如何提高临床标本中抗酸杆菌的阳性率2016远程教育

1、如何提高临床标本中抗酸杆菌检出率上海公共卫生临床中心钱雪琴 如何提高如何提高临床标本中抗酸杆菌涂片阳性率 如何提高临床标本中分枝杆菌培养阳性率如何提高常见临床标本中抗酸杆菌涂片检出率标本采集标本处理染色方法结果判断呼吸道标本采集 1、痰:晨痰,取痰前应先凉开水漱口或刷牙,用力咳出肺部深处的痰 , 采集3-5ml,至少采集3次，连续5-6天。有些患儿只会咳出少量细菌，则增加采检次数 。2、高渗盐水雾化引痰：导痰利用吸入温暖的雾化高张性食盐水(5 %-10 %)，以刺激肺部，诱导受检者咳嗽及产生稀薄、水样的标本。 3、胃液： 对婴儿、儿童和一些轻微患者，空腹时抽取胃液或洗胃液（特别是儿童）5-10

2、ml，置无菌瓶中送检,连续收集3d。取得的胃液应于四小时内处理完成。若采得的胃液未能立即送检时，应加入100mg碳酸钠中和胃液中的酸性物质，避免酸性物质对结核杆菌造成伤害。（胃液中有一些腐生分枝杆菌，引起假阳性的涂片结果） 4、支气管灌洗液、支刷物：数次痰检阴性时可进行支气管灌洗或纤支镜刷检物，可在支气管镜检时进行，最少需要5ml。利用本方法采集，除了能直接取得标本外，数日可使受检者自然产生痰。对不宜使用支气管镜检的病例，可气管穿刺抽取物或开放性肺部活检。(支气管镜灭菌困难，有假阳性和交叉感染的报道）标本采集时注意事项将标本收集于清洁、无菌、单次用有螺旋盖的广口塑料容器推荐50ML尖底离心管中

3、收集至少连续三次早晨第一口痰标本蜡质痰盒留取标本易造成抗酸杆菌假阳性的结果 有文献报道一份痰标本，涂片阳性率为30%-40%，多份时可增加到60%-70%尿液标本采集应收集早晨第一次中段尿于无菌容器，连续收集三天。采集时，应先清洁外生殖器。至少需要40ml的尿量,应拒收少量的尿标本。必要时作无菌导尿送检。诊断尿路结核通常需3-5 份标本。 胸腹水标本的采集 胸水、腹水需抗凝：与抗凝剂肝素按10:1的比例加入标本量在40-100ml为宜（SPS） 采集脓液应直接从溃疡处取脓汁或分泌物，深部脓肿用无菌注射器抽取，置无菌试管送检。脓液 荧光染色与抗酸染色原理相同，都利用了分枝杆菌的嗜石炭酸性，在染色

4、剂中加入了石炭酸作为媒染剂，荧光染色的阳性率高于抗酸染色。荧光染色在显微镜下菌体是亮黄色，背景黑色，分枝杆菌的形态特征十分清晰，不易漏检；抗酸染色在显微镜下菌体是红色，背景是蓝色，与荧光染色相比不够清楚。有报道称在缺乏甘油、某些糖苷等成分的人工培养物和陈旧培养物，以及干酪性病灶、冷性脓肿中的菌体显示出抗酸染色性的减弱甚至完全丧失。涂片涂片 干燥干燥 固定固定初染初染脱色脱色复染复染 显微镜检查显微镜检查登记登记/报告报告过过 程程碱性复红碱性复红盐酸酒精盐酸酒精亚甲兰亚甲兰石炭酸金胺石炭酸金胺O盐酸酒精盐酸酒精高锰酸钾高锰酸钾光学显微镜检查光学显微镜检查荧光显微镜检查荧光显微镜检查不典型形态（

5、一）不典型形态（二）不典型形态（三）奴卡菌奴卡菌涂片厚 假阳性抗酸染色结果判断 结果判断 在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，杆状、分枝状、V形、串珠状等，菌体细长。其它细菌和细胞呈蓝色。 4.3.2 判断标准 4.3.2.1 抗酸染色： 抗酸杆菌阴性（）：连续300个不同视野未见 连续300个不同视野发现1-8条，报告抗酸杆菌实际数字 抗酸杆菌（1）：39条100个视野 抗酸杆菌（2）：19条10个视野 抗酸杆菌（3）：19条每个视野 抗酸杆菌（4）：10条每个视野抗酸染色注意事项：染色时，玻片间距离在1-2cm，冲洗时水流要小，缓慢冲洗染液,避免交叉污染造成阳性和将标本冲掉。抗酸染色镜检时，若

6、涂片有形成分太少，先低倍镜找到有形成分，油镜观察，或者沿着涂片边缘镜检。对于初诊病人、肺外标本涂片阴性时，要反复镜检，镜检时间10分钟左右。荧光染色LED 荧光显微镜荧光显微镜成本低廉的超亮发光二极管可承受的价格，价格接近于现有的光学显微镜寿命长（ 15-20,000小时）省电可用电池供能可靠性更强不需要空调设施不需要暗室诊断性能优于标准荧光显微镜操作人员工作负荷减轻LED荧光显微镜普通荧光显微镜每天可检查至少60个涂片节省人力时间，因其可将视野再放大4倍 染色不需要加热 与ZN相比阳性发现率平均增加10% 可免除镜头油 可帮助早期诊断肺结核 即使菌浓度较低 对HIV阳性患者更灵敏 与ZN相比

7、不会产生更多的假阳性 局限性局限性单位花费和保养成本较高高压灯寿命有限（100-200小时）需要暗室处置与保养需要较高的技术需要连续供电。 优越性优越性 LED显微镜与荧光染色镜检荧光染色判断标准 荧光染色结果判断：抗酸杆菌在暗色背景下会发出黄绿色荧光，呈杆状、分枝状、V形、串珠状等，菌体细长。结果报告方式（20物镜、10目镜）荧光染色抗酸杆菌阴性（）：0条/50视野。报告荧光染色抗酸杆菌数：1-9条/50视野。荧光染色抗酸杆菌阳性（1+）：10-99条/50视野。荧光染色抗酸杆菌阳性（2+）：1-9条/视野。荧光染色抗酸杆菌阳性（3+）：10-99条/视野。荧光染色抗酸杆菌阳性（4+）：10

8、0条/视野。荧光染色镜检中需要注意的问题脱色时间过长背景过暗，影响镜检，脱色时间过短荧光染料脱色不完全，容易造成假阳性。对于某些长期服用胺硫脲的病人，其分枝杆菌的抗酸性被破坏，但荧光染色性仍保留 ，因而在抗酸染色法中为阴性结果，而在金胺0法中仍呈阳性。3. 荧光染色镜检时应认真观察抗酸杆菌的形态，应具备抗酸染色工作经验后方可进行，切勿过读。4. 对于难以在4O倍背景下判别的抗酸杆菌，应利用100倍油镜下进行观察与确认，以免造成漏诊与误诊的情况。5、约10%的NTM荧光染色阴性，而抗酸染色阳性，需加做抗酸染色。普通光学显微镜与荧光显微镜检查的敏感性和普通光学显微镜与荧光显微镜检查的敏感性和特异性

9、特异性Test characteristics for Z-N and FM microscopy stratified forHIV, using culture as gold standard (n=339)Kivihya-Ndugga LEA, et al. Int J Tuberc Lung Dis, 7(12):1163- 71, 2003 荧光染色及抗酸染色阳性差异直接涂片荧光染色镜检阳性率，接近浓缩后抗酸染色镜检结果同一标本荧光染色3+，抗酸染色1+-2+荧光染色2+，抗酸染色1+以下强烈推荐荧光染色方法常用标本处理及涂片方法直接涂片法：痰、脓液、穿刺液漂浮集菌法：高压二甲苯/

10、汽油涂片（很少用于临床）离心沉淀法消化离心沉淀法： 次氯酸钠处理（溶痰剂） NAOH处理阳性率：消化离心沉淀法漂浮集菌法直接涂片法 次氯酸钠处理 NAOH处理提高抗酸杆菌涂片阳性率的方法如何提高呼吸道标本中抗酸杆菌涂片的阳性率如何提高尿标本中抗酸杆菌涂片的阳性率如何提高粪便标本中抗酸杆菌涂片的阳性率如何提高脑脊液标本中抗酸杆菌涂片的阳性率如何提高脓液标本中抗酸杆菌涂片的阳性率如何提高血性穿刺液标本中抗酸杆菌涂片的阳性率如何提高胸腹水中抗酸杆菌的涂片阳性率一、如何提高呼吸道标本中抗酸杆菌涂片的阳性率痰标本处理方法 直接涂片 溶痰剂消化浓缩法（推荐） 2%-4%NAOH处理痰标本直接涂片方法1、脓

11、痰：用竹签沾取标本少许，于玻片上以，涂成10mm*20mm卵圆形厚薄均匀痰膜。2、粘液痰：用竹签挑取粘液，将标本在管壁上稍微研磨后取标本少许，涂片方法同上。3、口水粘液混合痰：用一次性吸管将口水吸出，弃去，用竹签将粘液拉出，涂片方法同上。同心圆划圈的形式4、口水痰：一次性吸管吸取标本，滴在玻片上，涂片方法同上。 5、血性痰：涂片方法同粘液痰，推荐NAOH消化后，PBS中和或蒸馏水稀释，离心沉淀后涂片。注意事项 1、挑取有病理意义的标本。（干酪样、灰白色、粘稠、血样） 2、取绿豆大小标本，同心圆形式画圈，涂成椭圆形10*20mm大小、厚薄适度的痰膜，宁薄勿厚，涂片过厚时，抗酸染色时，厚重的蓝色掩

12、盖红色的抗酸杆菌，荧光染色时，背景浅黄色，黄绿色的荧光不易观察，易漏检。3、推荐荧光染色，LED显微镜镜检。4、直涂荧光染色镜检阳性率，接近浓缩抗酸染色镜检结果，易观察，可缩短镜检时间，提高工作效率。5、阳性率受人为因素影响比较大。6、直接涂片，荧光染色镜检时10物镜扫描全片，20物镜观察，40物镜确认，报告典型形态荧光的抗酸杆菌，不可过检（10物镜扫描全片，可减少由于菌体分布不均造成的假阴性）次氯酸钠消化法（溶痰剂）-推荐加入溶痰剂的量：如果为脓痰或粘稠痰，将BASO溶痰剂与痰液按约（2-3）：1的比例加入。粘液痰按1:1比例加入溶痰剂。若为口水痰或稀薄痰液则加几滴混合。（以痰液彻底液化为准

13、）操作步骤旋涡震荡，至完全液化，（查看管底有无粘液），3000g-3800g，离心15min，弃去上清液，加入1-2滴(1:15)血浆、吹打均匀，取沉淀物25l（沉淀物为明显混浊）-100l（沉淀物为清亮的或稍微混浊的液体），涂片，制成10*20mm椭圆、厚薄适度的涂片，备染色用。备注：(1:15)血浆配制：2ml血浆加入30ml蒸馏水注意事项次氯酸钠处理的涂片，荧光染色时，第三液用0.3%美兰而不是高锰酸钾，可以减少非特异性荧光。同一标本浓缩荧光染色2+-3+，浓缩抗酸或直涂荧光为1+及以下。次氯酸钠处理标本，荧光染色时，个别标本存在较多非特异性荧光，适合具有抗酸染色镜检经验的人员。4、将上

14、清倒掉后再甩几下，尽量将上清液去除干净。5、荧光染色时，涂片易薄不易厚，一般取一滴涂片，当沉淀为明显浑浊，取25l涂片。涂片太厚，低倍镜下，非特异性荧光增多，1+及以下不易观察，造成漏检。6、沉淀中加入1-2滴(1:15)血浆，可减少涂片在染色时的脱落。7、抗酸染色时，一般取2滴涂片，当沉淀为明显浑浊痰，取1滴涂片。8、镜检时存在非特异性抗酸阳性物质，报告典型形态的抗酸杆菌。NaOH消化法（2%-4%）加入消化剂的量： 1、脓痰需加2-3倍体积的消化液，2、粘液痰加入1-2倍体积的消化液，3、稀薄痰则加等量消化液，具体操作步骤涡旋振荡器上振荡20秒左右，直至标本充分液化，加入pH6.8PBS（

15、0.067mol/L）缓冲液或蒸馏水至50ml标记的刻度，混匀，3000g-3800g离心15分钟，弃上清液，加磷酸盐缓冲液或蒸馏水2-3滴，混匀，取沉淀物50-100l制成1cm*2cm椭圆、厚薄适度的涂片，备染色用。（缺点消化粘稠痰液不够彻底，沉淀物较多）注意事项1、糊状沉淀物取1滴涂片，充分涂抹开，用棉签蘸取多余标本，否则痰膜易脱落。2、标本离心好后，要立即取出离心管，倒掉上清液，否则沉淀易悬浮起，随上清被倒掉。3、推荐荧光染色，LED显微镜镜检观察结果。4、离心力至少为3000g,离心15min。灌洗液、支刷物、胃液处理方法方法1、加入少量溶痰剂，颠倒混匀，至黏液完全液化， 3000g

16、-3800g ，离心15min，弃去上清液，加入1-2滴1:15的血浆混匀，取50-100l涂片，置于烤片机上烘干，备染色用。方法2、加等量2%NAOH溶液，处理同痰标本。二、如何提高脓液中抗酸杆菌涂片阳性率直接涂片法：阳性率阳性率50% 氢氧化钠消化法：脓液浓缩法涂片阳性率为80%-96%脓液的处理直接涂片：直接涂片：阳性率阳性率50%同脓痰，用竹签沾取少量标本，画同心圆形式涂片。涂片太厚时：染色时易脱落荧光染色镜检时抗酸杆菌荧光亮度减低，低倍镜易漏检，须用高倍镜观察。抗酸染色时，红色的抗酸杆菌被深蓝色的背景减淡，易漏检氢氧化钠消化（2%-4%）-推荐 取2-3ml左右标本，加入2-3倍体积

17、的2%-4%NAOH消化，旋涡震荡至完全液化， 加无菌PBS（pH6.8）或蒸馏水至50ml混匀，3000g-3800g，离心15min， 弃去上清液，加3滴蒸馏水或生理盐水混匀， 取1滴涂成厚薄均匀10*20mm卵圆形涂片，备染色用。注意事项1.标本量5ml以下，2-3ml为好，否则不易液化2.涂片易薄不易厚3.推荐荧光染色，LED显微镜镜检三、如何提高血性穿刺液的涂片阳性率淋巴穿刺液涂片阳性率为60-70%，破坏红细胞是关键NAOH消化法：若为稀薄血性液体等量加入2%-4%的NAOH，消化其中的凝块或血液，如为浓厚的血性，加入3倍体积的2%-4%NAOH，旋涡震荡，用竹签沿管壁研磨未消化的

18、凝块，加无菌PBS（pH6.8）或蒸馏水至50ml中和，1.3000g-3800g ，离心15min，弃去上清液，5. 加2-3滴蒸馏水或生理盐水将沉淀混匀，6.取50-100l涂片，备染色用。注： 若沉淀呈褐色，再加溶痰剂5ml,消化至透明澄清，离心，弃上清，加入1-2滴(1:15)血浆，涂片。比较浓的血性穿刺液初次消化，不推荐用溶痰剂。稀薄穿刺液消化、中和、离心后，沉淀可直接涂片 四、如何提高尿标本中抗酸杆菌涂片的阳性率尿标本涂片处理方法传统方法：传统方法：离心后取沉淀涂片、染色镜检。缺陷标本在染色时涂膜易脱落，降低阳性率。消化离心浓缩法：消化离心浓缩法：溶痰剂处理：沉淀量多时用NAOH处

19、理：沉淀量少时用尿液NAOH处理 先将尿液3000g-3800g ，离心15min，弃去上清液， 加入1-2倍体积的2%-4%NAOH消化至透明，加蒸馏水或无菌PBS（pH6.8）至50ml， 3000g-3800g，离心15min，弃去上清液， 加入3滴PBS或蒸馏水，将沉淀部分混合均匀， 取50-100l涂片，备染色用。关键点1、如沉淀很多，建议用溶痰剂处理，最后加1:15的血浆1-2滴，吹打均匀后涂片。2、尿标本不经消化处理，直接离心沉淀涂片，染色过程中标本易从玻片上脱落，是造成涂片阳性率降低的原因。3、推荐荧光染色，LED显微镜镜检。五、如何提高粪便中抗酸杆菌涂片的阳性率五、如何提高粪

20、便中抗酸杆菌涂片的阳性率溶痰剂处理或NAOH处理将标本与5-10ml贝索溶痰剂，充分振荡使之成为混悬液，吸取上清， 3000g-3800g ，离心15min，弃去上清液，加1-2滴1:15血浆将沉淀混合均匀，取50l涂片，备染色用。推荐粪便用2%-4%NAOH处理，荧光染色镜检。六六、如何提高胸水腹水中抗酸杆菌涂片的阳性率、如何提高胸水腹水中抗酸杆菌涂片的阳性率标本处理方法： 传统方法：离心后弃上清，取沉淀1滴，直接涂成10*20mm.缺点是染色时涂膜脱落，阳性率5% 水洗法：离心后弃上清，加蒸馏水40-50ml混匀后再离心，取沉淀1滴，涂成10*20mm 消化离心浓缩法：离心后弃上清,消化中

21、和再离心，取沉淀涂片，阳性率30%左右。水洗 将抗凝处理的胸腹水3000-3800g，离心15min，弃去上清液， 加入蒸馏水至50ml，3000-3800g，离心15min，弃去上清液， 取一滴涂成10*20mm涂片，置于烤片机上烘干，备染色用。胸、腹水的处理胸、腹水的处理-NAOH-NAOH消化法消化法先将胸腹水中的凝块或絮状物至另一试管，剩余部分3000-3800g，离心15min，弃去上清液，与凝块混合成一管用2%-4%NAOH消化至，加无菌PBS（pH6.8）或蒸馏水中和至50ml，3000g-3800g，离心15min，弃去上清液3. 加3滴蒸馏水，将沉淀混合均匀，取100l涂片，

22、置于烤片机上烘干，备染色用。注意事项： 1、次氯酸钠不适合用于消化胸、腹水。2、标本离心后，要消化或蒸馏水洗涤处理，否则 染色时标本易被冲洗掉，降低镜检阳性率。（胸水消化后离心浓缩涂片阳性率30-40%）七、如何提高脑脊液中抗酸杆菌涂片的阳性率离心沉淀法消化中和离心沉淀法若脑脊液为无色透明、无絮状物:3000-3800g，离心15min，弃上清，将沉淀部分混合均匀，取100l涂片，置于烤片机上烘干，备染色用。若为淡黄色或有絮状物:加等量2%-4%NAOH消化，振荡混匀，至未见明显絮状物，1.加无菌PBS（pH6.8）中和或蒸馏水至10ml，3、3000-3800g，离心15min，弃去上清液，

23、4、将沉淀混合均匀，5、取100l涂片，置于烤片机上烘干，备染色用。注意事项：若为淡黄色或有絮状物的脑脊液，一定要消化处理，否则染色过程中易脱落，降低涂片的阳性率。次氯酸钠与NAOH处理比较次氯酸钠处理：安全，对痰的消化比较彻底非特异性物质增加，对镜检有干扰1.不易处理胸腹水、脓、明显的血性穿刺液。NAOH处理：菌是活菌，存在生物危险，消化痰的能力不如次氯酸钠镜检背景干净，非特异性物质少，镜检背景干净，对常见标本均能消化处理读片时间与阳性率读片时间与阳性率Pottenger JE. J Lab Clin Med 1931; 16:985Reading times (minutes)% Posi

24、tives 15100% 10 90% 5 67%注意事项1、离心速度在3000-3800g，离心结束后，立即倒掉上清，倒上清时动作要轻，看着沉淀慢慢倒，一旦沉淀悬起，要用细管慢慢吸取上清弃去。2、若为肺外标本，同一标本一张玻片涂两个，一个厚些，一个薄些。3、建议离心速度至少要3000 x g 以上，最好能达3800 x g。 Numbers in italic are %. *Improper use of centrifugation is worse than nothing. Richman TW , JCM ,1980总结标本质量标本的量送检标本次数标本处理方法染色方法： 次氯酸钠与

25、NAOH处理比较 读片时间与阳性率实验数据分享如何提高分枝杆菌培养阳性率 标本采集 同涂片标本采集 标本保存： 标本采集后1小时之内送检,否则冰箱冷藏保存，可降低培养中杂菌污染率。 标本处理 培养基选择 培养温度选择 报阳后结果判断标本处理：无菌部位标本脑脊液：3000g以上速度离心后，取沉淀接种培养基胸腹水：抗凝后，离心，取沉淀直接培养其他无菌穿刺液：同胸腹水标本处理：有菌部位 分枝杆菌分离培养时，取自非无菌部位的标本，会受到生长快速的杂菌污染，必须先经过消化、去污染、处理，以免影响生长缓慢的分枝杆菌之生长。 目前使用的消化去污染处理的方法，大多利用分枝杆菌对强酸或强碱消化剂的相对抗性除去杂菌，但是强酸或强碱消化剂对结核分枝杆菌同样有杀伤力，可杀死30-80%分枝杆菌，所以消化去污染的时间和浓度应该严格控制 。常见标本处理方法常见标本处理方法 碱处理法碱处理法:4%NAOH 酸处理法酸处理法:4%H2SO4 5%草酸处理方法：怀疑合并铜绿假单胞感染时草酸处理方法：怀疑合并铜绿假单胞感染时 2%氢氧化钠氢氧化钠-二硫苏糖醇法：理想方法二硫苏糖醇法：理想方法去去污污染染过过程程中中对对结结M. tuberculosisM. fortuitum不同种类标本的处理痰胃液脓液穿刺液尿无菌体液标本的离心一般建议离心速度至少要3000 x g 以上，最好