度都较高。不少鳌合物宜溶于有机溶剂，可以进行萃取比色，这对进一步提高灵敏度和选择性很有利。 有机显色剂大都是含有生色团和助色团的化合物。在有机化合物分子中，一些含有不饱和键的基团，它们能吸收大于200nm波长的光这种基团称为广义的生色团。14 1 1、测量误差、测量误差 许多误差来自吸光度的定量测定。光度测定过程包括两个阶段：第一阶段是化学过程，即利用各种化学反应将待测组分的溶液用适当的试剂处理，使待测组分转变为一定组成的化合物，包括有色化合物及各种络合物

9、；第二阶段是物理过程，即将经第一阶段处理的样品置于仪器中测定吸光度或绘制吸收光谱。因此，测定过程中的误差可以分成: 化学误差 仪器的误差 人为的误差第五节第五节 测量误差和测量条件的选择测量误差和测量条件的选择15 2 2、测量条件的选择、测量条件的选择 phph值的选择值的选择 在分光光度法的定量分析中，为了选择确定最适宜酸度，考虑到酸度值往往是最主要的影响因素，可用单因素实验法。常用的方法是：将具有不同ph值但含有同一量的被测物质的一系列溶液，于分光光度计上测量其相应吸光度值，然后以吸光度对溶液的ph或酸度作图，得一酸度曲线。该曲线中吸光度值最大且保持不变的区间所对应的ph值范围，即为待测

10、物质分光光度测定的最适宜酸度范围。 16溶剂的选择溶剂的选择 如果待测物质是显色测定，应尽量采用水作为溶剂以求简便，并防止分析人员长期使用某些有机溶剂而中毒。如果水相介质测定达不到分析目的时（例如灵敏度差、干扰无法消除等），则考虑使用有机溶剂或用萃取分光光度法。17温度的选择温度的选择 温度变化不大时，对分光光度法的影响甚微，故在定量分析中通常不必恒温。但若我们利用显色反应将待测物质转化为有色化合物进行测定，则温度对于显色反应速度可能有较大影响，故需控制适宜温度使反应进行完全，而且也必须考虑在该温度下待测物质、显色剂及有色络合物的稳定性。一般说来，显色反应多在室温下完成。对于速度较慢的显色反应

11、宜选择较高温度以缩短显色时间。对于不同的显色反应应选择各自的适宜显色温度。18 测定时间的选择测定时间的选择 有色化合物稳定的时间范围按下法确定：在加入显色剂后，连续测量和记录该溶液的吸光度值。并以吸光度值对时间作图绘出“时间曲线”。该曲线的平台区（即吸光度恒定不变的区间）所对应的时间区间即为该有色化合物稳定的时间范围。吸光度的测定应在此时间范围内尽快完成。 19 入射光波长的选择入射光波长的选择 根据朗伯比耳定律可知，在一定波长下，如果液槽厚度保持不变，则溶液的吸光度与溶液的浓度成正比。 a-log 1/t=cl 在实际应用中，通常借助吸收曲线来选择测定的适宜波长。所谓吸收曲线，就是使不同波

12、长的光透过某一固定浓度的溶液，测量其吸光度。然后，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图。所得曲线称为吸收曲线。吸光度值最大时的波长以最大表示，此波长即为测定时所选用的入射光波长，此时的摩尔吸光系数最大，测定灵敏度最高。但有时为避免干扰，不选择最大吸收波长，而选择其次的吸收峰为工作波长，这样虽然灵敏度不是最高，但能避免干扰，提高了方法的选择性。20 测量相对误差与吸光度的关系以及吸光度范围的控制测量相对误差与吸光度的关系以及吸光度范围的控制 分光光度计都有一定的测量误差，实践证明，吸光度在0.20.5内测量的相对误差最小。为使被测溶液的吸光度在0.20.5之内，可以用下面两种方法来调整。第一是控制

13、被测溶液的浓度，如改变取样量，改变溶液的浓缩倍数或稀释倍数。第二是选择不同的比色皿，比色皿的光程长度为10、30、50、100mm，吸光度小的要用长的比色皿，吸光度大的溶液要用光程短的比色皿。 21参比溶液的选择参比溶液的选择 参比溶液又称为空白溶液或比较溶液。 测量时选用何种参比溶液需视具体情况而定。如被测液中，仅显色剂与待测组分生成有色化合物，而显色剂与其他试剂无色，溶液中亦无其他有色离子时，可用蒸馏水或去离子水作为参比溶液。除显色剂与待测组分所生成的化合物有色外，溶液中亦存在其他有色离子，而且显色剂无色，此时可用不加显色剂的被测液作为参比溶液。当显色剂本身具有颜色时，则用显色剂溶液作为参

14、比溶液。如果显色剂和被测溶液都有色时，可将一份试液加入适当掩蔽剂，把被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂反应，再加入与被测溶液相等的显色剂和其他试剂，这样的参比溶液能消除共存组分的干扰。22 第六节第六节 示差分光光度法示差分光光度法 1 1、示示差法的原理差法的原理示差光度法和一般的光度法不同之处主要在于，示差法示差光度法和一般的光度法不同之处主要在于，示差法不是以空白溶液（不是以空白溶液（不含待测不含待测组分的溶液）作为参比溶液，而是组分的溶液）作为参比溶液，而是采用比待测溶液浓度稍低的标准溶液作参比溶液采用比待测溶液浓度稍低的标准溶液作参比溶液，然后测量待测溶液的吸光度，再从测得的吸光度求

15、出它的浓度。然后测量待测溶液的吸光度，再从测得的吸光度求出它的浓度。设用作参比的标准溶液浓度为设用作参比的标准溶液浓度为cs，待测溶液浓度为，待测溶液浓度为cx，且，且cxcs，根据朗伯，根据朗伯比耳定比耳定律得到律得到ax=cxb as=csb两式相减：两式相减：a相对相对=ax-as =b（cx-cs） =bc （2-12）实际操作是：用已知浓度的标准溶液作参比实际操作是：用已知浓度的标准溶液作参比 ，调节其吸光度为零（透光率，调节其吸光度为零（透光率100%），然后测量待测溶液的吸光度。这时测得的吸光度实际是这两种溶液吸光度的差值，然后测量待测溶液的吸光度。这时测得的吸光度实际是这两种溶

16、液吸光度的差值（相对吸光度）。从（相对吸光度）。从（2-12）式可知，所测得的吸光度差值与这两种溶液的浓度差）式可知，所测得的吸光度差值与这两种溶液的浓度差成正比。这样便可以把空白溶液为参比的稀溶液标准曲线作为成正比。这样便可以把空白溶液为参比的稀溶液标准曲线作为a对应于对应于c的工作的工作曲线，根据测得的曲线，根据测得的a找出相应的找出相应的c值，从值，从cx=cs+c，便可求出待测溶液之浓度，便可求出待测溶液之浓度，这就是示差法定量测定的基本原理。这就是示差法定量测定的基本原理。232 2、示差法的误差、示差法的误差how muchhow competent示差法标尺原理示差法标尺原理 按

17、一般分光光度法用试剂空白作参比溶液，测按一般分光光度法用试剂空白作参比溶液，测得溶液的透光率得溶液的透光率tx=6%，显然，这时的测量读数误，显然，这时的测量读数误差是很大的。采用示差法时，如果按一般分光光度差是很大的。采用示差法时，如果按一般分光光度法测得的法测得的ts=10%的标准溶液作参比溶液，使其透光的标准溶液作参比溶液，使其透光率从标尺上率从标尺上ts1=10%处调至处调至ts2=100%处，相当于把处，相当于把检流计上的标尺扩展到原来的十倍（检流计上的标尺扩展到原来的十倍（ts2/ts1=100/10=10），这样待测试液透光率原来为），这样待测试液透光率原来为6%，读数落在光度计

18、标尺刻度很密，测量误差很大，读数落在光度计标尺刻度很密，测量误差很大的区域，改用示差法测定时，透光率则是的区域，改用示差法测定时，透光率则是60%，读，读数落在测量误差很小的区域，从而提高了测定的准数落在测量误差很小的区域，从而提高了测定的准确度。计算出来的确度。计算出来的cx当然比较准确了。当然比较准确了。 24 第七节第七节 分光光度计分光光度计 1 1 、分光光度计、分光光度计 仪器简介仪器简介 任何类型的分光光度计都配备下列组成部分：光源、单色器、吸收池、检测器和显示仪表等。 国内比较常用的紫外可见分光光度计有单光束和双光束两种类型。25 仪器的装置原理仪器的装置原理 单光束装置 光源单色仪空白或样品吸收器检测器单光束分光光度计单光束分光光度计双光束装置切光器空白样品检测器双光束分光光度计双光束分光光度计26 试验室常用的721型分光光度计就是单光束的分光光度计，日立u2800、岛津的uv1700型分光光度计是双光束的分光光度计。 此外，双波长分光光度计在分析二组分混合物的同时测定、混浊