西南大学分子生物学

1、分子生物学添加时间：2008.10.29 | 作者：admin实验一 仪器介绍和实验规范训练及实验准备一、实验目的1. 系统回顾分子生物学实验技术的发展。2. 了解分子生物学特别是关于分子克隆的实验方法和理论、了解分子生物学实验安全规则和注意事项。3. 掌握分子生物学实验所用试剂的配制过程。二、实验内容1. 分子生物学实验的条件与设施 , 包括各种仪器设备、房屋设置等；2. 分子克隆的常规实验方法和理论；3. 分子生物学实验安全规则和注意事项；4. 配制近期实验所需要的公共试剂。三、实验所需仪器设备1. 多媒体设备2. 实验所需仪器37 培养箱、温控空气摇床、温控水浴摇床、超净工作台( 双人双

2、面)、电子天平、双蒸水器、高压锅、磁力搅拌器、移液枪、振荡器、-20冰箱、制冰机、 -70冰箱、高温烘箱、离心管、枪头、烧杯、量筒等。3. 实验药品氯化钠、氢氧化钠、 Tris 碱、琼脂糖、盐酸、酵母提取物、胰蛋白胨、琼脂粉、SDS 、 EDTA 、无水乙醇、 95% 乙醇、低熔点琼脂糖。四、注意事项1. 高压蒸气灭菌（1）紧盖和开盖时，都应采用对角式均匀地转动紧固螺栓，并且双手同时操作。切不可采用将紧固螺栓逐个拧紧或松开的方法。（2）灭菌结束以后，切勿过早打开排气阀，否则，开盖时试管内的培养基会由于内外压力不平衡而冲出管口，使棉塞上沾染培养基而发生污染。2. 紫外线防护在操作紫外装置时，注意

3、自我防护，避免直接接触紫外线，以防灼伤皮肤或眼睛。实验二 家蚕基因组DNA提取及检测一、实验目的1. 了解并掌握苯酚法提取动物基因组 DNA 的原理和步骤。2. 了解DNA 浓度和质量测定的技术。二、实验原理酚、氯仿是蛋白质变性剂，能有效出去核蛋白，使核酸从核蛋白复合体中分离出来。氯仿还能加速有机相与液相的分层，少许异戊醇能稳定界面，减少蛋白质变性操作过程中产生气泡。三、实验材料、试剂和设备1. 实验材料和试剂材料：家蚕蛹试剂：液氮、平衡酚（Tris饱和）、1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）、0.5 mol/L EDTA （pH 8.0）、 TE（PH8.0）、10mol/L CH

4、3COONH4 、70%乙醇、20mg/ml Proteinase K、10mg/ml RNA酶。抽提缓冲液： 10 m mol/L Tris-Cl（pH8.0）0.1 mol/L EDTA （pH 8.0）0.5% SDS加样缓冲液： 0.25%溴酚蓝；0.25%二甲苯青（FF）；15%聚蔗糖水溶液2. 实验仪器冷冻离心机、常温离心机、电泳仪、核酸电泳槽、核酸蛋白定量仪、37培养箱、温控水浴摇床等。四、操作步骤1. 将家蚕蛹放入预冷的研钵中，加入液氮后快速研磨成粉末状；加入1mL的抽提缓冲液，轻轻摇匀，形成匀浆状，将匀浆液转至5mL无菌离心管中；再用1mL的抽提缓冲液清洗研钵，并将洗液转入同

5、样的离心管中，然后加入蛋白酶K至终浓度100g/mL，52水浴保温5h或过夜；2. 加入等体积平衡酚，温和振荡，摇匀15 min（置-20，5-10 min）；4 12000 rpm离心10 min，将粘稠的上清液转移到离心管中；3. 再用酚氯仿（11），氯仿各抽提一次10 min，然后412000rpm离心10 min；4. 移出上层水相，加入2-2.5体积冰冻乙醇，转动离心管使溶液充分混合，DNA立即形成沉淀；4，7000 rpm离心10 min或用高压灭菌过的玻璃棒/消毒牙签将DNA沉淀从乙醇溶液中移出；5. 用70%的乙醇洗涤DNA沉淀2次，晾干后，加入350 L TE（pH8.0），

6、并加入RNAase使终浓度为50 g/mL，在37培育4h；6. 将DNA转移到1.5mL的无菌离心管中，再加入TE（pH 8.0）350 L到5mL无菌离心管中洗涤，并将洗液转入同样的1.5mL离心管中；7. 再用等体积的酚，酚：氯仿（11），氯仿各抽提一次，然后加入2-2.5体积冰冻乙醇，转动离心管使溶液充分混合，DNA立即形成沉淀；8. 用70%的乙醇洗涤DNA沉淀2次，后晾干，加入TE 200 L溶解DNA；9. 取DNA 4L与2L 含有0.3%Goldview染料的6上样缓冲液混匀，放置5min后，点样到0.8%琼脂糖凝胶中，以 2.5-5 v/cm电泳；10. 紫外灯下观察拍照；

7、11. 取2L DNA溶液，用98LTE稀释50倍，然后用分光度计检测DNA的浓度和纯度。注：第9、10、11步将在实验三中详细讲解。实验三 基因组DNA的检测一、实验目的1. 掌握基因组DNA检测方法。2. 了解不同类型凝胶电泳的适用范围。二、实验原理1. 凝胶检测一般来讲，应用凝胶电泳技术分离核酸比分离蛋白质要容易。核酸是带均匀负电荷的分子，对于双链DNA来说，基本不存在影响迁移率的复杂结构。影响核酸在凝胶上的迁移有多种重要的变量，这些变量包括：核酸的构象、凝胶孔径的大小、所用的电压的大小。在实际操作中，这意味着较大孔径的琼脂糖凝胶用于分离500-10000bp的片段，而较小孔径的聚丙烯酰

8、胺凝胶或筛分型琼脂糖凝胶则用于分离1000bp的片段。图4.1 基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图谱2. 紫外分光法检测DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性，核酸和核苷酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用E（P）来表示，E（P）为每升溶液中含有一摩尔原子核酸磷的消光值（即光密度或称光吸收）。RNA的E（P）260 nm（pH7）为77007800。RNA的含磷量约为9.5%，因此每毫升溶液含1微克RNA的光密度值相当于0.0220.

9、024。小牛胸腺DNA钠盐的E（P）260 nm（pH7）为6600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1微克DNA钠盐的光密度值为0.020。 蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。三、实验材料、试剂和设备1. 材料、试剂上次实验提取的家蚕基因组DNA电泳缓冲液染色物质（溴化乙锭、GoldView染料

10、等）电泳级琼脂糖加样缓冲液（6或10）DNA分子量标准（Marker）2. 设备水平凝胶电泳装置（恒流电源、凝胶样品梳、电泳槽、托胶板、灌胶平台）紫外分光光度计比色皿微波炉烧杯四、实验步骤（一）琼脂糖凝胶电泳检测1. 制备凝胶，将电泳缓冲液和电泳级琼脂糖在微波炉中或经高压熔化，混匀，加入适量GoldView染料，冷却至55，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳。表4.1 分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖浓度琼脂糖线性DNA片段的有效分离范围（kb）0.530-10.712-0.81.010-0.51.27-0.41.53-0.22. 待胶凝固后，从制胶平台上除去封带，拔出梳子，放入加有足够

11、电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面约1mm。3. 用适量的10加样缓冲液制备DNA样品，然后用移液器将样品加入样品孔中。一定要包括合适的DNA分子量标准物。4. 接通电极，使DNA向阳极移动，在1-10V/cm凝胶的电压降下进行电泳。5. 当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源。6. 已染色的凝胶可以直接在紫外透射仪上照相。或者，如果必要的话，先用0.5g/mL溴化乙锭染色10-30min，在水中脱色10-30min。（二）紫外分光光度法1. 开启紫外分光光度计，预热稳定10-30min。2. 用DNA溶解液（TE缓冲液）校正零点。3. 用DNA溶解液（TE缓冲

12、液）稀释DNA样品50倍，将稀释液转移到比色杯中。4. 读取230nm，260nm，280nm，310nm的OD值。5. 计算出浓度和OD比值。实验四 家蚕基因组DNA的PCR扩增及电泳检测一、实验目的1. 学习PCR反应的基本原理与实验技术；2. 了解引物设计的一般要求。二、实验原理单链DNA在互补寡聚核苷酸片段的引导下，可以利用DNA多聚酶按5一3方向复制出互补DNA。这时单链DNA称为模板DNA，寡聚核苷酸片段称为引物（P），合成的互补DNA称为产物DNA。双链DNA分子经高温变性后成为两条单链DNA，它们都可作为单链模板DNA，在相应的引物引导下，用DNA聚合酶复制出产物DNA。PCR

13、反应应用以上的基本过程，分别在待复制的已知序列DNA分子两端各设计一条引物，其中在DNA 5端的引物（P1）对应于上链DNA单链的序列，3端的引物（P2）对应于下链DNA单链的序列， P1和P2按5-3方向相向配置。在含有引物、DNA合成底物dNTPs （dATP、dCTP、dGTP、 dTTP4种脱氧核糖核苷酸等摩尔数混合物）的缓冲液中，通过高温变性，使双链DNA变成单链DNA模板，降低温度复性，使引物与模板DNA配对，利用DNA聚合酶便可合成产物DNA。引物和dNTPs过量，则在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产

14、物DNA可作为后一循环的模板DNA参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式扩增，所以这一反应称为链式扩增反应。理论上如果引物及dNTP的量能够满足，则这一过程可无限重复，使模板DNA无限扩增。PCR反应使几个DNA模板分子通过数小时扩增后增加到百万倍以上，因此能用微量样品获取目的基因，同时也完成了基因在体外的克隆，成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。 常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，反应循环数为2535，变性温度为94，复性温度为3755，合成延伸温度为72 DNA聚合酶为Taq酶（可耐受95左右的高温而不失活），DNA扩增倍数为106109。 四、操作步骤1. 在25

15、L的反应体系中加：10Taq DNA聚合酶 buffer 2.5 LMg2+ 1.5-2 mmol/LdNTPs 150-200mol/L家蚕基因组DNA 10-20 ngTaq DNA聚合酶 1 U引物（上下游） 1L加灭菌水至 25 L2. 在PCR仪上进行扩增，扩增程序为：94变性30s，Ta退火60s，72延伸90s，35个循环后接72 10 min；3. 与2L 6样缓冲液混匀，点样到1%琼脂糖凝胶中电泳；4. 扩增产物5-10 L 含有0.3%Goldview染料的6上样缓冲液混匀，放置5min后，点样到0.8%琼脂糖凝胶中，以 2.5-5 v/cm电泳；5. 紫外灯下观察拍照。实

16、验五 细菌的培养、感受态细胞的制作和转化一、实验目的1. 通过对牛肉膏蛋白胨培养基的配制，理解配制培养基的一般步骤和方法。2. 理解灭菌的基本原理以及实验室中常用的灭菌方法。3. 初步掌握细菌培养的基本技术。4. 掌握一步法制备新鲜感受态细胞的基本步骤。二、实验原理感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是

17、微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分

18、子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15的无菌甘油于-70保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。三、实验材料LB培养基(Luria Bertani培养基，Lysogeny broth培养基) 500 ml，配方如下：胰化蛋白胨（bacto-tryptone） 5 g酵母提取物（bacto-yeast extract） 2.5 gNaCl 5 g加水至 500ml。调pH至7后高温灭菌。如

19、需制成平板，调pH 后加入1.5%的琼脂粉再灭菌（每升培养基约17g）。四、操作步骤1. 受体菌的培养挑取单菌落到一含有100ml LB培养基的三角瓶中，37剧烈振荡培养约3hr到对数生长期。2. 感受态细胞的制备（1） 前夜接种受体菌（ DH5或 DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37摇床培养过夜（约16小时）；（2） 取 1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；（3）将 0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作(4) 吸取 1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分

20、钟；(5) 4下3000g冷冻离心5分钟；(6) 弃去上清，加入 100l预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；(7) 4下3000g冷冻离心5分钟；(8) 弃去上清，加入 100l预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；(9) 细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（ 15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（70）。3. 转化(1) 取200ul摇匀后的感受态细胞悬液，加入质粒4ul，用枪轻轻吹打均匀，冰浴30分钟。(2) 42,保温90秒钟后，迅速放入冰中，冰浴5min。(3) 加入37预热的1

21、ml的LB液体培养基，混匀。37培养1小时，使细胞恢复正常生长状态。(4) 3000rpm离心10分钟。(5) 弃去1ml上清，余下的200ul用枪轻轻吹打均匀，使细菌充分悬浮后均匀涂布于含Amp的筛选平板上。(6) 37正面向上放置半小时后，倒置培养812小时。对照1、以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与转化组相同。对照2、以同体积的50mM的CaCl2溶液代替感受态细胞悬液，其它操作与转化组相同。五、接种注意事项(1) 接种环（针）的箍处最易藏污纳垢，因此，接种环（针）箍处的灭菌尤为重要，稍有疏漏，将导致实验失败。可事先将这一部分插入体积分数为75%的酒精溶液中消毒，接种时再用火

22、烧灼，以彻底灭菌。(2) 接种划线时要注意三点：一是划线的方向应该从里往外；二是线条要细并且密；三是不要重复划线。实验六 外源DNA片段的连接、转化和蓝白斑筛选一、实验目的：1. 掌握DNA转化的基本的操作。2. 转化子的蓝白斑筛选。二、实验原理限制性内切酶可识别特定位点并切割 DNA 产生粘性末端或平端的外源片段，经 DNA 的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体 pUC18 多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。用于基因工程的许多质粒载体含有编码抗生素抗性的基因，如pBR322携带有氨苄青霉素抗性基因

23、（amp）和四环素抗性基因（tet）。这些基因作为载体的标记，其中一个（如amp）可以用来选择转化子。因转化子能在含有抗生素的琼脂糖培养基上形成菌落，而非转化的细胞被杀死。另一个基因（如tet）可以用作重组的质粒载体的标记，因为目标序列插入此基因导致插入失活。因此，用重组质粒转化的细胞仅对amp有抗性，而环状（天然）质粒转化的细胞对amp和tet都有抗性。PUC系列质粒携带有氨苄青霉素抗性基因，并在-半乳糖核苷酶的基因含有一个多克隆位点。-半乳糖核苷酶基因的插入失活可以被包含有一种合适的酶诱导物如异丙醇基硫代半乳糖苷（IPTG）和生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）的琼

24、脂培养基检测到。来源于有质粒的细胞的菌落呈蓝色，而含有重组分子的菌落呈白色。另有一些质粒使用不同的标记物，如荧光素酶基因可以在荧光素底物的存在下通过生物发光检测到。三、实验材料、试剂和实验仪器1. 实验材料和试剂材料：感受态细胞；试剂：PEG ( 聚乙二醇 8000) 、 DMSO 、氯化钙、 X-gal 、 IPTG 、 LB 平板培养基等。2. 实验仪器冷冻离心机、常温离心机、核酸蛋白定量仪、37 培养箱、温控空 气摇床、温控水浴摇床、超净工作台双人双面、电子天平、制冰机、 -10冰箱、高温 烘箱、离心管、枪头、烧杯、量筒等。四、操作步骤1. 用适当的限制酶消化质粒。于37保温2hr以上。

25、10酶解缓冲液 1ul质粒DNA（外源 DNA） 1ug限制酶 1U加TE至10ul2. 酚：氯仿（1：1）抽提和乙醇沉淀纯化DNA，然后用TE溶解。3. 设立如下连接反应混合液：0.1 ug载体DNA及12倍摩尔量的外源DNA10T4噬菌体DNA连接酶缓冲液 1 ul5 mol/L ATP 1 ulT4噬菌体DNA连接酶 0.1 U于16温育28 hr4. 12 ul反应混合液转化大肠杆菌感受态细胞。（参考感受态细胞的制备和转化）5. 在含相应抗生素或x-gal（puc系列质粒）的LB平板培养基上挑取一些独立的转化菌落，进行小规模培养，用“质粒DNA的快速制备”方法分离质粒DNA。6. 限制

26、酶消化，通过凝胶电泳进行分析。实验七 质粒DNA的分离纯化一、实验目的提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的碱变性法提取质粒DNA的方法。二、实验原理碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS

27、复合物等一起沉淀下来而被除去。三、实验材料、试剂和实验所需仪器（一）实验材料与试剂：溶液（溶菌液）： 50mmol/l 葡萄糖10mmol/l EDTA25mmol/l Tris-HCl （pH 8.0）溶液（碱性SDS溶液）：200mmol/l NA OH1% SDS（临用前用0.4 mol/L NaOH与2% SDS配制）溶液：乙酸钾 60.0 ml（5mol/L）冰乙酸 11.5 ml水 28.5 ml 所配成的溶液对钾是3molL，对乙酸根是5molL。其它试剂：LB液体培养基，冰乙醇，70%乙醇，TE，RNA酶，酚：氯仿（1：1），氯仿（二）、实验仪器常温离心机、核酸蛋白定量仪、37

28、 培养箱、温控空气摇床、温控水浴摇床、超净工作台双人双面等。四、操作步骤1、在5ml含相应抗生素Amp的LB液体培养基中接入单菌落，于37振荡培养过夜。2、将培养液转入1.5ml离心管中，10000rpm离心1min,倒掉培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。3、细菌沉淀重悬于100ul用冰预冷的溶液中，剧烈振荡。4、加200 ul新配制的溶液，快速颠倒离心管几次，冰上放置510min。5、加150 ul 用冰预冷的溶液，温和振荡，置于冰上 510min。6、10000 rpm离心5min，将上清转移至另一离心管中。7、用2倍体积的冰乙醇沉淀DNA，振荡混合，冰上放置20min。8、于410000rp

29、m离心10min,小心倒掉上清液,将离心管倒置于滤纸上使所有液体流出。9、用70%乙醇于4洗涤DNA沉淀两次，去上清，在空气中使核酸沉淀干燥10min。10、用100 ul TE溶解核酸沉淀后，加入RNA酶（终浓度至50 ug/ml）60保温30min，37保温60min。11、加入等量酚：氯仿（1：1）振荡混匀，10000 rpm离心5min，将上清转移至另一离心管中。12、加入等量氯仿，振荡混匀，10000rpm离心5 min，将上层水相转移至另一离心管中。13、重复79的步骤。13、用50 ul TE溶解DNA沉淀，紫外分光光度计测质粒DNA的浓度。贮存于4备用。实验八 质粒DNA的限制

30、性内切酶酶切一、实验目的l. 学习和掌握限制性内切酶的特性。2. 学习和掌握 DNA 的酶切消化技术。二、实验原理限制性内切酶能特异地结合于DNA序列的特异性位点上，并切割双链DNA。型酶的两种切割方式（粒性末端和平头末端）。绝大多数型酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异性序列(如EcoR识别6个核苷酸序列5-GGAATTC-3), 有少数酶识别更长的序列或简并序列。II酶切割位点在识别序列中，有的在对称处切割，产生平末端的DNA片断（如SamI: 5-CCCGGG-3）； 有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片断粘性末端， 如EcoR I 切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。5GAATTC3 5G AATTC33CTTAAG5 3CTTAA