受体细胞课件

1、 (1)受体细胞受体细胞 (2)重组重组DNA分子转入受体细胞分子转入受体细胞 (3)重组子的筛选重组子的筛选目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞 第第1节节 受体细胞受体细胞受体细胞受体细胞(receptor cell)又称宿主细胞或寄主细胞(host cell)实验技术实验技术: 能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞实验目的实验目的: 有应用价值和理论研究价值可作为受体细胞的原则可作为受体细胞的原则:便于重组便于重组DNA分子导入分子导入便于重组便于重组DNA分子稳定存在于细胞中分子稳定存在于细胞中便于重组子的筛选便于重组子的筛选遗传稳定性高，易于扩大培养与发酵遗传稳定性高，易于扩大培

2、养与发酵安全性高，无致病性安全性高，无致病性最好是内源蛋白水解酶缺失或含量低最好是内源蛋白水解酶缺失或含量低密码子无明显偏爱性密码子无明显偏爱性具有较好的翻译后加工机制，便于真核基因的表达具有较好的翻译后加工机制，便于真核基因的表达理论与实践上具有较高的应用价值理论与实践上具有较高的应用价值一一.原核生物细胞原核生物细胞作为受体细胞的作为受体细胞的优点优点:(1)不具纤维素壁不具纤维素壁(2)无核膜无核膜(3)基因组简单，便于遗基因组简单，便于遗 传分析传分析(4)单细胞单细胞作为受体细胞的作为受体细胞的不足不足:(1)不具真核蛋白折叠系统不具真核蛋白折叠系统(2)不具真核蛋白加工系统不具真核

3、蛋白加工系统(3)蛋白酶降解异源蛋白蛋白酶降解异源蛋白目前作为受体菌的原核生物有目前作为受体菌的原核生物有:(1)大肠杆菌大肠杆菌 革兰氏阴性菌 a.基因组、遗传背景了解最清楚 b.易培养、繁殖迅速(2)枯草杆菌枯草杆菌 革兰氏阳性菌 a.具胞外酶分泌-调节基因，能将表达产物 分泌到培养基； b.无内毒素； c.易于保存与培养。 (3)蓝细菌蓝细菌 a.光能自养型，易于培养； b.与植物密码子和启动子的通用性， 易于表达植物基因二二.真菌细胞真菌细胞 低等真核生物，具有真核生物基因结 构、表达调控体系，具有真核的蛋白 折叠、加工与分泌系统酵母菌酵母菌 a.结构最简单的真核生物， 遗传背景较为清

4、楚 b.蛋白翻译后修饰加工系统 c.不含毒素 d.易培养 e.可分泌三三.植物细胞植物细胞具有纤维素参与组成的坚硬细胞壁原生质体原生质体转化转化(纤维素酶处理)基因枪或农杆菌基因枪或农杆菌直接转化直接转化植物细胞的突出优点植物细胞的突出优点:细胞具有全能性四四.动物细胞动物细胞 多采用生殖细胞、受精细胞或胚细胞，近 年用体细胞培养 常用的动物细胞受体常用的动物细胞受体: 小鼠L细胞、Hela细胞、猴肾细胞、中国 仓鼠卵巢细胞(CHO)等动物细胞的优点：动物细胞的优点： 可识别并除去内含子，加工成成熟mRNA b. 翻译后加工，产物具有较好的免疫原性 c. 易感染，遗传稳定 d. 可分泌表达产物

5、 缺点：缺点：a.组织培养技术要求较高，周期长，难度大第第2节节 重组重组DNA分子转入受体细胞分子转入受体细胞 转化转化(transformation) 重组DNA分子进入受体细胞，并在受体细胞内稳 定维持并表达的过程一一.重组重组DNA分子转入大肠杆菌分子转入大肠杆菌 细菌转化的本质细菌转化的本质(革兰氏阳性菌天然转化 局部原生质体化假说): a.细菌感受态形成 b.转化因子的吸收 c.整合复合前体形成 d.单链DNA转化因子的整合 e.转化子的形成供体菌供体菌受体菌受体菌感受态感受态单链整合、重组单链整合、重组转化子转化子非转化子非转化子对于来自于人工重组对于来自于人工重组DNA, 而非

6、供体菌的游离而非供体菌的游离DNA，革兰氏阴性菌大肠杆菌中，采用人工方法制备感受态革兰氏阴性菌大肠杆菌中，采用人工方法制备感受态1.Ca2+诱导大肠杆菌转化法诱导大肠杆菌转化法制备感受态细胞制备感受态细胞 1970年，Mandel和Higa用Ca2+Cl2处理大肠杆菌，促进 了大肠杆菌对噬菌体DNA的吸收 1972年，Cohen实现了质粒DNA对大肠杆菌的转化 a.培养生命旺盛的菌体培养生命旺盛的菌体(对数生长期对数生长期) A600约等于约等于0.4b.沉淀细菌沉淀细菌 5000g离心离心5minc.化合物处理化合物处理(CaCl2处理) 冰浴菌液冰浴菌液(4C)加入等体积加入等体积CaCl

7、2溶液溶液, 15min冰浴菌液冰浴菌液(4C)4000g离心离心5min，弃去上清液，弃去上清液冰浴菌液冰浴菌液(4C)中加入中加入等体积等体积CaCl2溶液溶液, 放置放置15min沉淀用沉淀用1/15原体积原体积CaCl2溶液溶液重悬重悬4C下保存，备用下保存，备用(2天内天内)DNA分子转化感受态细胞分子转化感受态细胞 感受态细胞加入感受态细胞加入DNA分子分子 42C水浴上放置水浴上放置45秒秒(热激热激) 会有会有DNA分子进入大肠杆菌细胞里分子进入大肠杆菌细胞里CaCl2引起大肠杆菌细胞处于感受态引起大肠杆菌细胞处于感受态可能的原因可能的原因: Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构

8、，使内使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使内 外膜间核酸酶解离，诱导形成感受态外膜间核酸酶解离，诱导形成感受态 Ca2+能与能与DNA分子结合，使分子结合，使DNA与与Ca2+ 复合物接近细胞膜，当复合物接近细胞膜，当42C热激处理热激处理 时，膜出现间隙，时，膜出现间隙，DNA分子进入分子进入Flash2Flash12. 电穿孔转化法电穿孔转化法 1988年，Dower等人转化大肠杆菌基本原理基本原理:高压电脉冲导至电穿孔(electro poration)制备感受态方法制备感受态方法:冰浴 重悬3. 三亲本杂交转化大肠杆菌法三亲本杂交转化大肠杆菌法 三亲杂交三亲杂交(tri-parental m

9、ating)结合转移法结合转移法 基于非结合型质粒的迁移作用建立迁移作用建立的方法 适于难以采用Ca2+诱导法和电穿孔法的受体菌三亲杂交过程三亲杂交过程 结合型的结合型的辅助质粒辅助质粒 含重组含重组DNA质粒的供体细胞质粒的供体细胞受体细胞受体细胞迁移作用迁移作用4. 转化效率计算及影响因素转化效率计算及影响因素 转化效率两种表示方式转化效率两种表示方式: 转化率转化率 = 转化子转化子 / DNA分子个数分子个数 或或 转化率转化率 = 转化子转化子 / DNA质量质量 转化率转化率 = 转化子转化子 / 受体菌总数受体菌总数 转化效率的影响因素转化效率的影响因素 质粒大小、结构(超螺旋与

10、否)、与宿主亲和 性、质粒浓度(与转化效率正比例关系) 不同受体细胞具不同转化效率 转化方法不同具不同转化效率 电穿孔法 Ca2+诱导法三亲杂交法二二.重组重组噬菌体噬菌体DNA分子转导大肠杆菌分子转导大肠杆菌 转染转染(transfection) 与质粒DNA转化转化方式相似，重组噬菌体DNA 分子 直接导入到受体细胞 重组型转化率重组型转化率103-104 pfu (plaue forming uint) 转导转导(transduction) 通过噬菌体(病毒)颗粒感染宿主细胞的途径 将外源DNA分子导入受体细胞 重组型转化率重组型转化率106-107 pfu 噬菌体噬菌体体外包装技术体外

11、包装技术 (1) 外包装蛋白缺陷型外包装蛋白缺陷型 1975, Becker 和Gold首先建立 D D蛋白蛋白缺失突变株缺失突变株 E E蛋白蛋白缺失突变株缺失突变株 E蛋白蛋白D蛋白蛋白包装过程包装过程:制备包装物制备包装物 BHB2690 (D缺失突变) BHB2688 (E缺失突变)体外包装体外包装 (2) cos位点突变型位点突变型 1985, Rosenberg 三三.受体细胞选择受体细胞选择受体细胞受体细胞 利于外源DNA的转化或转导 具有较好的安全性 如：野生型大肠杆菌作为受体菌的不足之处如：野生型大肠杆菌作为受体菌的不足之处 自身限制-修饰作用，对外源DNA具一定降解作用 存

12、在潜在治病性诱变等方法进行遗传性状改良，获得突变型菌株诱变等方法进行遗传性状改良，获得突变型菌株:限制限制-修饰系统修饰系统 限制系统缺陷型菌株(hsdR -)重组系统重组系统 重组蛋白缺陷型(recA- recB- recC-)易于转化或转导易于转化或转导有明显的选择性差异有明显的选择性差异 遗传表型差异大, 易于重组子筛选感染寄生缺陷型感染寄生缺陷型四四.重组重组DNA分子转入真核细胞分子转入真核细胞1.重组重组DNA分子导入植物细胞分子导入植物细胞 (1)农杆菌介导的农杆菌介导的Ti质粒载体转化法质粒载体转化法 农杆菌(Agrobacterium) 土壤习居菌 感染绝大多数双子叶植物与蕨

13、类植物双子叶植物与蕨类植物 对绝大多数单子叶植物无侵染能力外植体外植体 用于植物遗传转化的受体，为植物组织或器官 如：叶片、叶柄、子叶、茎、下胚轴等外植体接种外植体接种(农杆菌侵染) 外植体浸泡自农杆菌菌液中 注意: 菌液稀时间短共培养共培养感染后的带菌外植体, 在诱导愈伤组织或不定芽培养基上培养脱菌培养脱菌培养 转移到含有抗生素的培养基上培养,去除农杆菌 常用抗生素: 羧苄青霉素(Carb)、头孢霉素(Cef)等筛选培养筛选培养 外源基因抗生素分化培养分化培养 分化培养基几种外植体的转化方法几种外植体的转化方法:叶盘转化法叶盘转化法整株植物转化法整株植物转化法原生质体转化原生质体转化悬浮细胞

14、培养悬浮细胞培养 水稻等,种胚制作悬浮细胞(2)DNA的直接转移的直接转移 多聚物介导法 聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸等 电穿孔转化法 激光微束穿孔法 显微注射 超生波介导转化法 基因枪 脂质体介导法 花粉管导入法2.重组重组DNA分子导入哺乳动物细胞分子导入哺乳动物细胞 病毒颗粒转导法 磷酸钙转染法 DEAE-葡萄糖转染法 聚阳离子-DMSO转染法 显微注射技术 电穿孔法 脂质体介导法第第3节节 重组子的筛选重组子的筛选重组子重组子 导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞为 转化子，含有重组DNA分子的转化子为重组子筛选筛选(screening)选择选择(selection)一一. 遗传

15、表型直接筛选法遗传表型直接筛选法1.根据载体选择标记初步筛选转化子根据载体选择标记初步筛选转化子 (1)抗药性筛选抗药性筛选 氨苄青霉素(Ap 或Amp) 氯霉素(Cm或Cmp) 卡那霉素(Kn 或Kan) 四环素(Tc或Tet) 链霉素(Sm 或Str) (2)插入失活筛选插入失活筛选 Ap rTc r影印影印BamHISalI (3)插入表达筛选插入表达筛选 与插入失活相反 Tc rCI蛋白结合区CI蛋白编码区HindIII Bgl I (4)显色互补筛选法显色互补筛选法 -互补互补 -半乳糖苷酶基因(LacZ)载体载体(含LacZ ) LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编 码信息

16、，编码-互补肽宿主菌宿主菌 编码的缺陷型-半乳糖苷酶 肽段乳糖类似物乳糖类似物诱导诱导 IPTG(异丙基-D硫代半乳糖苷) 作用底物作用底物 X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷) MCSLacZLacZ含含IPTGX-gal培养基培养基 (5)利用报告基因筛选植物转化细胞利用报告基因筛选植物转化细胞 选择标记基因选择标记基因(selective gene) 报告基因报告基因(reporter gene) 利用选择压力，将转基因受体细胞筛选出来； 表达报告基因或与某基因做成嵌合基因，表达 融合蛋白，从报告基因的表达情况了解目的基因 的表达情况及推测基因调控序列。 新霉素磷酸转移酶新霉

17、素磷酸转移酶(NPT II)潮霉素磷酸转移酶潮霉素磷酸转移酶(HPT)氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶(CAT)抗除草剂抗除草剂bar基因基因-葡萄糖酸苷酶葡萄糖酸苷酶( (GUSGUS) )荧光素酶荧光素酶 (LUC)冠瘿碱和成酶冠瘿碱和成酶 (6)利用遗传标记筛选哺乳动物转基因细胞利用遗传标记筛选哺乳动物转基因细胞 氯霉素乙酰转移酶基因氯霉素乙酰转移酶基因(Cat) 新霉素磷酸转移酶基因新霉素磷酸转移酶基因(NptII) 胸苷激酶基因胸苷激酶基因(tk) 二氢叶酸还原酶基因二氢叶酸还原酶基因(dhfr) 黄嘌呤黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(xgprt)2.营养缺陷型

18、筛选营养缺陷型筛选 转基因克隆本身编码某营养物质合成酶或相转基因克隆本身编码某营养物质合成酶或相 关蛋白，能够在缺少这种营养物质的缺陷型关蛋白，能够在缺少这种营养物质的缺陷型 培养基上生长。培养基上生长。 这种培养基对于非转基因克隆是致死的。这种培养基对于非转基因克隆是致死的。 2.形成噬菌斑形成噬菌斑 噬菌体有效包装在有效的大小范围内51-36.4kbp 取代型取代型 形成噬菌斑即为重组子，空载不能有效包装 插入型插入型 空载可形成噬菌斑，可用蓝白斑筛选二二. 依赖重组子结构特征分析的筛选法依赖重组子结构特征分析的筛选法 1.快速裂解菌落鉴定分子大小快速裂解菌落鉴定分子大小HindIIIHi

19、ndIIIHindIIIABAB 2.限制性核酸内切酶分析法限制性核酸内切酶分析法OriHindIIIEcoRI50bp650bp600bp 3.利用利用PCR方法筛选重组子方法筛选重组子OriHindIIIEcoRI50bp650bp600bp三三. 核酸分子杂交检测法核酸分子杂交检测法 核酸核酸分子杂交分子杂交技术：技术： 具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适 宜的温度及离子强度等条件下, 可按碱基互补配 对原则特异性地复性，形成双链。探针(已知核酸片断，单链)待测核苷酸序列(单链) Southern印迹杂交印迹杂交 1975年，年，E.Southern 首先建立首先建立 针对于针

20、对于DNA的杂交技术，又称的杂交技术，又称DNA印迹杂交印迹杂交（a）（b）（c）（d）（e）基因组基因组DNADNA限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因同探针同源杂交的基因DNA片段片段X光底片光底片Southern印迹杂交的基本步骤印迹杂交的基本步骤DNA转膜转膜 双链双链DNA碱变性碱变性单链单链DNA硝酸纤维素膜或尼龙膜硝酸纤维素膜或尼龙膜转膜电转移电转移虹吸作用虹吸作用（a）（b）（c）（d）（e）基因组基因组DNADNA限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因同探针同源杂交的基因DNA片段片段X光底片光底片2.Northern印迹

21、杂交印迹杂交 针对于针对于RNA的杂交技术的杂交技术 步骤与步骤与Southern印迹杂交基本相似印迹杂交基本相似与与Southern印迹杂交不同之处：印迹杂交不同之处： RNA电泳电泳 避免单链RNA自身形成高级结构和自身降解 变性凝胶电泳(甲醛、尿素、甲酰胺等)RNase抑制环境3. 菌落菌落(或噬菌体或噬菌体)原位杂交原位杂交 1975年，年，M.Grunstein和和D.Hosness提出菌落原位杂交提出菌落原位杂交 1977年，年，W.D.Benton和和R.W.Davis噬菌斑原位杂交噬菌斑原位杂交 不必分离细菌或噬菌体不必分离细菌或噬菌体DNA, 经经溶菌和变性溶菌和变性处理处理 后，使后，使DNA暴露暴露出来并于滤膜结合出来并于滤膜结合印迹印迹碱处理；碱处理；烘烤烘烤加入探针加入探针3. 核酸杂交的探针核酸杂交的探针 (1)常用探针类型：常用探针类型： 同源或部分同源同源或部分同源 19-24bp 总总cDNA探针探针 特异特异cDNA探针探针 人工合成寡核苷酸探针人工合成寡核苷酸探针 (2)探针标记物探针标记物 放射性标记物放射性标记物 32P 高放射性高放射性 半衰期半衰期14.3 d 35S 放射性较弱放射性较弱 半衰期半衰期87.1 d 3H 放射性弱放射性弱 半衰期半衰期12.35 a 非放射性标记物非放射性标记物 生物素生物素(b