DNA条形编码技术在昆虫学中的应用

1、DNA条形编码技术在昆虫学中的应用摘要：DNA条形编码技术是分子生物学领域出现的一项新技术，其本质是一段含有生物信息的DNA片段，通过对这段基因片段的分析来实现对生物物种准确且快速的鉴定。本文主要针对DNA条形编码技术的产生、发展以及其在昆虫学中的基础研究与实践应用等方面进行综述。关键字：DNA条形码；昆虫学；应用Abstract:DNA barcoding is a new technology in the field of biological taxonomy. Its essence is a piece of DNA fragment containing biological i

2、nformation. It is a quick and accurate way to identify species by using the gene fragment. This article mainly aims at the production and development of DNA barcoding. Some aspects of insect taxonomy of basic research and practical application will be summarized as well.Key words:DNA barcoding;entom

3、ology;application前 言所有生物学研究的基础之一就是物种的准确鉴定。昆虫作为世界上物种数量最多的类群，其在分类上存在大量争议，虽已有达170多万个物种已被命名1，目前尚有存在着大量种类有待我们去发现、描述和命名，因此其分类任务复杂而艰巨。近几年，随着分子生物学技术的飞速发展，DNA条形编码技术的应运而生，它的提出实现了分类学上的一次质的飞跃，其本身具有简便、准确快速、易操作等优点使其被广泛应用在物种的分类工作中2。这不仅弥补了传统形态分类的诸多不足，还为提高昆虫物种鉴定效率、辅助发现和描述新种和隐种、系统发育研究、入侵物种检测与鉴定、法医昆虫上的应用以及保护昆虫物种资源多样性等

4、提供了新的研究方法。本文综述了DNA条形编码技术的产生、发展以及其在昆虫学基础研究与实践应用等方面，旨在使人们对这项新技术有一个更加深入的了解。1 DNA条形编码技术的产生DNA条形编码技术，类似于商品条形码，在分类学研究领域人们采用生物体的某段DNA序列作为标记，以此来标识一个物种。这项技术即为DNA条形码（DNA barcoding）3。21世纪初，德国进化生物学家Tautz教授首次提出，将DNA作为生物分类研究平台的观点4-5。随后，加拿大Hebert教授6提出了DNA barcoding的概念，即通过对线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基基因（mtDNA CO）5端一段长度约为650bp的

5、基因片段进行测序和序列分析，进而在DNA水平上成功区分物种。他还提出线粒体CO基因的序列可以作为物种的条形码，为全球所有生物进行编码，且认为利用CO基因从分子演化的角度，将提供一种快速、方便且可信的分类方法。2 DNA条形编码技术的原理和流程2.1 DNA条形编码技术的原理DNA barcoding本质就是一段DNA片段，这个片段具有的某些特点可以使其成为某一物种的分子标签，即人们以已知的一系列分类单元的DNA序列为参考，通过序列间相似度的评价来实现物种的鉴定3。在昆虫分类领域，DNA条形编码技术采用的标记基因主要是线粒体CO基因，它之所以能作为鉴定的依据，是因为昆虫线粒体DNA是共价闭合的环

6、状双链DNA分子，没有重组、倒位、易位等突变现象，组成相当稳定，严格遵循母系遗传7。而CO基因是线粒体蛋白编码基因之一，密码子第三位碱基不受自然选择压力的影响，可以自由变异，且CO的演化速率是其他蛋白编码基因的3倍，有足够的变异能够将物种区别开来，CO还具有较少的插入和缺少，两端序列有相对的保守性的特点，是较好的分子标记，被众多学者在研究中使用。2.2 DNA条形编码技术的流程DNA barcoding的技术流程主要包括样品获取、DNA提取、PCR扩增、序列测定、序列比对及根据序列差异进行判别等几个方面，其简单的操作步骤如下图所示3。样品获取样品DNA的提取引物设计，CO基因的PCR扩增及序列

7、测定DNA barcodingDNA barcoding序列比对与分析构建系统发育树计算序列间距离物种鉴定数据库的构建3 DNA条形编码技术在昆虫分类中的应用DNA片段作为不同分类水平的研究材料是很重要的，研究不同类群的亲缘关系，所需要选取的基因和碱基位点也不相同。通常进化快的基因和碱基位点适于亲缘关系较近类群的系统学研究，进化慢的则适于远源类群的系统学研究。下图为线粒体DNA基因序列各区域的应用范围8-9。表1 线粒体DNA序列各区域应用范围序列区名称昆虫分类水平纲目科属科种群12S rRNA16S rRNAND1、ND2ND5CO、COCytbControl region3.1 鉴定物种D

8、NA条形码最初的目标就是对动物进行物种的鉴定与分类，其理论基础是每一个物种都具有独一无二的条形码序列，并且种间差异不小于种内差异的10倍，因此条形码可以从分子水平上快速地、直接地为基于形态的分类系统提供信息2。至今，DNA条形码在昆虫很多类群中都表现出了很好的物种鉴定和分类的能力，比如在昆虫鉴定方面：我国的范京安等10选用双翅目实蝇科12属36种55个样本为材料，探讨微型DNA条形码对果实蝇物种鉴定的可行性，得到了果实蝇属6个物种的CO序列，准确性与DNA条形码基本一致，它们均可作为果实蝇物种鉴定的有效依据。潘程莹等11以我国常见的斑腿蝗科7中蝗虫为对象测定了CO基因序列，探讨了CO基因作为D

9、NA条形码在识别蝗虫物种方面的可行性。结果表明，该基因可以探讨蝗虫属，种分类单元的系统发育问题，为将线粒体基因组的CO基因作为蝗虫DNA条形码进行分类鉴定手段的可行性提供了一定的参考。众所周知，蓟马类害虫种类多、体型小，传统的形态学鉴定方法难以快速准确识别。乔纬娜等12利用DNA条形码通用型引物，以我国田间常见的25种蓟马为靶标扩增其线粒体DNA CO基因，通过对靶标片段碱基序列的测序及对比分析，结果表明基于CO基因的DNA条形码技术可以用于不同种类蓟马的快速准确鉴定。在物种鉴定中，DNA条形码还不受虫态的限制，对于那些形态上无法鉴别的卵、幼虫、蛹和残缺成虫等都能够很好的进行准确区分和鉴别。刘

10、慎思等13以桔小实蝇的幼体（卵、幼虫、蛹）以及成虫残体（足、翅、头部、胸部、腹部）为对象，利用DNA条形编码技术，构建实蝇类害虫快速鉴定技术体系，结果显示，桔小实蝇幼体以及成虫残体的碱基序列与数据中靶标种CO基因碱基序列的一致性为99.51%99.84%。这一实验充分证明DNA条形编码技术对昆虫虫态鉴定方面的可靠性。另外，利用DNA条形编码技术还能检测出已分类种群的准确性。安榆林等14应用PCR直接测序法对不同地理来源的光肩星天牛的线粒体DNA CO基因进行测序，结果表明，光肩星天牛与其近缘种、外源种间存在明显规律性差异，并且它与黄斑星天牛样品间的差异较小，并未达到种级分类水平，应归为同1个种

11、。3.2 辅助发现和描述新种和隐种DNA条形码除了能够准确鉴定已知物种以外，还可以协助形态及其他生物学特性来确定新种和解决形态上难以区分的隐存种。最早结合条形码发现新种的是Brown等15他们将形态特征与DNA条形码技术相结合，发表了新几内亚鳞翅目卷蛾科的新种Xenothictis gnetiuora Brown et al.之后，很多学者也采用这种方式来发表新种，比如，Pauls等16在智利通过结合形态学特征和DNA条形码技术对毛翅目的可供鉴定物种重新进行了检查，发现有两种毛翅目新种Smicridea(S.) patinae和Smicridea(S.) lourditae 的存在，并对其进行

12、了正式的描述。3.3 系统发育研究在昆虫系统发育研究方面，DNA条形编码技术也起到了重要作用。诸立新等17为了探讨中国尾凤蝶属的系统发生关系，对中国产4种尾凤蝶属蝴蝶的线粒体DNA CO基因进行测序分析，结果表明，尾凤蝶属二尾种组与多尾凤蝶亲缘关系较近，而三尾凤蝶较早分化出来。同时丽斑尾凤蝶和二尾凤蝶的CO基因没有序列差异。烟粉虱是一种世界性的重要害虫并且具有多种生物型。诸栋等18利用线粒体DNA CO基因片段对国外12个地理种群烟粉虱的生物型进行了鉴定，结果显示，采自北京海淀、河南郑州、山东枣庄、江苏南京等地的烟粉虱与来自美国California州、Texas州、Arizona州以及以色列的

13、B型烟粉虱的同源性达到99.8%100%，由此可见目前在中国广大地区暴发成灾的烟粉虱生物型为B型。充分说明DNA条形编码技术不仅能辅助人们了解昆虫的发育系统，更能在入侵物种鉴定和地理系统种群分析方面起到了重要作用。3.4 入侵物种检测与鉴定的应用依靠传统的形态学特征来鉴定入侵昆虫已经远远不能够满足我们的需求，有时候不仅无法正确鉴别的，还会在这上面消耗大量的人力和物力，而DNA条形编码技术不仅能够准确识别，还能大大缩短所需时间。我国的游中华等19用PCR产物直接测序法对入侵害虫西花蓟马和其他8种蓟马的线粒体CO基因433bp片段测序，获得62个个体的序列，充分证明，基于PCR及直接测序技术的分子

14、鉴定可以达到准确鉴定蓟马物种的目的。诸栋等18利用线粒体DNA CO基因片段对国外12个地理种群烟粉虱的生物型进行鉴定及来源分析，结果显示，采自云南省昆明地区一品红寄主植物上的烟粉虱与来自摩洛哥和西班牙的Q型烟粉虱，具有极高的同源性，说明该烟粉虱生物型为Q型，这也是首次报道Q型烟粉虱入侵中国。美洲棘蓟马Echinothricanus americanus Morgan 1913是新入侵我国的种类。魏书军等20选择线粒体CO基因中一段约430bp的序列进行PCR扩增和测序，将所得序列用于蓟马种类的分子鉴定。结果表明，基于线粒体CO基因第1和2编码位点，利用NJ法构建的系统发育树可以较好地区别不同

15、蓟马种类，可作为调查我国蓟马种类和分布的快速使用方法。3.5 法医昆虫上的应用法医昆虫学主要是利用尸体上产生昆虫的种类，生长发育状况来推断死亡时间、地点等，对昆虫进行准确鉴定是开展法医昆虫学研究的前提。一般成虫易飞走而导致收集到的都是卵、幼虫、蛹或者残肢碎片，这些因为缺乏形态上的鉴定特征，导致传统的形态鉴定难以实现，而DNA条形码的产生为法医昆虫学的发展带来了曙光。Schilthuizen等21利用DNA条形码成功鉴定了所采集的鞘翅目隐翅虫总科的86个标本共20个种，使得这个类群可以被应用于法医研究中。Boehme等22应用DNA条形码分析了来自德国包含13个种的重要的双翅目法医昆虫，结果所有

16、种都形成了明显的单系群，从而提出CO条形码适合用于鉴定德国法医相关的双翅目。嗜尸性蝇类在命案死亡时间和现场推断方面有着十分重要的应用，而DNA条形编码技术能摆脱对虫卵和幼虫的饲养以及后续物种鉴定方面专业知识的依赖，有助于实现现场采集蝇类样本进行快速鉴定。我国的陈庆等23采集了北京地区7个嗜尸性蝇类优势种共77个个体样本，测定了所有个体线粒体DNA上的CO基因。基于序列的系统发生分析显示，同一物种不同个体的序列均以高达99%的支持值聚集在一起。4 展望在通常情况下，同一物种中不同个体的DNA序列存在一定的差别，但是其差别通常并不显著。基于这样的假设，DNA条形编码技术使用的基因片段可以依据相似性

17、产生一个线索，进而对该样本是否属于某个物种提供数据上的支持或者不支持。从某种意义上，DNA条形编码技术更应该被视为一个物种所具有的众多特征中的一个特征，因此，人们应当将DNA序列作为与形态特征等宏观特征并列的特征进行记录。对昆虫分类学而言，DNA条形编码技术的提出具有十分积极的一面。同时，如同任何新技术刚刚出现时一样，它也不可避免的要面临一些问题。但不管怎么说，DNA作为一种有效且快速的生物物种鉴定手段加入到昆虫分类研究中是大势所趋。DNA条形编码技术已经应用于实践，并且在很多的类群中得到验证，证实其可以应用于分类学、系统发育学等相关研究24。尽管DNA条形编码技术不能解决所有问题，但它仍可以

18、作为一种有用的工具服务于昆虫分类与系统学。参考文献1 赵广宇，李虎，杨海林，等.DNA条形码技术在昆虫学中的应用J.植物保护学报，2014 ,41(2):130-141.2 周青松，张同心，于芳，等.DNA条形码在膜翅目昆虫中的应用分析J.应用昆虫学报， 2013,5(1):19-28.3 宋南，刘杰，彩万志，等.DNA条形码在昆虫分类中的应用J.四川动物，2013,32(3):470 -474.4 Tautz D，Arctander P，Minelli A，et al. DNA points the way ahead in taxonomyJ.Nature， 2002,418(6897):

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