真菌荧光原位杂交技术-w

1、真菌荧光原位杂交技术-吴松松第一步：荧光探针标记。1， 利用已知的特异序列送公司合成探针。各种情况的探针均适合，7kb，1kb的片段效果较差。1DNA polymerase buffer（1） 5 ldNTP（10M） 5 lBio-11-dUTP or Dig-11-dUTP（1mM） 1.2 lDNase (0.005U/l) 1lDNA polymerase (coli.10U/) 1.2lDNA（2.5g） XlddH2O 36.6-XlTotal 50l混匀后置于原位PCR或者于水浴锅中154h，然后利用1的琼脂糖凝胶检测片段大小，在100500bp左右表示酶切完全，此时可停止反应。

2、另有FISH Tag DNA Multicolor Kit中也是切口平移法，但探针标记时需结合荧光染料，步骤比较复杂。3， 随机引物法。用随机引物合成探针，此种方法适合cDNA片段为5001000bp的片段。500ngDNA X l2.5X Random Primers Solution: 20 l10X dNTP Mixture: 5 lddH2O 24-XlKlenow Fragment 1 l1.冰上操作：cDNA大约500 ng DNA（5-20 l）的离心管中加入20 l 2.5X Random PrimersSolution.于沸水中变性5min，立即放于冰上2. 将融化的10X

3、dNTP Mixture及ddH2O提前放于冰上并依次加入，轻轻混匀。3. 加入 1 l Klenow Fragmen轻轻混匀（剧烈震荡酶易失活），并低速离心30sce。4.37孵育60min后加入5 l Stop Buffer。5.无水乙醇或异丙醇沉淀（加核酸助沉剂），75%乙醇清洗沉淀并用50l DEPC-H2O溶解。 6.电泳检测探针质量。片段集中在250500bp质量较好，可用于原位杂交。第二步：样品的处理。1， PDB摇培35d的菌丝或者收集的真菌孢子分别用DEPC-H2O和1PBS清洗一次，8000rpm离心。2， CSK Buffer处理。加入CSK Buffer（0.5%Tri

4、tonX-100,，10 mM VRC或RRI）于4处理1012min。第三步：样品的酶解与固定。1， 用4%的多聚甲醛浸泡，于4暗处理1-4h。2， 挑取菌丝或吸取孢子均匀涂与PE玻片上，风干使样品固定于玻片上。3， 用DEPC-treated水洗两次，风干。用1PBS渗透缓冲液覆盖（1%SDS，1% 裂解酶,0.1% 蜗牛酶），30C ，10min （实验中发现如果30min，菌丝降解的比较严重，因此可能应该减少酶解时间,15min），用DEPC处理的水冲洗，晾干。然后用50%，80%和100%的乙醇进行脱水处理，每次5min。（参考文献：Alpine Stream by New Taxo

5、n-Specific In Situ Detection of Freshwater Fungi） .第四步：杂交1， 杂交液准备。2hybridization buffer：4SSC，40%硫酸葡聚糖，2mg/ml BSA，50%甲酰胺。将探针于9598变性5min后立即冰浴3min，以探针终浓度为0.565ng/l的浓度加入冰上预冷的杂交缓冲液中。探针浓度可以降低到2.5ng/ul（经过实验，该浓度的探针还是高，不过没有检测探针的质量，可以先检测探针的质量，200-500bp）。2， 50l体积 1片 2片 4片 8片100%去离子甲酰胺 25 l 50l 100l 200l20SSC 5

6、 l 10l 20l 40l5%BSA(SS) 0.5l 1 l 2 l 4l10SDS 2.5 l 5 l 10l 20l50%硫酸葡聚糖 10 l 20l 40l 80l混匀，离心，然后加入3， Bio-11-dUTP标记的探针 50-100ng/片 10l 20l4， Dig-11-dUTP标记的探针 50-100ng/片 10l 20l5，6， 杂交。每玻片100150l杂交液滴加于样品上，盖膜与46暗盒（底部加入浸有2SSC的吸水纸）中孵育过夜（1620h）。第五步：杂交后洗脱。1， 用2SSC配制50的甲酰胺溶液，42水浴预热，同时预热两份2SSC溶液，预热20min以上。2， 把

7、玻片从湿盒中拿出，于2SSC揭膜。3， 于预热的甲酰胺中，42摇床摇10min，转入预热的2SSC中摇两次，每次5 min。第六步：标抗及结合链霉亲和素。1， 地高辛标抗。室温的2SSC摇一次，5 min。4SSC/Tween 20(0.2%)摇一次，5 min，（配制：1L 4SSC加Tween 2ml）。每片加新鲜的5BSA（4片配制：0.1gBSA + 2ml1PBS）100l盖膜，室温放置5 min，直接用镊子揭去盖膜。（以后每步避光）配制anti-dig FITC溶液（用5BSA稀释75倍），每片加100l，盖膜后湿盒中37温育1h。4SSC/Tween 20(0.2%)摇洗3次，每

8、次5min，1PBS缓冲液中洗1次5 min。2， 生物素结合链霉亲和素。1PBS漂洗一次，5min。5的BSA100l每片，盖膜，室温放置5min, 揭膜。用1：40配置Cy3耦联的链亲和素。每片50l，盖膜，湿盒37度温育30 min1PBS洗三次，每次5 min第七步：DAPI负染与荧光信号检测1，5g/ml的DAPI每片100l。7， 盖膜室温放置15 min，1PBS揭膜。8， 每片加抗荧光猝灭剂一滴（10l枪）。3， 用干净的盖片盖好，于荧光显微镜下检测。4避光保存，完想保留玻片时：2SSC 摇10min,70%乙醇摇3min，100%乙醇摇3min,空气干燥。所需试剂准备20SS

9、C：0.3M sodium citrate, 3M NaCl(pH 7.0)CSK Buffer：100 mMNaCl, 300 mM sucrose，3 mM MgCl2，10 mM PIPES (pH 6.8)Store at 4C.1PBS：NaCl 137mM，KCl 2.7mM，Na2HPO4 10mM， KH2PO4 2mM（pH7.27.4）4%多聚甲醛：2g多聚甲醛加入30ml1PBS中，60加热10min后加入少量0.1M NaOH摇匀至多聚甲醛完全溶解后1PBS定容至50ml。10ml:0.4g多聚甲醛 加7ml水，加40ul 5M NaOH，在定容至10ml注意事项1、做

10、RNA FISH实验，首先要防止RNA酶的污染。操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套，并经常更换。所有实验用到玻璃制品都要高温灭菌，且各种溶液要用DEPC水配制。 2、去污剂triton X-100处理的目的是增加细胞的通透性，利于杂交探针进入细胞，其处理时间因应不同的细胞而有所不同。注意：过度的去污剂处可能会引起靶核酸的丢失。 3、荧光见光就会淬灭，因此操作过程要做好避光。4、实验所用探针是双链DNA探针，而杂交反应进行时，探针和靶核酸都必须是单链的。因此在做RNA FISH杂交前，探针必须进行变性。探针变性后要立即进行杂交反应，不然解链的探针又会重新复性。5、探针的浓度因其种类和实验要求而有所不同，一般为0.5-5ng/ul。合适的探针浓度要通过实验才能确定。6、杂交反应时，盖玻片不可有气泡，不然妨碍探针与细胞的接触。7、玻片经antifade reagent封片后可在4暗处保存2-3星期而不失去全部荧光，但FISH操作完成后要及时观察采图，地高辛标记的隔夜观察效果较好。 8、如果镜检时，观察到有非