专题2土壤中分解尿素的细菌的分离和计数

1、专题专题2 2微生物的培养和应用微生物的培养和应用合肥八中 宋 晖2.1 微生物的实验室培养2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数2.3 分解纤维素的微生物的分离尿素co(nh2)2重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为nh3才能被植物吸收利用 co(nh2)2 + h2o co2 +2nh3细菌脲酶细菌脲酶课题目的：分离产生课题目的：分离产生脲酶脲酶的细菌的细菌（1）自然界中目的菌株筛选的依据是根据它对 的要求，到相应的环境中去寻找。（2）实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于 生长的条件(包括营养、温度、ph等)，同时 或 其他微生物生长。生存环境目的菌株抑制阻止v（一）筛选菌株（一）

2、筛选菌株提出的问题 如何寻找耐高温的酶？ 选择培养基： 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。菌株： 纯且活状态所保存的菌种 。v（一）筛选菌株（一）筛选菌株khkh2 2popo4 4 1.4g 1.4g nahpo nahpo4 4 2.1g 2.1g mgso mgso4 4 h h2 2o 0.2go 0.2g 葡萄糖葡萄糖 10.0g10.0g 尿素尿素 1.0g1.0g 琼脂琼脂 15.0g15.0g 将上述物质溶解后，将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到用蒸馏水定容到1000ml1000ml。 该培养基的配方中，为该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源

3、和氮微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？源的分别是什么物质？ 此配方能否筛选出产生此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？脲酶的细菌？为什么？碳源：葡萄糖、尿素碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素氮源：尿素能。只有产生脲酶的能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮细菌能利用尿素作为氮源而生存。源而生存。以尿素唯一氮源以尿素唯一氮源v（二）统计菌落数目：（二）统计菌落数目： 1、活体计数法（稀释涂布平板） （1）操作方法： 稀释涂布平板统计菌落数 （2）原理： 1个菌落1个活菌 v（二）统计菌落数目：（二）统计菌落数目： 1、活体计数法（稀释涂布平板）（3）统计原则 选 30 300 个菌落的平板

4、统计 每个稀释度取3个平板取其平均值为什么？例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为从对应稀释倍数为10106 6的培养基中，得到以下两种统计结果。的培养基中，得到以下两种统计结果。1 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230230。2 2、乙同学在该浓度下涂布了、乙同学在该浓度下涂布了a a、b b、c c三个平板，统计的菌落数三个平板，统计的菌落数分别为分别为2121、212212、256256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值，该同学以

5、这三个平板上菌落数的平均值163163作为统计结果。作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？ 甲：没有甲：没有重复实验重复实验（至少涂布（至少涂布3 3个平板）个平板） 乙：乙：a a组结果误差过大，不应用于计算平均值组结果误差过大，不应用于计算平均值（4 4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低低，因，因此统计结果一般用菌落数表示。此统计结果一般用菌落数表示。 每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数= =（c/v)c/v)* * m m c: c:某一稀释度下平板上生

6、长的平均菌落数；某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； v: v:所用稀释液的体积；所用稀释液的体积；m:m:稀释倍数。稀释倍数。为什么？2 2、显微镜直接计数、显微镜直接计数 利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为稀释倍数为10106 6的培养基中，的培养基中，a a、b b两同学分别得到以下两种统计两同学分别得到以下两种统计结果。结果。 1 1、a a同学筛选出同学筛选出150150个菌落。个菌落。 2 2、b b同学筛选出同学筛选出5050个菌落。个菌落。 b b认为认为a a的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含的

7、培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。a a确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。 请你帮助请你帮助a a同学改进实验，提供具有说明了的证据。同学改进实验，提供具有说明了的证据。 设置对照设置对照同等条件下，培养空白培养基同等条件下，培养空白培养基（三）设置对照（三）设置对照 1 1、设置对照的目的：、设置对照的目的： 排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。提

8、高实验结果的可信度。 对照实验对照实验是指除了是指除了 被测试被测试 的条件外，其他条件的条件外，其他条件都都 相同相同 的实验。满足该条件的称为的实验。满足该条件的称为 对照对照组，未满组，未满足该条件的称为足该条件的称为 实验实验 组。组。 （一）土壤取样（一）土壤取样 1 1、天然培养基和合成培养基：、天然培养基和合成培养基： 2 2、土壤取样：、土壤取样： （1 1）取样的位置：）取样的位置： 土壤土壤，天然培养基，含有大量的微生物，天然培养基，含有大量的微生物，其中其中7070 9090是细菌。在富含有机质的土壤是细菌。在富含有机质的土壤层的层的3 3 8cm8cm处中分布着绝大多数

9、的细菌。处中分布着绝大多数的细菌。 （2 2）取样要求：铲去表层土。）取样要求：铲去表层土。 菌落计数菌落计数配制土壤溶配制土壤溶液液系列稀释系列稀释涂布平板与涂布平板与培养培养（二）样品稀释 （1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液 （2）测放线菌：一般用103、104、105稀释液 （3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液原则：确保平板上的菌落数在30 300之间。（三）微生物的培养与观察（三）微生物的培养与观察 1 1、接种：用适当的稀释液作涂布平板、接种：用适当的稀释液作涂布平板 2 2、培养：细菌：、培养：细菌：3030 3737，1 1 2d;2d; 放线菌放线

10、菌:25:25 28, 528, 5 7d;7d; 霉菌霉菌: 25: 25 28, 328, 3 4d.4d. 3 3、观察：、观察：a.a.每每24h24h统计一次菌落数目统计一次菌落数目 b.b.以以“稳定稳定菌落菌落”为观察对象为观察对象（四）鉴定：筛选后必鉴定（四）鉴定：筛选后必鉴定鉴别培养基：不影响微生物的生存鉴别培养基：不影响微生物的生存 酚红培养基：酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨原理：脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强培养基碱性增强 酚红变红酚红变红脲脲酶阳性酶阳性(1)作样品系列稀释液作样品系列稀释液 (2)用适当的稀释液涂布

11、平板用适当的稀释液涂布平板 在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落特征。特征。内容现象结论有无杂菌污染的判断对照的培养皿中无菌落生长未被杂菌污染培养物中菌落数偏高被杂菌污染菌落形态多样，菌落数偏高培养物中混入其他杂菌选择培养基的筛选作用牛肉膏培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目选择培养基具有筛选作用样品的稀释操作得到三个或三个以上菌落数目在30300的平板操作成功重复组的结果若选取同一种土样，统计结果应接近v特别提示特别提示(1)不同细菌的菌落在大小、形状、光泽

12、度、不同细菌的菌落在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面的特征不同，可以作为菌种鉴颜色、硬度、透明度等方面的特征不同，可以作为菌种鉴定的重要依据。定的重要依据。v(2)进行活菌计数时，进行活菌计数时，统计的菌落数往往比活菌的实际数统计的菌落数往往比活菌的实际数目低目低，这是因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察，这是因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。到的只是一个菌落。v(3)选择培养基一般只生长具有特定代谢特性的微生物，选择培养基一般只生长具有特定代谢特性的微生物，鉴别培养基可以存在其他微生物，而且能鉴别特定的微生鉴别培养基可以存在其他微生物，而且能鉴别特定的

13、微生物。物。 【例例1】 尿尿素是一种重要的农业肥料，但若不素是一种重要的农业肥料，但若不经过细菌分解，就不能更好地被植物利用。生经过细菌分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中的微生物对尿素是否有分解作试图探究土壤中的微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌解尿素的细菌(目的菌目的菌)。培养基成分如表所示，。培养基成分如表所示，实验步骤如图所示。请分析回答问题。实验步骤如图所示。请分析回答问题。微生物的分离 (1)培养基中加入尿素的

14、目的是筛选培养基中加入尿素的目的是筛选_，这，这种培养基属于种培养基属于_培养基。培养基。 琼脂15 g尿素1 g葡萄糖10 gmgso47h2o0.2 gna2hpo42.1 gkh2po41.4 g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到100 ml (2)“目的菌目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的养基中的_和和_，实验需要振荡培养，实验需要振荡培养，原因是原因是_。(3)转为固体培养基时，常采用转为固体培养基时，常采用_的方法接的方法接种，获得单菌落后继续筛选。种，获得单菌落后继续筛选。(4)下列材料或用具：培养细菌用的培养基与培下列材料或用具：培养细菌

15、用的培养基与培养皿；玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管；实验养皿；玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管；实验操作者的双手。其中需要灭菌的是操作者的双手。其中需要灭菌的是_；需；需要消毒的是要消毒的是_。(填序号填序号)(5)在进行分离分解尿素的细菌的实验时，在进行分离分解尿素的细菌的实验时，a同学同学从培养基上筛选出大约从培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学个菌落，而其他同学只筛选出大约只筛选出大约50个菌落。个菌落。a同学的实验结果产生同学的实验结果产生的原因可能有的原因可能有_。(填序号填序号)由于土样不同由于土样不同 由于培养基污染由于培养基污染由于操作失误由于操作失误 没有设置对照没有设置对照思维

16、导图：思维导图：深度剖析深度剖析(1)培养基中加入尿素的目的是筛选尿培养基中加入尿素的目的是筛选尿素细菌。素细菌。(2)尿素可为尿素细菌提供氮源，震荡可为目的菌尿素可为尿素细菌提供氮源，震荡可为目的菌株提供氧气。株提供氧气。(3)在固体培养基中接种常用稀释涂布平板法和平在固体培养基中接种常用稀释涂布平板法和平板划线法。板划线法。(4)操作器械需灭菌，操作者双手需消毒。操作器械需灭菌，操作者双手需消毒。(5)土样不同、培养基污染、操作失误均可能导致土样不同、培养基污染、操作失误均可能导致计数误差。计数误差。答案答案(1)目目的菌选择的菌选择(2)尿素葡萄糖为目的菌提供氧气尿素葡萄糖为目的菌提供氧

17、气(3)稀释涂布平板稀释涂布平板(平板划线平板划线)(4)和和(5)思维拓展思维拓展(1)利用选择培养基设计实验分离纯化利用选择培养基设计实验分离纯化微生物。微生物。真菌：用含青霉素的培养基分离。真菌：用含青霉素的培养基分离。金黄色葡萄球菌：用含高浓度食盐水的培养基金黄色葡萄球菌：用含高浓度食盐水的培养基分离。分离。固氮微生物：用无氮培养基分离。固氮微生物：用无氮培养基分离。自养型微生物：用含无机碳源的培养基分离。自养型微生物：用含无机碳源的培养基分离。光合细菌：用含无机碳源的培养基在无氧而有光合细菌：用含无机碳源的培养基在无氧而有光照的环境中分离。光照的环境中分离。厌氧型和兼性厌氧型微生物：

18、用普通培养基在厌氧型和兼性厌氧型微生物：用普通培养基在无氧条件下分离。无氧条件下分离。乳酸菌：用乳酸含量较高，乳酸菌：用乳酸含量较高，ph较低的普通培较低的普通培养基分离。养基分离。假单胞杆菌：用石油作为唯一碳源的培养基分假单胞杆菌：用石油作为唯一碳源的培养基分离。离。(2)微生物分离与计数中两种对照组的作用：微生物分离与计数中两种对照组的作用：判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的培养基同时进行培养。培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培肉膏蛋白胨

19、培养基进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目，进行对比得出结论。养基上的菌落数目，进行对比得出结论。【例例2】 下下列是关于列是关于“检测土壤中细菌总数检测土壤中细菌总数”实实验操作的叙述中，错误的是验操作的叙述中，错误的是()。a用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板高温、高压灭菌后倒平板b取取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌倍的土壤稀释液和无菌水各水各0.1 ml，分别涂布于各组平板上，分别涂布于各组平板上c将实验组和对照组平板倒置，将实验组和对照组平板倒置，37 恒温恒温培养培养2448hd确定对照组无菌后，选择菌落数在确

20、定对照组无菌后，选择菌落数在300以以上的实验组平板进行计数上的实验组平板进行计数微生物的计数 思维导图：思维导图：深度剖析深度剖析确定对照组无菌后，选择菌落数在确定对照组无菌后，选择菌落数在30300的平板进行计数，的平板进行计数，d错；错；a是培养基的灭是培养基的灭菌方法，菌方法，b设置了一系列对照实验，设置了一系列对照实验，c是细菌的培是细菌的培养方法，养方法，a、b、c三个选项均是正确的。三个选项均是正确的。答案答案d旁栏思考题旁栏思考题1想想一想，如何从平板上的菌落数推测出每一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？克样品中的菌落数？答案答案统统计某一稀释度下平板上的菌落数

21、，最计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计好能统计3个平板，计算出平板上的菌落数的平均个平板，计算出平板上的菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。值，然后按课本旁栏的公式进行计算。2为什么分离不同的微生物要采用不同的稀为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？答案答案这这是因为土壤中各类微生物的数量是因为土壤中各类微生物的数量(单单位：株位：株/kg)是不同的，例如在干旱土壤中的上层是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中，好氧及兼性厌氧细菌数约为样本中，好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放万，放线菌数约为线菌数约为477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.1万。因