整理慢病毒稳转细胞株步骤

1、竹密岂妨流水过蛮鬼2018.3山高哪碍野云飞稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及质粒的扩增提取）（大肠杆菌-80保存2-3年，质粒-20保存2-3年，病毒液-80保存1年）（1）载体质粒：两端的ltr、剪切位点、包装信号以及抗性或荧光基因、gag基因5端350bp的序列及位于env序列中的rre，含宿主rna聚合酶识别部分（2）包装质粒（pspax2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pmd2.g）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。2、包装细胞：293t细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：xtr

2、eme-gene（-20保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4保存，原材料室温保存）：5x peg8000/nacl溶液（聚乙二醇）：nacl 8.766 g; peg8000 50g溶解在200ml milli-q纯水中，高压蒸汽灭菌*也可直接从公司买来病毒液（-80封口膜封口冻存管保存，4保存3天）：滴度一般为108tu/ml6、10mg/ml polybrene（-20分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率210 倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（110g/

3、ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10105个293t细胞，加入全培养基双抗dmem 4-5ml，过夜2、配制5x peg8000/nacl溶液称取nacl 8.766 g; peg8000 50g溶解在200ml milli-q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4第二天1、配管试剂加样量/l推荐量/l、g合计a管plko.1/pcdh3206pspax21pmd2.g2opti200b管xtreme-gen

4、e6206opti200a+b混合室温静置20min2、加入2ml全培养基dmem3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293t细胞3、加入5ml 5xpeg8000/nacl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4过夜第六天1、4，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150l pbs，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50l分装，-80保存。慢病毒转染靶细胞前期预实验moi（步骤同正式试验）（见三2

5、,直接订购病毒液时才需要）细胞种类du145pc322rv1lncaprwpe-1moi2422前期测病毒滴度（稀释法，还有一种qpcr法见资料）1、第一天：准备96孔板，每孔加入10000个293t，为每个病毒准备20个孔（稀释10个浓度，各2个副孔）。放入37，5%co2培养箱中培养。2、第二天：在ep管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml ep管，每管加入207l培养液，往第一个管中加入23l病毒原液，混匀后，吸取23l加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度（1010-8）。吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。3、第

6、三天：换液4、第四天：观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为x和y，则滴度（tu/ml）=（x+y10）/2/x孔的病毒液的含量（l ）1000。（前面算出的是没l病毒量，所以乘于1000）第一天：1、种板（12/24孔板）需第二天为50%-70%，大约12孔板1105细胞种类种板数收获细胞数du145pc322rv1lncaprwpe-1第二天1、准备病毒液（可在第一天做）：在冰上融解2、准备完全培养基和 polybrene 混合物（1:1000-1:2000稀释，终浓度在5-10g/ml之间），加入相应培养板中（6孔板2ml，12孔板1ml，

7、24孔板500l）3、加入浓缩病毒液（12孔板30l-50l）（如果是直接购买病毒液需根据moi确定病毒液量加入病毒液，自己包的病毒可以）4、培养过夜，对polybrene毒性敏感的细胞在4-6小时候换液第三天1、对细胞进行换液第五天1、用药物进行稳定株的筛选（具体筛选药物根据载体内的基因定，用氨苄青霉素0.5g/ml-10g/ml）2、需设置空白对照（未处理细胞加入相同浓度氨苄青霉素，党对照全部死光为筛选周期）第六天之后（根据筛选周期）1、换液传代2、观察gfp报告基因确定转染效率，或用qrt-pcr确定转染效率三、注意事项及知识点1、名词解释（1）病毒感染复数（multiplicity o

8、f infection moi）：含义是感染时病毒与细胞数量的比值，即为每个细胞被多少个有活力病毒所感染2、慢病毒摸索时加入梯度（具体见自己的说明书）3、慢病毒的储存与稀释:可以将病毒暂时放置于4 保存；如需长期保存请放置于-80（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口） a病毒可以存放于-80 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度 b反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中按照每次的使用量进行分装。4、慢病毒载体示意图1载体质粒（plko.1 抑制载体，pcdh-gfp+puro过表达载体）：（1）5ltr：long te

9、rminal repeat即长末端重复序列，不编码蛋白质，但含有启动子，增强子等调控元件（2）包组信号：ltr-通过包装细胞的rna聚合酶转录为rna，通过信号起始包装（3）启动子、酶切位点和抗性基因（amp氨苄青霉素puro嘌呤霉素）（4）stuffer：目的基因插入位点（慢病毒载体可插入5kbp左右）（5）gfp：green fluorescent protein绿色荧光蛋白（6）wpre：woodchuck hepatitis virus (whp) posttranscriptional regulatory element 肝炎病毒转录后调控元件。转录后可形成三级结构，促进基因的表达（7）cppt/cts: 逆转录病毒顺式作用区域,其中该cppt和cts区域诱导三链结构（更新于2018.11）2包装质粒（1）gag