郑州大学基因工程

1、抗菌肽基因工程表抗菌肽基因工程表达技术研究进展达技术研究进展抗菌肽简介抗菌肽简介n 抗菌肽是有机生物体用来抵御外来病原抗菌肽是有机生物体用来抵御外来病原体入侵而产生的具有抗菌作用的一类小分体入侵而产生的具有抗菌作用的一类小分子蛋白质子蛋白质, ,是很多种生物先天性非特异性防是很多种生物先天性非特异性防御系统的重要组分。御系统的重要组分。n自自20世纪世纪70年代瑞年代瑞典科学家典科学家boman等等从蚕蛹中分离得到从蚕蛹中分离得到第一个抗菌肽第一个抗菌肽天蚕素天蚕素(cecropin)以以来。人们陆续又在来。人们陆续又在昆虫、两栖类、水昆虫、两栖类、水生动物、及包括人生动物、及包括人在内的哺乳

2、动物甚在内的哺乳动物甚至植物及细菌等广至植物及细菌等广泛的生物谱中发现泛的生物谱中发现了了1700余种抗菌肽。余种抗菌肽。华桑抗菌肽活性收缩水华桑抗菌肽活性收缩水100ml 杭州露滋兰生物科技有限公司杭州露滋兰生物科技有限公司 功效：功效：调整皮肤调整皮肤的酸碱度的酸碱度平衡油脂平衡油脂杀菌消炎杀菌消炎收缩毛孔收缩毛孔防止皮肤防止皮肤皱纹和暗皱纹和暗疮的产生疮的产生1 1抗菌肽的分类及来源抗菌肽的分类及来源根据根据抗菌抗菌肽的肽的结构结构可将可将抗菌抗菌肽分肽分为五为五类类单链无半胱氨酸单链无半胱氨酸(cys)的抗菌肽的抗菌肽,或由无或由无规则卷曲连接的两段规则卷曲连接的两段-螺旋组成的肽螺旋

3、组成的肽富含某些氨基酸残基，可分为富含某富含某些氨基酸残基，可分为富含某些氨基酸残基但不含些氨基酸残基但不含cys的抗菌肽和的抗菌肽和富含半胱氨酸的抗菌肽富含半胱氨酸的抗菌肽含一个二硫键的抗菌肽含一个二硫键的抗菌肽有两个或两个以上二硫键有两个或两个以上二硫键具有具有折叠结构的抗菌肽折叠结构的抗菌肽由其他已知功能较大的多肽衍生由其他已知功能较大的多肽衍生而来的具有抗菌活力的肽。而来的具有抗菌活力的肽。抗菌肽的来源抗菌肽的来源一般而言一般而言, ,抗菌抗菌肽可通过以下肽可通过以下3 3种途径获得种途径获得从生物体内直从生物体内直接提取纯化接提取纯化化学方法化学方法人工合成人工合成采用基因工采用基因

4、工程技术进行程技术进行抗菌肽人工抗菌肽人工表达表达n但是因为抗菌肽为生物体内诱导产生但是因为抗菌肽为生物体内诱导产生, ,含量较低含量较低, ,从生物体内直接提取难度大、效率低、对技术和从生物体内直接提取难度大、效率低、对技术和成本的要求高成本的要求高, ,难以规模化生产难以规模化生产, ,并且对于某些高并且对于某些高等生物或人类抗菌肽生产而言也不现实。随着多等生物或人类抗菌肽生产而言也不现实。随着多肽及蛋白质化学结构的进一步阐明和多肽合成技肽及蛋白质化学结构的进一步阐明和多肽合成技术的产生术的产生, ,人工合成具有生物活性的肽或肽段为抗人工合成具有生物活性的肽或肽段为抗菌肽的研究提供了很大方

5、便。菌肽的研究提供了很大方便。n诸多研究结果表明诸多研究结果表明,由于抗菌肽分子较小由于抗菌肽分子较小,化化学合成的抗菌肽表现出与天然抗菌肽一致学合成的抗菌肽表现出与天然抗菌肽一致的生物学活性的生物学活性,但化学合成的方法同样存在但化学合成的方法同样存在成本较高的问题成本较高的问题,限制了抗菌肽的推广应用。限制了抗菌肽的推广应用。现代基因工程技术的发展使借助基因工程现代基因工程技术的发展使借助基因工程技术大规模制备抗菌肽成为可能。技术大规模制备抗菌肽成为可能。2抗菌肽的基因工程表达抗菌肽的基因工程表达进行抗菌肽研究的两种表达体系进行抗菌肽研究的两种表达体系原核表达体系原核表达体系中大肠杆菌表中

6、大肠杆菌表达体系最具代达体系最具代表性表性真核表达体系有小球藻真核表达体系有小球藻表达体系、杆状病毒介表达体系、杆状病毒介导的昆虫表达系统、导的昆虫表达系统、酵母表达体系酵母表达体系, ,其中酵其中酵母表达体系用的最多母表达体系用的最多, ,是真核表达体系的代表是真核表达体系的代表2.1大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系n 由于大肠杆菌系统对许多蛋白质有较强由于大肠杆菌系统对许多蛋白质有较强的耐受能力的耐受能力,能较高水平地表达多种蛋白质能较高水平地表达多种蛋白质使之成为表达许多外源蛋白质的首选表达使之成为表达许多外源蛋白质的首选表达系统系统,所以大肠杆菌是应用于所以大肠杆菌是应用于dna重组技

7、术重组技术的主要宿主细菌的主要宿主细菌,在抗菌肽的表达研究中也在抗菌肽的表达研究中也得到了充分的应用。得到了充分的应用。n peng等将人等将人-防御素防御素2(hbd2)的基因插入到的基因插入到pet-32a(+)中构建融合表达载体中构建融合表达载体,以以e. coli bl21为为工程菌进行表达工程菌进行表达,纯化后的蛋白质具有抗菌活性纯化后的蛋白质具有抗菌活性,该该研究结果表明研究结果表明,应用基因工程技术可以大规模制备应用基因工程技术可以大规模制备抗菌肽。抗菌肽。rao等等(2005)采用串联表达的方式在大肠采用串联表达的方式在大肠杆菌中表达杆菌中表达hpab-取得成功取得成功,在在1

8、8个不同重复序个不同重复序列的串联表达体系中列的串联表达体系中,3个重复序列时蛋白质产量个重复序列时蛋白质产量最高最高,达到菌体总蛋白的达到菌体总蛋白的27.8%,相当于相当于(3.150.45) g/l湿菌。湿菌。n 包涵体可完全溶于包涵体可完全溶于8 mol/l的尿素的尿素,三聚体三聚体形式的形式的hpab-可用可用ni-nta亲和色谱分离亲和色谱分离,再用羟胺水解成独立的短肽。孙琦等再用羟胺水解成独立的短肽。孙琦等(2008)成功构建了串联表达成功构建了串联表达ralloferon-1的原核表的原核表达系统达系统,并在并在e.coli bl21de3中成功表达中成功表达,其其表达产物具有

9、与合成的表达产物具有与合成的alloferon-1和和alloferon-1-ek相似的体外抗肿瘤细胞活性。相似的体外抗肿瘤细胞活性。n韩宗玺等韩宗玺等(2008)采用采用gst基因融合表达系统基因融合表达系统在在e. colibl21中重组表达鸡的中重组表达鸡的gal-9抗菌肽抗菌肽基因基因,获得了理想的表达效果获得了理想的表达效果,诱导蛋白表达诱导蛋白表达量占细胞总蛋白的量占细胞总蛋白的40%,并且大部分以包涵并且大部分以包涵体的形式存在。纯化后体的形式存在。纯化后,检测其抗菌活性与检测其抗菌活性与提取抗菌肽相似提取抗菌肽相似,说明有些抗菌肽在进行融说明有些抗菌肽在进行融合表达时合表达时,

10、不影响抗菌肽的抗菌活性。不影响抗菌肽的抗菌活性。n 谢芳等谢芳等(2009)为了验证重组抗菌肽为了验证重组抗菌肽ranalexin的抑菌活性的抑菌活性,提取牛蛙皮肤组织总提取牛蛙皮肤组织总rna,经经rt-pcr扩增抗菌肽基因扩增抗菌肽基因ranalexin,克隆测序后克隆测序后,将该基因插入将该基因插入pgex-3x融合表融合表达载体达载体,进行原核表达进行原核表达,表达产物经复性纯化表达产物经复性纯化后对金黄色葡萄球菌具有明显的体外抑菌后对金黄色葡萄球菌具有明显的体外抑菌活性。活性。n综合所述综合所述,原核表达是目前掌握最为成熟的表达系原核表达是目前掌握最为成熟的表达系统统,是目前运用大肠

11、杆菌进行的抗菌肽基因工程研是目前运用大肠杆菌进行的抗菌肽基因工程研究的主要方式究的主要方式;其优点在于能够在较短时间内获得其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物基因表达产物,而且所需成本相对较低而且所需成本相对较低;但与此同但与此同时时,原核表达系统还存在许多缺点原核表达系统还存在许多缺点,如通常使用的表如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控达系统无法对表达时间及表达水平进行调控,有些有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用,过量表达可能导致非生理反应。过量表达可能导致非生理反应。n另外另外,目的蛋白通常以包涵体形式表达目的蛋白

12、通常以包涵体形式表达,导致导致产物纯化困难。而且原核表达系统翻译后产物纯化困难。而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善加工修饰体系不完善,表达产物的生物活性表达产物的生物活性较低。为克服上述不足较低。为克服上述不足,许多学者将原核基许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域。因调控系统引入真核基因调控领域。2.2酵母菌表达体系酵母菌表达体系n酵母具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制酵母具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制及对表达产物的加工修饰和分泌能力及对表达产物的加工修饰和分泌能力,并且不会产并且不会产生内毒素生内毒素,是基因工程中良好的真核基因受体菌。是基因工程中良好的真核基因受

13、体菌。n近年来应用最为广泛的是毕赤酵母。毕赤酵母是近年来应用最为广泛的是毕赤酵母。毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母一种甲醇营养型酵母,能利用甲醇作为唯一碳源能利用甲醇作为唯一碳源;它拥有一个很强的可被诱导的甲醇利用途径它拥有一个很强的可被诱导的甲醇利用途径,乙醇乙醇氧化酶氧化酶(aox)是甲醇利用途径的第一个酶是甲醇利用途径的第一个酶,甲醇是甲醇是这个酶的诱导剂这个酶的诱导剂,而葡萄糖、乙醇、甘油等则是抑而葡萄糖、乙醇、甘油等则是抑制剂。制剂。nhong等等(2007)运用毕赤酵母表达系统表达了人皮运用毕赤酵母表达系统表达了人皮肤抗菌肽肤抗菌肽ll-37,该基因装载于该基因装载于pgapz-e/l

14、l-37载载体体,转染毕赤酵母转染毕赤酵母x-33,甲醇诱导表达。结果目的蛋甲醇诱导表达。结果目的蛋白以分泌物的形式表达白以分泌物的形式表达,产物纯化后经藤黄微球菌产物纯化后经藤黄微球菌测试具有抗菌活性测试具有抗菌活性;该研究结果表明该研究结果表明,抗菌肽可以抗菌肽可以通过酵母真核表达系统表达通过酵母真核表达系统表达,而不必与其他蛋白融而不必与其他蛋白融合。合。n刘静等刘静等(2008)用果蝇用果蝇cecropina原始氨基酸序列基础上原始氨基酸序列基础上,利利用毕赤酵母菌偏好的密码子用毕赤酵母菌偏好的密码子,反推出其基因的序列反推出其基因的序列,根据需根据需要对其中部分密码子进行调整要对其中

15、部分密码子进行调整,并在毕赤达酵母中成功表并在毕赤达酵母中成功表达达,但表达量不高但表达量不高,有待进一步的研究。仇妍虹等有待进一步的研究。仇妍虹等(2009)将重将重组家蝇抗菌肽组家蝇抗菌肽des-hf基因克隆入酵母表达载体基因克隆入酵母表达载体ppicz-a,构建分泌型重组酵母表达载体构建分泌型重组酵母表达载体ppic-des-hf,转化转化pichia pastoris受体菌受体菌smd1168,在醇氧化酶在醇氧化酶(aox)启动子调控下启动子调控下,相对分子质量约相对分子质量约5000 u的重组抗菌肽的重组抗菌肽des-hf获得表达。获得表达。n抗菌试验结果表明抗菌试验结果表明,该表达

16、产物对金黄色葡该表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性。以小鼠为试验萄球菌有较好的抑菌活性。以小鼠为试验模型研究重组抗菌肽对金黄色葡萄球菌的模型研究重组抗菌肽对金黄色葡萄球菌的体内抗菌活性体内抗菌活性,试验结果表明试验结果表明,240g重组重组des-hf可分别保护小鼠免受可分别保护小鼠免受10倍最小致死倍最小致死浓度的金黄色葡萄球菌浓度的金黄色葡萄球菌(atcc26003)和和cowan的攻击。的攻击。n蔡晶晶等蔡晶晶等(2009)将黑鲷抗菌肽将黑鲷抗菌肽hepcidin与毕赤酵母与毕赤酵母(pichia pasto-ris) ppic9k质粒连接质粒连接,构建了分泌表构建了分泌表达载体达

17、载体ppic9k/as-hepc2。电击法转化重组表达。电击法转化重组表达载体载体,经经g418筛选和选择性培养基及筛选和选择性培养基及pcr鉴定鉴定,得得到的克隆子都为甲醇利用正常性到的克隆子都为甲醇利用正常性(mut+)。以甲醇。以甲醇诱导诱导ppic9k/as-hepc2,分泌表达上清中获得分泌表达上清中获得10 ku左右的表达产物左右的表达产物,与预期的目的蛋白黑鲷与预期的目的蛋白黑鲷hepcidin的前体肽和成熟肽的大小相符。的前体肽和成熟肽的大小相符。n表达试验结果证明表达试验结果证明,随时间的延长随时间的延长,表达产物表达产物量增多量增多,至至120 h达到高峰达到高峰,表达产物

18、具有很强表达产物具有很强的热稳定性。用抑菌圈法测定重组蛋白的热稳定性。用抑菌圈法测定重组蛋白pro-as-hepc2的抗菌活性的抗菌活性,结果发现能抑制革兰结果发现能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长。氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长。n综合所述与原核表达系统相比其优点是综合所述与原核表达系统相比其优点是: 一、根据原核生物蛋白与靶一、根据原核生物蛋白与靶dna间作用的高度特异间作用的高度特异性设计性设计,而靶而靶dna与真核基因调控序列基本无同源与真核基因调控序列基本无同源性性,故不存在基因的非特异性激活或抑制故不存在基因的非特异性激活或抑制;二、能诱导基因高效表达二、能诱导基因高效表达,为其

19、他系统所不及为其他系统所不及;三、能严格调控基因表达三、能严格调控基因表达,既可控制基因表达的既可控制基因表达的“开开关关”,还可人为地调控基因表达量。还可人为地调控基因表达量。n真核表达系统蛋白表达水平高真核表达系统蛋白表达水平高,生产成本低生产成本低,但它们但它们的加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同的加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同;哺乳哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质,但其但其表达量低、操作繁琐。各种表达系统由于翻译后表达量低、操作繁琐。各种表达系统由于翻译后的加工不完全相同的加工不完全相同,因而产生的重组蛋白的生物学因而产生的重组蛋白的生物学活性