SL核酸的生物合成DNA的复制PPT课件

1、这就是这就是19581958年年Crick Crick 提出的中心法则提出的中心法则。DNADNARNA蛋白质蛋白质复制转录翻译酶酶mRNA tRNA rRNA亲代子代RNA 复制逆转录?第1页/共97页问: :1. 1. 亲代是如何把遗传信息传递给子代的？2. DNA2. DNA上的遗传信息是如何转录到RNARNA上的？3. mRNA3. mRNA上所带信息是如何翻译成蛋白质的？第2页/共97页 . . 核酸的生物合成 14.1 14.1 DNADNA的生物合成 14.2 RNA14.2 RNA的生物合成15. 15. 蛋白质的生物合成16. 16. 基因表达调控讲 解 内 容第3页/共97

2、页14.1 14.1 DNADNA的生物合成的生物合成( (重点重点) )14.2 14.2 RNARNA的生物合成的生物合成( (重点重点) )14.3 14.3 核酸合成抑制剂（自学）核酸合成抑制剂（自学）14.4 14.4 基因工程简介（自学）基因工程简介（自学）14 14 核酸的生物合成第4页/共97页14.1 DNA的生物合成14.1.1 DNA的复制（DNA指导下的DNA合成）14.1.2 逆转录作用（RNA指导下的DNA的合成）14.1.3 DNA的损伤、修复与突变第5页/共97页Watson & Crick:Watson & Crick: 一种遗传物质，必须能行使两种 功能，即

3、自我复制和对细胞的高 度特异性的影响遗传物质的基本属性：基因的自我复制基因的自我复制 基因的突变基因的突变 控制性状的表达控制性状的表达第6页/共97页14.1.1 DNA的复制 一、复制的基本规律 二、DNA聚合反应有关的酶类 三、原核细胞DNA的复制过程 四、DNA复制的忠实性 五、真核细胞DNA的复制第7页/共97页一、复制的基本规律 复制（replication）? 以亲代DNA分子的双链为模板，按照碱基互补配对原则，合成出与亲代DNA分子完全相同的2个双链DNA分子的过程。第8页/共97页DNA复制的基本规律方式：半保留复制(semi-conservative replication

4、)方向：双向复制(bidirectional replication)特点：半不连续复制 (semi-discontinuous replication) 高保真性(high fidelity)第9页/共97页DNA复制可能的三种方式第10页/共97页(一）半保留复制的实验依据和意义 什么叫半保留复制？ DNADNA生物合成时，母链DNADNA解开为两股单链，各自作为模板(template)(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNADNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNADNA都和亲代DNADNA碱基序列一致。这种复制方

5、式称为半保留复制。第11页/共97页AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+亲代亲代DNADNA 复制叉复制叉子代子代DNA DNA DNA的半保留复制的半保留复制第12页/共97页由MeselsonMeselson和StahlStahl设计证明半保留复制的实验的被誉为生物学最美丽的实验Testing Models for DNA replication第13页/

6、共97页Meselson Meselson 和StahlStahl证明DNADNA半保留复制的实验流程（19581958）- -同位素示踪实验第14页/共97页第15页/共97页Meselson 和Stahl的实验结果第16页/共97页The Replication of DNA in Eschrichia coli . Matthew Meselson Franklin Stahl Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1958 , 44: 671-682美国自然科学研究院学报美国自然科学研究院学报 1958

7、1958，4444：671671682682第17页/共97页Matthew Meselson and Franklin Stahl more recentlyFaculty member at HarvardMechanisms of Molecular EvolutionFaculty member at U. of OregonMeiotic Recombination第18页/共97页半保留复制的生物学意义 按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。第19页/共97页

8、（二）双向性原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。 复制中的放射自显影图象第20页/共97页复制叉的结构当DNADNA复制从起始区起动的时候，起始区的DNADNA双链因发生解链而形成叉状结构，这样的结构被称为复制叉 第21页/共97页（三）、复制的半不连续性（三）、复制的半不连续性3 5 3 5 解链方向解链方向3 533 5 领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand) 冈崎片段（Okazaki fragment）第22页/共97页二、参与大肠杆菌DNA复制的酶类复制过程参加物质原

9、料：dNTP条件：供能 ATP Mg2+模板：DNA酶引物体内：RNA体外：DNA单链结合蛋白等 过程：DNADNA复制是多种蛋白质和酶参与的复杂过程。DNADNA聚合酶引物酶解螺旋酶连接酶拓扑异构酶第23页/共97页两个特点：DNA DNA 新链生成需引物和模板； 新链的延长只可沿5 5 3 3 方向进行 。第24页/共97页（一）DNA聚合酶（DNA polymerase） 种类：原核 真核第25页/共97页DNA聚合酶(DNA-pol)这类酶的共同性质:1.1.以脱氧核苷三磷酸(dNTP)(dNTP)为前体催化合成DNA;DNA;2.2.需要模板，按碱基互补原则合成子链; ;3.3.需要

10、引物，不能起始合成新的DNADNA链; ;催化dNTPdNTP加到生长中的DNADNA链的3-OH3-OH末端; ;4.4.催化DNADNA合成的方向是5353；第26页/共97页模板；引物；dNTP；合成方向；反应可逆；Mg2+；DNA-pol作用：催化两个dNTP 生成磷酸二酯键反应：53 的聚合活性指出： DNA-pol还具有核酸外切酶活性第27页/共97页5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切

11、除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。 核酸外切酶活性 第28页/共97页第29页/共97页Arthur Kornberg (1958)大肠杆菌细胞蛋白质提取物+DNA模板有无DNA合成?- dNTPs- Mg2+ (辅助因子)- ATP (能源)- 游离的3OH端 (引物)体外测定DNA复制纯化得到DNA聚合酶I Stanford University Stanford University Stanford, CA, USAStanford, CA, USA The Nobel Prize in Physiology or

12、Medicine 1959（揭示人类DNA合成机制 ）第30页/共97页DNA pol ：作用：1. 1. 对复制中的错误进行校读和切除； 2. 2. 填补复制和修复过程中出现的空隙；DNA大片段：核苷酸聚合枯草杆菌PrPr酶（Mw 7.6万）(Klenew Frament)小片段： 5533外切（ Mw 3.4万） Pol第31页/共97页DNA-pol （109kD）A AP P为1818个 螺旋区，H H和I I之间由较大的非螺旋区连接。第32页/共97页小片段小片段 大片段大片段（Klenow fragmentKlenow fragment）5 533聚合功能，聚合功能，3 355外切

13、酶活性外切酶活性5 533外切酶活性外切酶活性DNA pol IEJPNMLHIORQGCDBFAK第33页/共97页DNA pol II 1970年分离得到； 聚合酶活性：2400base/min； 100分子/cell； 有35核酸外切酶活性， 没有53核酸外切酶活性； 在DNA repair 中起作用；第34页/共97页DNA pol III“真正”的大肠杆菌DNA复制酶快：1 000nt/秒/酶 酶量合适精确其结构十分复杂!第35页/共97页 DNA 聚合酶不对称二聚体 第36页/共97页 十种亚基（）组成的不对称二聚体。组成核心酶，2称为夹子，（2）组成复合物，其主要功能是帮助亚基夹

14、住DNA，故称为夹子装配器，该酶DNA合成的持续能力强，主要与该结构有关。DNA-pol (250kD)第37页/共97页DNADNA聚合酶IIIIII全酶的滑动钳夹住双螺旋DNADNA 第38页/共97页原核生物的三种原核生物的三种DNADNA聚合酶性质比较表聚合酶性质比较表 种 类 Pol 作 用 修复 （10/秒） 修复（秒） 复制 （150/秒, 10万 /分） 活 性 2 3功 能 催化两个dNTP 聚合生成3,5-磷酸二酯键Mw/103 102 880 830 外 切 35 外 切 53 分子数/细胞 400 100 20（活性比大20倍）第39页/共97页真核生物的DNA聚合酶D

15、NA聚合酶聚合酶催化活性催化活性功功 能能5353聚合聚合3535核酸外切核酸外切5353核酸外切核酸外切真真核核生生物物DNADNA聚合聚合酶酶 切去引物切去引物RNARNA，补上，补上正确的正确的DNADNA片段片段DNADNA聚合聚合酶酶 DNADNA聚合聚合酶酶g g 负责链的延长负责链的延长DNADNA聚合聚合酶酶 负责先导链的延长负责先导链的延长第40页/共97页（二）引物酶(primase)复制起始时催化生成RNA引物的酶是一种特殊的RNA聚合酶 该酶以DNADNA为模板，合成一段RNARNA引物。DNADNA复制在该引物上加入dNTPdNTP。第41页/共97页RNARNA聚合

16、酶DNADNA模板RNARNA引物NTPNTP Primase Primase（引物酶）答：因为DNA polDNA pol不能催化两个游离的dNTPdNTP聚合。问：为什么引物不可以是DNADNA？第42页/共97页第43页/共97页（三） DNA连接酶(DNA ligase)v催化DNADNA双链中一条链上的缺口（3-OH 3-OH 与它下游相邻的核苷酸的 5-5-磷酸之间）共价连结（形成磷酸二酯键）。35535353HOP DNA ligaseNADATPNMNAMP+PPi+ DNA DNA连接酶在DNADNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。第44页/共97页（四）解旋酶 (h

17、elicase)作用：利用ATPATP供能，作用于氢键，使DNADNA双链解开成为两条单链. .大肠杆菌DnaBDnaB蛋白的解旋酶活性 第45页/共97页（五）单链DNA结合蛋白（single stranded binding protein，SSB） 作用：防止单链DNA重新形成双链，防止单链DNA被核酸酶水解。 特点：四聚体，DNA跨度32bp,呈协同效应，不断的结合和解离。第46页/共97页第47页/共97页（六）DNA拓扑异构酶 (DNA topoisomerase) 已知：在生物体内，DNA以超螺旋的形式存在。 问：复制时，超螺旋时如何打开的？ 拓扑异构酶起着重要的作用 复制时，D

18、NA解链沿中心轴反向旋转，因为复制速度快，旋转也快（100次/秒），易导致DNA出现：打结、缠绕和连环。第48页/共97页第49页/共97页DNADNA复制过程中形成的正超螺旋 第50页/共97页 拓扑异构酶作用特点 既能水解 、又能连接磷酸二酯键 分 类 拓扑异构酶 拓扑异构酶第51页/共97页第52页/共97页 三、 原核细胞的DNADNA复制过程（一）. 复制的起始（Initiation）（二）. 复制的延伸（Elongation）（三）. 复制的终止（Termination）第53页/共97页（一） 、 复制的起始解决两个问题解决两个问题1. DNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提

19、供模板。2. 合成引物，提供合成引物，提供3 -OH末端。末端。第54页/共97页（一） 复制的起始1 1、DNADNA解成单链 由特定蛋白质识别复制起始位点（oriori），在解螺旋酶、TOPOTOPO异构酶及单链DNADNA结合蛋白的共同作用下，DNADNA解链，解旋，形成复制叉。 倒Y第55页/共97页双向复制双向复制单向复制单向复制第56页/共97页理顺理顺DNA链链拓扑异构酶拓扑异构酶 (gyrA, B)稳定已解开的单链稳定已解开的单链单链单链DNA结合蛋白结合蛋白SSB催化催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶DnaG (dnaG)运送和协同运送和协同DnaBDnaC (dnaC)

20、解开解开DNA双链双链解螺旋酶解螺旋酶DnaB (dnaB)辨认起始点辨认起始点DnaA (dnaA)蛋白质（基因）蛋白质（基因）通用名通用名功能功能原核生物复制起始的相关蛋白质原核生物复制起始的相关蛋白质第57页/共97页 Dna A Dna BDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 2 2. . 引发体和引物的生成含有解旋酶、DnaCDnaC蛋白、引物酶和DNADNA复制起始区域的复合结构称为引发体。 解旋酶解开双链后引物酶进入形成引发体。（解旋酶）Dna C第58页/共97页3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链RNARNA分子。 引物3 HO5引物引物酶酶原核

21、（50-100bp），真核（10bp）合成引物第59页/共97页大肠杆菌复制起始模型第60页/共97页（二）DNA链的合成与延伸 引物合成后，由DNA polDNA pol（在真核细胞为DNA polDNA pol 和 ) )催化，按碱基配对原则，将dNMPdNMP逐一添加到引物3 3 末端，形成磷酸二酯键，使新合成的链不断延长。3AAGACCTATT55TTCTGGATAA3第61页/共97页 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol第62页/共97页 DNA DNA链的延伸 在在DNA pol DNA pol 的催化下

22、，以四种的催化下，以四种dNTPdNTP为底物，在为底物，在RNARNA引物的引物的33端以磷酸二酯键连接上端以磷酸二酯键连接上dNTPdNTP并释放出焦磷酸。并释放出焦磷酸。DNADNA链的延伸同链的延伸同时进行时进行前导链前导链和和后随链后随链的合成。两条链方向相反。的合成。两条链方向相反。5353Direction ofunwindingContinuous replication53PrimerPrimer53Primer53Discontinuous replication第63页/共97页DNA replication is semi-discontinuous前导链后随链第64页

23、/共97页DNA 的半不连续复制： Okazakis (1968)； Reiji Okazaki was born near Hiroshima, Japan, in 1930. He was a teenager there at the time of the explosion of the first of two nuclear bombs that the US dropped at the end of World War II. His scientific career was cut short by his untimely death from cancer in 19

24、75 at the age of 44, perhaps related to his exposure to the fallout of that blast.semi-discontinuous第65页/共97页在复制叉中不连续合成的DNADNA片段称为冈崎片段，连续合成的DNADNA子链被称为前导链，不连续合成的DNADNA子链被称为后随链或后随链。 第66页/共97页冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:DNA聚合酶I（ 53 外切酶的功能）DNA连接酶第67页/共97页（三）复制的终止 原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向

25、复制的复制，双向复制的复制片段在复制的终止点片段在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。第68页/共97页子代DNADNA的分离 第69页/共97页四、DNA复制的精确性（高保真复制） DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制5 109碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下几点:1 1、 DNADNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为7 7 1010-6-6 ）2 2、DNADNA聚合酶的3535外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低10010010001000倍。3 3、起始时以RNARNA作为引物。4 4、 DNADNA的损伤修复

26、系统。第70页/共97页DNA聚合酶的校对功能聚合酶错配碱基复制方向正 确核苷酸5 55 55 53 33 33 3切除错配核苷酸第71页/共97页复制过程小结复制过程小结7. DNA聚合酶I切除引物；填补空隙；8.连接酶连接。1. DnaA识别并结合于复制起始点（Ori），促使局部解链。在DnaC协助下结合并沿链方向移动置换出DnaA，形成复制叉。3. SSB结合于解开的DNA单链。4.形成引发体（DnaB，DnaC，引物酶和局部DNA）。 ATP供能下合成RNA引物。5. Topo异构酶解除打结及缠绕，形成利于复制的负超螺旋。6. DNA聚合酶沿5 3方向合成新链。半不连续复制。领头链；随

27、从链形 成冈崎片段。直至Termination而终止。第72页/共97页五、 真核细胞的DNA复制 （一）复制的起始（二）复制的延长（三）复制的终止染色体两端DNADNA子链上最后复制的RNARNA引物，去除后留下空隙该如何填补？自学自学内容内容注意：原核生物注意：原核生物 的的DNADNA是环状双链；是环状双链； 真核生物为线状双链真核生物为线状双链DNADNA。已知：DNADNA聚合酶不能催化两个游离的dNTPdNTP聚合，而且DNADNA单链的母链还易被DNaseDNase水解。第73页/共97页5 3 3 5 5 3 3 5 问：线性DNADNA分子如何避免每复制一次末端就 缩短一次？

28、5 3 3 +3 3 5 5 第74页/共97页真核生物的端粒和端粒酶真核生物DNADNA末端结构是端粒，在端粒酶的作用下形成 。（TTAGGG）n(telomere and telomerase)第75页/共97页 端粒端粒(telomere)指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。分子末端的结构。功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 维持维持DNA复制的完整性复制的完整性结构特点 由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。 末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G的短序列。的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG第76页/共

29、97页端粒酶端粒酶(telomerase) 端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于RNA模板的DNA片段的合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。53AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶第77页/共97页端粒酶的作用机理 第78页/共97页14.1.2 14.1.2 逆转录 以RNARNA为模板，dNTPdNTP为原料，按碱基配对规律合成DNADNA的过程称之。由逆转录酶催化。逆转录（reverse transcriptionreverse transcription ） : :逆转录酶（reverse transcriptasereverse

30、transcriptase） 逆转录酶逆转录酶第79页/共97页逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂化双链杂化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA第80页/共97页逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法称为称为cDNA法法 以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与录合成的与mRNA碱基序列互碱

31、基序列互补的补的DNA链。链。 试管内合成cDNAcDNA complementary DNA 第81页/共97页 逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样同样兼有遗传信息传代与表达功能。兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意世纪初已注意到的病毒致癌理论。到的病毒致癌理论。 第82页/共97页14.1.3 DNA 损伤、修复和突变DNA Damage , Repair and Mutation 第83页/共97页 某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作用于DNA，造成DNA结构和功能的破坏，称为DNA的损伤。DNA的修复主要有以下类型:暗修复四、诱导修复（SOS修复）一、光裂合酶修复二、切除修复三、重组修复 第84页/共97页引起损伤的因素引起损伤的因素ONHNOCH3RPONHNOC H3RONHNOC H3