GC脂肪酸分析MIDI试剂的准备和抽提步骤

1、TSBA培养基是针对嗜氧菌(TSBA Media for Aerobes: TSBA6数据库)Trypticase Soy Broth Agar(TSBA)培养基是嗜氧菌标准的培养基。利用以下的配方作为TSBA培养基。供货商被建议在附加数据(Appendix A)中。l 混合在2升的锥形瓶Trypticase soy broth 30 gramsGranulated agar 15 gramsDistilled Water 1 literl 加热并搅拌至完全混合和琼脂(Agar)完全溶解l 在温度121度及15psi下高压灭菌15分钟注意事项：不可过度加热培养基，使用高压灭菌器须有温度及时间的

2、设定装置。l 在水浴中冷却至60度l 加20-25 ml在溶解的琼脂(Agar)分装至无菌100 x 15mm直径的培养皿中，琼脂须有2.5-3.2mm深。l 允许琼脂在室温下凝固，但如果培养基想储存一段时间，必须在24小时内包装在无菌装置中。它们可以保存在冷藏中直到使用。注意事项关于商业化已备好的TSBA培养基：TSBA可以从BBL购买，但需要指定货号，见附加数据(Appendix A)。使用其它供应商提供的TSBA培养基可能会导致结果不一致，用户需要用ATCC菌株验证培养基是否效果相当。试剂的准备 (Reagent Preparation)四种试剂要求是皂化细胞，脂化，萃取和基本洗涤脂肪酸

3、的萃取物。试剂应准备在干净，棕色及可标示一公升的瓶子。放置一个Teflon-coated搅动台在每个瓶子上去添加在混合时。只有Teflon和玻璃可以接触到试剂。瓶子可以重新使用不须要重新浸润。自动分注的增加备置速度但是必须准备和确定适当的操作在每批样品使用前。确认分注试剂使用分注试剂在有刻度的量筒以达到校正效果。以下的配方准备试剂约够300个样品或许可以在先前调整以够配合实验室的样品量，试剂准备用VPI Anaerobe Method 和数据库在Appendix B中。注意事项: 试剂1和4是腐蚀性和试剂2是酸性的全程配戴安全眼镜及手套，hexane 及methyl-tert-butyl et

4、her (MTBE)在试剂3是可燃性的。熄灭所有的火焰或热源在使用前操作在一个化学性的抽气风盖之下。试剂1-皂化试剂 (Ragent 1: Saponification Reagent)Sodium hydroxide (certified ACS) 45 grams Methanol (HPLC grade) 150mlDeionized distilled water 150mll 混合水和methanol 加入NaoH小球到溶剂中同时搅拌至锭剂完全溶解试剂2-甲基化试剂 (Reagent 2: Methylation Reagent) 6.00N Hydrochloric Acid 32

5、5mlMethanol (HPLC grade ) 275mll 加酸液至methanol中搅拌注意事项: 盐酸(Hydrochloric Acid)必须有保证浓缩。只有盐酸运送在玻璃瓶中是被允许的，和你的供给商讨论包装的信息，请参考供给的建议在Appendix A如果6.00N HCI无法取得资询你的制造商标示浓度在那批号上确认最终6.00N的溶液滴定对比一个标准基础溶液。试剂3-萃取溶剂 (Reagent 3: Extraction Solvent)Hexane (HPLC Grade ) 200mlMethyl tert-buty1 ether (HPLC Grade) 200mll 加

6、入MTBE 在hexane 中并搅拌均匀试剂4-碱洗涤 (Reagent 4: Base Wash)Sodium hydroxide (Certified ACS) 10.8gDeionized distilled water 900mll 加入NaOH在水中同时搅拌至完全溶解 额外的试剂 (Additional Reagents)l Saturated NaCl:溶解40g 的ACS NaCl 在100ml的去离子水中试剂的保存及有效期限 (Reagent Storage and Shelf Life)建议每30天泡制新的试剂。可在瓶中保存在室温下使用Teflon-lined盖子。储存移吸管

7、在干净的容器中。所有试剂必须标示完全包括配制日期和过期日为一个月，纯净的试剂必须确认在准备试剂控制的空白对照组(过程不加任何组织物)在每次跑样品时。但不使用时，移开移吸管从试剂 1 (皂化试剂)瓶和利用打气的方式润丝清洁，利用去离子水去预防抓住活塞盖上试剂瓶用一个干净的Teflon-lined 螺旋盖。试剂3，萃取的溶剂是可燃性的和必须储在良好的化学性的抽气风盖之下或溶剂排气柜。准备萃取: 5个基本步骤(Preparing Extracts: Five Basic steps):每个样品放在单一试管中经过萃取的过程，每批可准备50个样品以增加方便性。萃取过程中的每个过程都摘要显示在图2-4。1

8、 获菌(Harvesting)四区画线方法是被设计为稀释接种所以此四区会维持良好的分离菌落去提供操作人员判别是否为纯化菌落。菌落必须获菌从大都稀释的区域表现汇合成长 (late log期)单独的条纹轴。获菌这些区域典型的区块有大多取稳定的脂肪酸成份来自于接种曾被只够的稀释去引起在充足的成长的菌落不需限制的营养补给。最佳的获菌的区域在第三区。注意事项: 最佳的获菌区域为第三区。成长较慢的微生物也许需要增加每次利用接种环在以下的四区划线技术通过二次增加为四至六次。也许也可利用取第二区的微生物。如果从培养皿中正确的区域取出微生物但会引起极差的数据库吻合，从第三区取出的微生物是最佳的；然而，如果较须生

9、长的微生物也可从第1及2区取出。从培养皿中取出要培养的微生物，轻括培养皿的表面利用无菌4mm接种环。当轻微的转动接种环利用前后移动取出菌落。一个堆积4mm接种环(约 40mg)湿重的菌落充足的原料的过程。有些培养将不会粘着良好在金属的接种环。塑料的接种环，Pasteur pipette融解在小的接种环，或较小直径的白线环可以用来获菌这样的培养。确信维持相同份量的微生物相同于堆积4mm接种环提供的。可以经由显具的总区域计数在最终的报告中或太少量的操作微生物会被判定出。注意事项: 在下一个步骤执行前确认盖子必须完成吻合试管。l 放入接种环夹带者菌体进入一个干净，干燥13mmx100mm有螺旋盖的培

10、养试管。抹拭菌种脱离接种环在内底部的表面约在培养管底部约10mm的地方。移开及无菌接种环。l 如果未做请确认培养管中有标示萃取的号码(从Extriction Log Sheet)一致性的获菌培养皿。利用实验专用的笔直接写在玻璃上。如果足够的先前清洁，培养管可以再使用获得微生物从每个培养皿中在每批皂化的步骤之前。2 皂化(Saponification)强烈的甲醇基础件随着加热杀菌及溶解细菌。脂肪酸将切割从细胞的脂质和改变到它们的钠盐。注意事项: 利用沸腾或循环的水浴。加热板或其它加热的方式意指不用适当的加热的转移移和温度控制在此步骤.。 图2-7-皂化步骤l 注入1.00.1ml的试剂1，以甲醇

11、为基础加入此次所有的样品。l 锁紧每个试管利用一个干净Telfon-lined螺旋盖子。l 震荡试管5-10秒。l 此批的所有样品试管在试管架上放入沸水或循环水石95-100的水浴中。注意事项: 加热已锁紧的试管会产生压力划伤或裂缝玻璃制品能够破裂。建议加热时利用化学安全盖或利用塑料盾。全程穿戴安全护目镜。l 五分钟之后，从沸腾的水中移开试管并轻微的冷却它不要打开盖子，震荡每支试管5-10秒再放试管回水浴中。l 确认试管漏损,此刻是否有气泡在试管中升起为证据,再栓紧有漏的试管的盖子，如果继续发泡，样品必须在室温下回到室温的温度然后转移到新的培养试管。l 继续加热这些试管在水浴中增长到25分钟。

12、l 皂化在水浴中总共约30分钟以后，移开和放置试管架在冷却轻拍平底去冷却。冰水是不被建议使用的。3 甲基化(Methylation)甲基化转换脂肪酸(as sodium salts)成甲基脂脂肪酸(fatty acid methyl esters),以增加脂肪酸的挥发性以供GC分析利用。图2-8-甲基化步骤l 开盖加入Reagent 2，2.00.1ml为甲基化试剂，注入每个试管。l 栓紧盖子震荡液体5-10秒。因为过量试剂，颗粒促使加快(salt)也许含形成。继续前进必须跟随：l 水浴加热试管80, 10分钟。l 移开且快速冷却至室温利用一槽冷水龙头水不建议使用冰水，摇晃试管促成 至冷却的过

13、程。注意事项:超过时间和温度在此步骤期间可以降低环丙烷抑制成份，可以变更脂肪酸的描绘和被取名的微生物。4 萃取(Extraction)甲基脂脂肪酸移出从酸性似水部份和转移到一个有机的部份伴随着液体的萃取过程。注意事项: Hexanel/MTBE是可燃的。熄灭所有可燃物和当此些溶剂(solvents)为燃烧来源。图2-9-萃取步骤l 加入1.250.1ml 的试剂3-萃取溶剂在每个试管中。l 盖紧盖子，放此批的试管在一个实验室的旋转器及温和混合旋转10分钟。l 打开管盖，利用干净的Pasteur Pipette取出每个样品的移开及丢弃似水(下面)部位。5. 基本洗涤(Base Wash)一种稀释

14、基础的溶液添加到样品的前处理管中去移去自由的脂肪酸和剩余试剂从有机的萃取中。剩余试剂将会损坏色谱分析的系统，会引起在末尾和损失氢气甲基脂脂肪酸(hydroxy fatty acid methyl esters)。图2-10-基本洗涤步骤l 加入3.00.21ml试剂4，基本洗涤至每个试管。l 栓紧盖子和温和地震荡试管利用旋转的方式5分钟。l 短暂约三分钟的离心在2000 rpm被建议。当乳状液被呈现出使用两层液面的接口更清楚。注意事项: 检试萃取试管和水温在加入试剂前。选择地:少数滴的标准ACS等级NaCl/水溶液可添加在试管中以增加切断乳剂。握着试管置垂直状和震荡它快速地介于在两手掌间，并且

15、允许它停留数分钟。萃取物移至样品小瓶(Transfer of Extract to Sample Vial)l 标示样品小瓶以供萃取鉴定。操作人员必须使用添加数目或部份的信息来自于”Sample ID” 区域中来自于萃取记录单(Extraction Log Sheet)独一的协助样品瓶登入和在萃取记录单相同。注意事项: 螺旋盖子的样品小瓶也可使用或可容易的来自于实验室供给的公司。利用实验室专用笔去标示样品小瓶胶带标示将不可靠。因此在样品瓶和也许操作干扰自动液体采样器瓶子夹子。l 打开每个试管的盖子，利用干净的Pasteur pipette在每个样品中，移出下层有机体约2/3从每支试管中移到干净

16、的GC样品小瓶。两层的液面有时会不易看见，必须小心不可取出任何似水部份(下面)部份进入自动的样品小瓶。l 定型盖子在样品小瓶上。l 确认盖子紧密在瓶上试子转动盖子当握着此小瓶。必须闪避出粗糙扭转要求小的上方螺旋瓶子，如果太松，调整盖子加盖器具(Stop screw in the handle)和重新定型样品小瓶。当所有的样品萃取液移至样品小瓶中，操作人员必须已经输入自动采样及开始执行样品下一章将会讨论此点。延迟样品前置处理(Delay During Sample Preparation) 理想中，样品的过程必须持续执行非中断当菌种被获菌后。如果有必要延迟样品处理的步骤，有几个步骤是当样品可以停在那引发较少的在分析脂肪酸的影响。l 依照获菌步骤在加入reagent 1之前，样品可被保存在培养中12个小时或快速冷冻。如果有大量的样品要被处理，将培养皿取出从培养