胚胎试验在水生动物中的应用

1、胚胎试验在水生动物中的应用李康2004.11.12建立灵敏、简便易行的检测方法 急性暴露试验虽然简便易行，但是其检测指标过于简单。 各种慢性毒性试验虽然提供多个检测终点，但存在实验周期长、费用高等不足。 而水生生物胚胎试验具有成本低、影响因素少、灵敏度高等方面的优势，受试物种也由最初的鱼类向多样化发展，其应用日益广泛。 鱼类成体和胚胎试验灵敏度比较胚胎试验 胚胎试验是又称胚胎毒性试验或胚胎致畸试验，指通过把胚胎暴露于受试化学物质而受到毒害作用，继而影响胚胎的发育、导致胚胎发育停滞或胚胎畸形。 广义上的胚胎试验包括所有以胚胎为材料的生物学试验，其内容涵盖形态学、发育学、毒理学、行为学等方面 。

2、鱼类 鱼类因具有繁殖力高、体外产卵、体外受精等生殖特性成为胚胎试验的最主要材料。拉丁名 通用名 文献 oncorhynchus mykiss rainbow trout 1,2 danio rerio zebrafish 1 brachydanio rerio zebrafish 2 cyprinus caprio common carp 1,2 oryzias latipes medaka 1,2 pimephales promelas fathead minnow 1,2 carassius auratus goldfish 1 menidia peninsulae tidewater s

3、ilverside 1,2 lepomis macrochirus bluegill 1 clupea harengus herring 1 gadus morhua cod 1 cyprinodon variegates sheepshead minnow 1,2 oncorhynchus kisutch coho salmon 2 oncorhynchus tschawytscha chinook salmon 2 salmo trutta brown trout 2 salmo salar atlantic salmon 2 salvelinus fontinalis brook tro

4、ut 2 salvelinus namaycush lake trout 2 esox lucius northern pike 2 catostomus commersoni white sucker 2 lepomis macrochirus bluegill 2 ictalurus punctatus channel catfish 2 jordanella floridae flagfish 2 gasterosteus aculeatus three-spined stickleback 2 menidia menidia atlantic silverside 2 用于胚胎试验的一

5、些种类斑马鱼 在实验室内对单一物质的毒性评价往往使用特定的种类，斑马鱼是其中一个重要代表。欧洲和美国都有已经建立的标准方法。zebrafish (danio rerio)甲壳类 草虾 草虾属广盐性甲壳动物 (3-31ppt)。 分布广(遍布美国东海岸和墨西哥湾的广大河口)。 个体小，只要水温，光照条件适宜，成体在实验室容易繁殖，只需分离不同发育阶段的胚胎即可用于试验。 尽管雌体产卵后抱卵于腹部直至孵化，胚胎离体后同样可以正常发育至孵化， 卵外被膜、胚胎透明而易于观察形态异常。grass shrimp (palaemonetes pugio)grass shrimp (palaemonetes

6、pugio)其它动物 the frog embryo teratogenesis assay-xenopus (fetax) 爪蟾 astm e 1563-98: standard guide for conducting static acute toscicity tests with echinoid embryos 海胆 medaka (oryzias latipes) blue crab (callinectes sapidus)试验动物的选取 被广泛利用 在实验室内容易大量培养 具有代表性和对受试物的敏感性 遗传背景清楚 试验动物的饲养也有相应的规范胚胎来源 多数鱼类产卵后离体孵化

7、，易于收集 。 一般可采用亲鱼人工催产结合人工受精的方法获得 。 对于如斑马鱼，青鳉等小型种类，在实验室内养殖相对容易，只需控制适当的物理条件，一般都能在试验当天取到足够数量的受精卵 。野外试验 收集鱼卵 在实验室完成剩余的发育过程，检测多个终点指标 。 原位暴露 在室内得到受精卵，用适当的装置放置于待检测的地点，全部发育过程或绝大部分发育过程在野外完成。 有抱卵习性的甲壳动物，胚胎在母体腹部附肢发育成幼体，通过捕捞带卵的母体，分离胚胎。分类 胚胎试验同样可分成急性毒性试验和亚急性毒性试验 。 急性毒性试验时间较短，其目的是获得有关受试物的初步毒性信息；亚急性毒性试验时间较长，可以贯穿胚胎发育

8、的整个时期。 暴露途径 可分为静态，半静态和流动等 ，或微注射的途径。 容器 透明的试验容器通常是首选，烧杯、培养皿、培养管是最普通的工具。 在野外暴露试验中，有黏性的受精卵可以被直接负在载玻片上，后者固定在特制的容器里 。溶剂 有机物质水溶性较差，则需要化学溶剂来助溶，但不适当的溶剂会影响结果的可靠性，化学溶剂本身对胚胎具有毒性甚至会和受试物产生协同作用，因此，选用适当的溶剂以及适当的浓度对结果的准确性都是有益的。 乙醇，丙酮，二甲亚砜是常用的溶剂，终浓度一般在0.1%以下 。0.5%(v/v)乙醇1%(v/v)乙醇对照grass shrimp (palaemonetes pugio)检测终

9、点 半致死浓度（lc50） 形态异常 孵化延迟 生化指标 遗传物质 生长指标半致死浓度（lc50） 半致死浓度（lc50） 死亡是检测的可见终点，初步反映受试物的毒性，是急性毒性试验的常用指标 。 孵化也可作为终点来反映受试物毒性，指标采用半效应浓度（ec50）。 在发育早期可以胚胎完整性来判断存活与否，当器官出现后则用器官的运动作为标准。 形态异常 形态异常是胚胎致畸试验的核心内容 。 斑马鱼和爪蟾胚胎发育过程中有多种可以观察的反应指标，被列入标准方法的观察终点。 对于甲壳动物，常见的观察结构有眼、卵黄形状、心脏、头部、肝胰腺 。 发育异常往往会导致导致终止发育或发育延迟，进而推迟孵化时间。

10、 b = brain; c = chorda; ch =chorion; e = ear; ed = edema; eud = ear underdeveloped; ey = eye; eyud= eye underdeveloped; nc = negative control; tnd = tail not detached;woey = without eyes; woh = without head; wos = without somitescatfish (clarias gariepinus) 对照 cd 和cu1%(v/v)乙醇对照grass shrimp (palaemon

11、etes pugio)孵化延迟grass shrimp (palaemonetes pugio)生化指标 随着胚胎发育的深入，器官逐渐建成，一些酶活性也显示出来，在暴露条件下酶活性的改变也可作为检测终点；受试物既可抑制酶活性，也可使一些酶出现应激性增强 。grass shrimp (palaemonetes pugio)受试物及其代谢物还可能对遗传物质产生影响 grass shrimp (palaemonetes pugio)生长指标catfish (clarias gariepinus)pacfic herring (clupea pallasi)应用现状 单一化学品毒性 环境检测项目 检测

12、土壤、沉积物污染 。 石油降解产物；溢油事件的生态恢复研究 。 混合性工业生产废水，生活污水的毒性，特别是致畸效应，被用于探讨遗传毒性。 名称 拉丁名 污染物 文献 inland silverside pacific herring sturgeon mummichog rainbowfish surf smelt fathead minnows medaka grunion carp flagfish pacific herring medaka fathead minnows rainbow trout catfish medidia beryllina clupea harengus o

13、ryzias latipes clupea harengus oncorhynchus mykiss 石油及降解产物 杀虫剂及除草剂 有机物 重金属 7 8,80 9 10 11 13 30 59，60，68 62 35 38 28 44 48 67 23 分类 化合物 终点 参考文献 抗真菌剂 石油 重金属 杀虫剂 有机化合物 chlorothalonil copper chromium aluminum methoprene endosulfan chlorpyrifos malathion fipronil anthracene pyrene -terthienyl methylene blue 2-methyl-1,4-naphthoquinone 4-nitroquinoline-n-oxide ethanol dimethylsulfoxide acetone 1 19 19，64 51 51 57 64 17,18 17,18 17,18 17,18 55 55 发展