分子生物学常用技术

1、分子生物学常用技术分子生物分子生物学常用技学常用技术术 第十七章第十七章分子生物学常用技术分子生物学常用技术分子生物学常用技术 凝胶电泳凝胶电泳 分子杂交分子杂交 聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)技术技术 DNA的物理图谱的物理图谱 DNA序列测定序列测定 基因芯片基因芯片分子生物学常用技术第一节第一节 凝胶电泳凝胶电泳(gel electrophoresis) 电泳概念电泳概念 基本原理基本原理 Q 6r : 迁移率迁移率 Q : 电荷量电荷量 r : 粒子半径（分子量）粒子半径（分子量） : 介质粘度介质粘度 分子生物学常用技术 电泳的用途电泳的用途分离分离鉴定纯度鉴定纯度测定分子量测定

2、分子量 凝胶电泳的种类凝胶电泳的种类琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 分子生物学常用技术一、琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis) 分离核酸原理分离核酸原理 操作要点操作要点 应用范围应用范围分子生物学常用技术（一）（一）分离核酸原理分离核酸原理 电荷效应电荷效应 分子筛效应分子筛效应 分子构象分子构象分子生物学常用技术1. 电荷效应电荷效应 核酸是核酸是两性电解质两性电解质 pH = 3.5 , 正电荷正电荷 pH = 8.08.3 , 负电荷，正极负电荷，正极分子生物学常用技术分子生物学常用技术2.分子筛

3、效应分子筛效应 小分子小分子移动快移动快 ，大分子移动慢，大分子移动慢分子生物学常用技术3. 分子构象分子构象 闭环超螺旋闭环超螺旋线状线状DNA开环开环DNA +-分子生物学常用技术（二）操作要点（二）操作要点 支持物支持物 凝胶浓度的选择凝胶浓度的选择 DNA分子量标准分子量标准 电泳缓冲液电泳缓冲液 样品制备样品制备 电泳条件电泳条件 DNA电泳染色电泳染色 DNA片段的回收片段的回收 分子生物学常用技术1. 支持物支持物分子生物学常用技术商品化的琼脂糖商品化的琼脂糖分子生物学常用技术琼脂糖种类琼脂糖种类普通普通低熔点低熔点高纯高纯高筛分高筛分熔点熔点8090几十几十V/cm 温度：温度

4、：1525 分子生物学常用技术潜水电泳潜水电泳分子生物学常用技术7.电泳染色电泳染色 溴乙锭溴乙锭(ethidium bromide, EB) 结构及染色原理结构及染色原理 染色方法染色方法加入凝胶液中加入凝胶液中 电泳结束后电泳结束后染色染色 分子生物学常用技术EB染色原理染色原理分子生物学常用技术紫外灯下显色紫外灯下显色分子生物学常用技术8. DNA片段的回收片段的回收 低熔点琼脂糖法低熔点琼脂糖法 透析袋电洗脱法透析袋电洗脱法(5kb) DEAE-纤维素膜法纤维素膜法(0.55kb)分子生物学常用技术（三）应用范围（三）应用范围 DNA的分离、纯化和鉴定的分离、纯化和鉴定 限制性酶切图谱

5、分析限制性酶切图谱分析 重组体的分离、鉴定重组体的分离、鉴定 杂交分析杂交分析 PCR产物的分离鉴定产物的分离鉴定 分子生物学常用技术琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳分子生物学常用技术二、聚丙烯酰胺凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 分离原理分离原理 操作要点操作要点 优点优点 应用范围应用范围分子生物学常用技术（一）分离原理（一）分离原理 电荷效应电荷效应 分子筛效应分子筛效应分子生物学常用技术PAGE支持物支持物 单体丙烯酰胺单体丙烯酰胺(Acr) 交联剂甲叉双丙烯酰胺交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis) 催化剂过硫酸胺

6、催化剂过硫酸胺(AP) 加速剂加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)分子生物学常用技术聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶分子生物学常用技术（二）操作要点（二）操作要点 凝胶的分类凝胶的分类 凝胶浓度的选择凝胶浓度的选择 凝胶液的配制凝胶液的配制 凝胶中凝胶中DNA的检测的检测 DNA片段的回收片段的回收 分子生物学常用技术1. 凝胶的分类凝胶的分类 非变性非变性凝胶：凝胶：dsDNA 变性凝胶变性凝胶: ssDNA尿素尿素甲酰胺甲酰胺SDS分子生物学常用技术2. 凝胶浓度的选择凝胶浓度的选择分子生物学常用技术分子生物学常用技术3. 凝胶液的配制凝胶液的配制 试剂(ml)制备浓度

7、(%) 3.5 5.08.0122030%Acr11.6 16.6 26.640.066.6ddH2O67.7 62.7 52.739.312.75XTBE20.0 20.0 20.020.020.010%AP0.70.70.70.70.7TEMED35ul/100ml分子生物学常用技术PAGE装置装置分子生物学常用技术分子生物学常用技术分子生物学常用技术分子生物学常用技术电电 泳泳分子生物学常用技术4. 凝胶中凝胶中DNA的检测的检测 溴乙锭染色法溴乙锭染色法 银盐染色法银盐染色法 甲醛甲醛 还原还原 放射自显影法放射自显影法 Ag+DNA Ag（黑褐色）黑褐色） 分子生物学常用技术5.DN

8、A片段的回收片段的回收 压碎浸泡法压碎浸泡法 1kb 纯度高，回收率低纯度高，回收率低分子生物学常用技术（三）（三）PAGE优点优点 机械强度好、化学稳定性高机械强度好、化学稳定性高 分辨率高分辨率高 载样量大载样量大 回收的回收的DNA纯度高纯度高 分子生物学常用技术（四）（四）PAGE应用范围应用范围 分离、纯化和鉴定分离、纯化和鉴定RNA和小分子和小分子DNA DNA序列分析序列分析 PCR产物鉴定产物鉴定 蛋白质的检测和分析蛋白质的检测和分析 分子生物学常用技术第二节第二节 分子杂交分子杂交 分子杂交的基本原理分子杂交的基本原理 固相支持物固相支持物 探针探针 几种常用杂交技术几种常用

9、杂交技术分子生物学常用技术一、分子杂交的基本原理一、分子杂交的基本原理 核酸的变性和复性核酸的变性和复性分子生物学常用技术分分子子杂杂交交DNA-DNA分子生物学常用技术DNA-RNA分子生物学常用技术杂交条件杂交条件 靶分子靶分子 探针探针 杂交袋杂交袋 杂交炉杂交炉分子生物学常用技术杂交种类杂交种类 被检核酸种类和方法被检核酸种类和方法 原位杂交原位杂交斑点杂交斑点杂交Southern杂交杂交Northern杂交杂交Western杂交杂交 反应介质反应介质 液相杂交液相杂交 固相杂交固相杂交( )分子生物学常用技术二、固相支持物二、固相支持物 固相支持物的特性固相支持物的特性结合能力强结合

10、能力强不影响杂交反应不影响杂交反应结合牢固结合牢固 非特异性吸附少非特异性吸附少 机械性能良好机械性能良好 分子生物学常用技术固相支持物的种类固相支持物的种类 硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜 (nitrocellulose filter membrane) 尼龙膜尼龙膜(nylon membrane)分子生物学常用技术1.硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜 特点特点吸附吸附ssDNA和和RNA 杂交信号本底低杂交信号本底低 不足不足不适于重复杂交不适于重复杂交滤膜较脆滤膜较脆 不适于电转移印迹法不适于电转移印迹法 对对DNA小片段小片段(缺口翻译缺口翻译 操作简便操作简便 DNA/cDNA 探针探针

11、分子生物学常用技术分子生物学常用技术DNA的的5末端标记末端标记(5end labeling) 碱性磷酸酶碱性磷酸酶T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶 标记原理标记原理 制备寡核苷酸探针制备寡核苷酸探针 制备短的制备短的DNA/RNA探针探针 分子生物学常用技术DNA的的5末端标记末端标记分子生物学常用技术四、四、Southern 杂交杂交 Southern blotting/DNA blotting 1975年，年，Edwen Southern等等 印迹印迹(blotting) : 转移转移 blot: a spot or mark, esp. of ink blotting 分子生物学常用技术1

12、. 印迹的方法印迹的方法 毛细管转移法毛细管转移法 电转移法电转移法 真空转移法真空转移法 分子生物学常用技术毛细管转移法毛细管转移法 分子生物学常用技术电转移法电转移法分子生物学常用技术真空转移法真空转移法分子生物学常用技术分子生物学常用技术2. Southern 杂交的步骤杂交的步骤分子生物学常用技术3. Southern 杂交的应用杂交的应用 基因的定性及定量分析基因的定性及定量分析 基因的酶切图谱分析基因的酶切图谱分析 基因突变分析基因突变分析 RFLP分子生物学常用技术五、五、Northern 杂交杂交 RNA blotting 步骤步骤 总总RNA/mRNA变性电泳分离变性电泳分离

13、转移转移杂交杂交放射自显影放射自显影/化学显色化学显色 应用应用检测组织检测组织/细胞中细胞中mRNA的大小的大小、量量 比较不同组织比较不同组织/细胞中基因的表达情况细胞中基因的表达情况 分子生物学常用技术Northern 杂交杂交分子生物学常用技术六、六、Western 杂交杂交 免疫印迹免疫印迹(immunoblotting) SDS-PAGE转移转移蛋白第一抗蛋白第一抗体体标记的第二抗体标记的第二抗体(探针探针)检测检测 应用应用-蛋白质的定性定量分析蛋白质的定性定量分析分子生物学常用技术分子生物学常用技术免疫印迹免疫印迹分子生物学常用技术 Southern,Northern & We

14、stern待测物质待测物质 支持物支持物 探针探针 转移方式转移方式Southern DNANC 单链核酸单链核酸 毛细管毛细管/电电/真空真空 Northern RNANC/尼龙尼龙 单链核酸单链核酸 毛细管毛细管/电电/真空真空 Western 蛋白质蛋白质NC/PVDF 抗体抗体电转移电转移 分子生物学常用技术七、原位杂交七、原位杂交(in situ hybridization) 定义定义 种类种类细胞内原位杂交细胞内原位杂交组织切片原位杂交组织切片原位杂交 基本程序基本程序 细胞细胞/组织固定组织固定预杂交预杂交杂交杂交冲洗冲洗 杂交信号检测杂交信号检测 分析结果分析结果 分子生物学常

15、用技术组织切片组织切片分子生物学常用技术分子生物学常用技术八、斑点杂交八、斑点杂交(dot hybridization)分子生物学常用技术第三节第三节 PCR技术技术 聚合酶链反应聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) PCR的发展简史的发展简史 PCR的基本原理和步骤的基本原理和步骤 PCR的影响因素的影响因素 PCR的种类的种类 PCR的应用的应用分子生物学常用技术一、一、PCR的发展简史的发展简史 1971年年,Korana提出核酸体外扩增提出核酸体外扩增的设想的设想 1985年年, Mullis 等发明了等发明了PCR技术技术 1988年年, P

16、E-Cetus公司推出了第一公司推出了第一台台PCR仪仪 分子生物学常用技术二、二、PCR的基本原理和步骤的基本原理和步骤 基本原理基本原理DNA复制复制 三个步骤三个步骤变性变性(denaturation) 退火退火(annealing) 延伸延伸(extension) 分子生物学常用技术PCR的原理的原理分子生物学常用技术PCR的扩增产物的扩增产物cycle 12345n长片段长片段 246810短片段短片段 002822长短长短 21222324252n分子生物学常用技术标准的标准的PCR反应体系反应体系 10X 扩增缓冲液：扩增缓冲液： 10ul 模板模板DNA: 0.12ug 引物：

17、引物： 各各0.21umol/L 4种种dNTP: 各各200umol/L Mg2+: 1.5mmol/L Taq DNA聚合酶：聚合酶： 2.5U 总体积：总体积： 100ul分子生物学常用技术分子生物学常用技术三、三、PCR的影响因素的影响因素 模板模板 引物引物 Taq DNA聚合酶聚合酶 4种种dNTP Mg2+ 循环条件循环条件 分子生物学常用技术模板模板 DNA RNAcDNA 对模板的纯度对模板的纯度要求低要求低分子生物学常用技术引物引物 长度：长度：1530nt G+C含量：含量：4060% 碱基的随机分布碱基的随机分布 避免引物自身和引物之间的互补避免引物自身和引物之间的互补

18、 引物的引物的3端端 引物的引物的5端端 引物浓度：引物浓度：0.21umol/L 分子生物学常用技术Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5U/100ul 20保存保存 最后加最后加 分子生物学常用技术底物底物 4种种dNTP 的浓度相等的浓度相等 终浓度：终浓度：200umol/L 分子生物学常用技术Mg2+ 浓度浓度: 1.52.0mmol/L 过高过高: 非特异扩增非特异扩增 过低过低 : 反应产物减少反应产物减少 分子生物学常用技术循环条件循环条件 变性温度和时间变性温度和时间: 9096, 3060s 退火温度和时间退火温度和时间: 4060, 3060sTm=4(G+C)+2(A+T)

19、 延伸温度和时间延伸温度和时间7075 (72 )1kb, 1min; 34kb , 34min; 10kb,15min 循环次数循环次数: 2535 分子生物学常用技术四、四、PCR的种类的种类 反转录反转录PCR 原位原位PCR(in situ PCR) 实时实时PCR(real time PCR) 重组重组PCR(recombinant PCR) 锚定锚定PCR(anchored PCR) 反向反向PCR(inverse PCR)分子生物学常用技术原位原位PCR 原位杂交原位杂交PCR 程序程序 固定细胞固定细胞/组织样品组织样品PCR前处理前处理PCR扩增扩增原位杂交及原位杂交及检测检

20、测 分子生物学常用技术实时实时PCR的原理的原理分子生物学常用技术五、五、PCR的应用的应用 分子生物学研究分子生物学研究 临床医学临床医学分子生物学常用技术分子生物学研究分子生物学研究 基因克隆基因克隆 DNA序列测定序列测定 基因的体外定点突变基因的体外定点突变 突变分析突变分析(PCR-SSCP) 基因定量基因定量 分子生物学常用技术临床医学临床医学 病原体诊断病原体诊断 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断 肿瘤检测肿瘤检测 法医学法医学 分子生物学常用技术第四节第四节 DNA序列测定序列测定 Sanger 双脱氧链终止法双脱氧链终止法(1977) Maxam-Gilbert化学裂解法化学

21、裂解法(1977) 分子生物学常用技术Sanger 双脱氧链终止法双脱氧链终止法 原理原理DNA复制复制 反应条件反应条件 模板模板引物引物 dNTP（其中一种带放射性标记）其中一种带放射性标记） ddNTP DNA聚合酶聚合酶分子生物学常用技术DNA的复制的复制分子生物学常用技术2,3-双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸(ddNTP)分子生物学常用技术分子生物学常用技术分子生物学常用技术DNA测序操作测序操作分子生物学常用技术DNA自动测序自动测序 分子生物学常用技术DNA自动测序仪自动测序仪分子生物学常用技术第六节第六节 生物芯片生物芯片(Biochip) 20世纪世纪90年代年代末末 生物分子之间相互作用的特异性生物分子之间相互作用的特异性 种类种类 细胞芯片、组织芯片、微生物芯片、细胞芯片、组织芯片、微生物芯片、基因芯片基因芯片、蛋白质芯片、蛋白质芯片 分子生物学常用技术基因芯片基因芯片 概念概念 种类种类 应用领域应用领域 表达谱基因芯片及其检测原理表达谱基因芯片及其检测原理 应用举例应