gp与系统性红斑狼疮的基因治疗PPT课件

1、系统性红斑狼疮严重危害人类健康的自身免疫性疾病系统性红斑狼疮(SLE)是由于遗传、激素及环境相互作用引起一种自身免疫病累及皮肤、关节、肾脏、心血管、神经和黏膜等多个系统器官临床表现复杂，病程迁延反复，在我国患病率接近1/100010年生存率虽已达84%，但由于发病时年龄较轻，患者平均寿命仅44岁第1页/共11页IL-6简介：IL-6是一种由单核/巨噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、角质细胞、Th2细胞和B细胞产生的细胞因子。主要生物学活性包括：促进B细胞增殖分化和产生抗体；促进CTL、NK的分化并增强杀瘤活性；促进肝合成急性期蛋白；作为内源性致热源，参与炎症反应。IL-6异常与系统性红斑狼疮：

2、SLE病人的B细胞可自发产生大量IL-6，而正常人的B细胞几乎不产生IL-6。在SLE病人中，B细胞主要由IL-6刺激分化与增殖。SLE病人B细胞同时表达IL-6高亲和力受体（IL-6 Receptor,IL-6R），组成一个自分泌刺激环，促使B细胞多克隆活化。IL-6还能诱导SLE病人B细胞产生抗DNA抗体，这是SLE的特征抗体之一1。IL-6的简要致病机理如下图：B细胞IL-6IL-6R复合物抗DNA抗体第2页/共11页gp130分子是分子量为130 kD的糖蛋白，是白介素-6(IL-6)的信号传导链。IL-6和IL-6受体(IL-6R)结合后，并不引起信号的跨膜传递，还必须与二个gp13

3、0分子结合，使之发生同二聚体化，导致细胞浆内Jak激酶的活化，引起信号传递1。IL-6/IL-6R的信号传导链如下图所示：第3页/共11页可溶性gp130（soluble gp130, sgp130）细胞因子受体有膜蛋白和可溶性蛋白两种形式，大多数细胞因子受体的可溶性表达都能起到竞争性抑制细胞因子与膜蛋白受体结合的作用。因此，研究人员已尝试过用sgp130竞争性阻断IL-6/IL6R复合物刺激B细胞分化增殖的信号传导1。复合物gp130B细胞sgp130gp130抗体gp130抗体能与细胞膜表面的gp130发生特异性结合，阻止复合物与gp130结合2。gp130抗体复合物gp130siRNA：

4、未见过用gp130的siRNA沉默gp130来治疗SLE的尝试，但研究表明gp130的siRNA确实可以大大降低细胞膜表面gp130受体的数量3，进而抑制B细胞的活化。第4页/共11页siRNA，即小干扰RNA，是一段长约20个碱基对、与靶标基因高度同源的双链RNA. siRNA进入细胞内部后，可引起与其同源的特异基因mRNA降解，进而抑制这段基因的表达，属于转录后抑制。siRNA的发现者获得了2006年诺贝尔奖，并被科学杂志连续两年评为十大科技进展之首。siRNA的基因沉默机理如下图：第5页/共11页基因载体的选择化学、材料学与生物学问题：病毒类基因载体：最早进入临床试验和药物研发的基因载体

5、，目前在基因治疗中仍占有不小的比例。优点：转染率高、基因表达时间持久。缺点：安全性受到质疑，运载的基因片段长度有限，制备复杂，成本昂贵。非病毒基因载体：最近十年开始受到广泛关注，潜力巨大。优点：无免疫原性，外源基因整合到核基因中的概率极低，制备简单，成本较低。缺点：转染率低于病毒载体。本实验中拟采用非病毒基因载体。设计一种非病毒基因载体，将gp130的siRNA安全、高效地转入动物模型体内，实现基因治疗。第6页/共11页非病毒载体的研究工作超出了基础医学的范畴，所以该项目需要化学、生物学和基础医学专业的学生合作完成。浙江大学化学系09级本科生胡天楠师从汤谷平教授，已开始着手合成用于SLE的基因

6、治疗的非病毒基因载体。他将要合成的载体是PHPA-PEI，其安全性和运载目的基因的能力已被相关研究证实1。这是世界范围内，聚阳离子型非病毒基因载体在SLE的基因治疗中的首次尝试。该项目日前已被批准获得2011年全国大学生创新创业训练计划（国创）的资助。下图是PHPA-PEI的结构式。第7页/共11页1.用gp130的siRNA在体外研究其对红斑狼疮中B细胞活化的影响从sigma试剂公司或GeneBank数据库中获取gp130的siRNA序列，并交由生物技术公司，扩增获得转录后能得到相应siRNA的质粒载体（以下简称siRNA质粒）。取SLE小鼠（NZB/NZW品系）骨髓细胞，分离纯化，得到B细

7、胞，经传代培养后得B细胞系。分别用siRNA质粒和空白对照处理B细胞，用westernblot法检测处理后细胞表面gp130的表达情况。然后用脂多糖刺激B细胞，诱导B细胞分化增殖，观察实验组和对照组之间B细胞的增殖速度有无差异。2.合成非病毒载体，将siRNA质粒送入SLE小鼠体内，尝试SLE的基因治疗。合成PHPA-PEI非病毒基因载体，用Zeta电势仪测量该载体的粒径和表面电势，并用凝胶阻滞电泳测试这种材料与DNA的结合能力（以上工作由浙江大学完成）。将PHPA-PEI与siRNA质粒形成的复合物注入SLE小鼠体内，化验注射后小鼠各项相关生理指标（抗dsDNA抗体、尿蛋白等），并与空白组、

8、siRNA质粒组、PHPA-PEI组相对照，以验证基因治疗是否确实有效。第8页/共11页随着人类对疾病认识的逐渐深入，越来越多的疾病可以归因为基因异常。针对特定基因进行基因治疗，既可以避免传统药物特异性差、副作用大的缺点，又可以解决传统药物设计周期过长、蛋白质药物（如利妥昔单抗等细胞因子）成本过高普及困难的问题。20年前，当计算机药物设计的概念刚刚被提出的时候，有关“药物作用靶点”的研究在国内尚属冷门。今天，药物靶点的研究已成为一项产业。可以预见，在基因治疗时代，有关重大疾病的基因治疗靶点的研究亦将产生重要意义。针对有治疗意义基因靶点的研究，就是基因药物的知识产权。将自主知识产权握在自己手里，才能彻底扭转我国长期在药物开发中处于劣势的局面。SLE是一类严重危害人类健康的自身免疫病，且疾病高发人群往往是年轻女性，目前以糖皮质激素为主导的药物治疗方案有效性固然毋庸置疑，但糖皮质激素副作用大（发胖、导致骨质疏松、增加高血脂心脏病患病风险），细胞毒性药物特异性