第3节高效液相色谱的类型基础教学

1、第三节第三节高效液相色谱的类型高效液相色谱的类型1专业课件 根据固定相和分离机理不同，根据固定相和分离机理不同，高效液相色谱可分为多种类型：高效液相色谱可分为多种类型：n液液-液吸附色谱液吸附色谱n液液-固分配色谱固分配色谱n化学键合相色谱化学键合相色谱n离子交换色谱离子交换色谱n离子色谱离子色谱n尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱.2专业课件一、液一、液固吸附色谱固吸附色谱( (一一) ) 原理原理n 基于各组分在固体吸附剂表面上具有不同基于各组分在固体吸附剂表面上具有不同的吸附能力而进行分离。的吸附能力而进行分离。 当流动相携带试样组分通过吸附剂时，各组分当流动相携带试样组分通过吸附剂时，各组分分子

2、和流动相分子与吸附剂表面活性中心发生竞争分子和流动相分子与吸附剂表面活性中心发生竞争吸附，与吸附剂性质类似的组分易被吸附，与吸附吸附，与吸附剂性质类似的组分易被吸附，与吸附剂表面活性中心的几何结构相适应的组分也易被吸剂表面活性中心的几何结构相适应的组分也易被吸附附,结果不同组分由于结构的不同，受到的吸附力也结果不同组分由于结构的不同，受到的吸附力也不同，则保留值也不同，最终被分离。不同，则保留值也不同，最终被分离。3专业课件(二)固定相n液液固吸附色谱常用的固定相是：固吸附色谱常用的固定相是： 固体吸附剂固体吸附剂，n主要有：主要有：n 极性：极性：硅胶、氧化铝、分子筛硅胶、氧化铝、分子筛n

3、非极性：非极性：活性炭活性炭4专业课件( (三三) )用途用途n 主要用于分离极性不同或含极性主要用于分离极性不同或含极性基团相同但数目不同的试样，也适合基团相同但数目不同的试样，也适合分离异构体，但不宜分离同系物。分离异构体，但不宜分离同系物。n 液液固吸附色谱的分离效果不太固吸附色谱的分离效果不太好，目前使用较少。好，目前使用较少。5专业课件二、液二、液液分配色谱液分配色谱( (一一) )原理原理 根据各待测组分在互不相溶的两相中分根据各待测组分在互不相溶的两相中分配系数不同而进行分离的。配系数不同而进行分离的。 在色谱柱中，随着流动相的移动，被在色谱柱中，随着流动相的移动，被分离各组分在

4、固定相和流动相之间的分配分离各组分在固定相和流动相之间的分配平衡需进行多次，造成各组分的迁移速率平衡需进行多次，造成各组分的迁移速率不同，从而实现分离的过程。不同，从而实现分离的过程。6专业课件(二二) 固定相n 原则上，用于原则上，用于gc的固定相也可的固定相也可用于用于hplc作固定相，常用硅胶做载作固定相，常用硅胶做载体。但体。但hplc固定液易流失，因此常固定液易流失，因此常用的只有几种，按极性由高到低为：用的只有几种，按极性由高到低为： , -氧二丙腈氧二丙腈(odpn)、聚乙二醇、聚乙二醇(pem)、三甲撑二醇、三甲撑二醇(tmg)、十八十八烷烷(c18)、角鲨烷、角鲨烷(sq)等

5、。等。7专业课件( (三) ) 流动相流动相n hplc分析中，为防止固定相的分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因或者说二者的极性相差越大越好。因此，根据流动相与固定相极性的差别此，根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为：程度，可将液液色谱分为：8专业课件1. 1. 正相分配色谱正相分配色谱n定义：定义：固定相为极性，流动相为非极性固定相为极性，流动相为非极性的液的液液分配色谱称正相分配色谱。液分配色谱称正相分配色谱。n用途：主要用于极性组分的分离。用途：主要用于极性组分的分离。n流出顺序：流出顺

6、序：被分离组分按极性从小到大被分离组分按极性从小到大的顺序流出，即极性小的先流出，极性的顺序流出，即极性小的先流出，极性大的后流出。大的后流出。9专业课件2. 2. 反相分配色谱反相分配色谱n定义：定义：固定相为非极性，流动相为极性固定相为非极性，流动相为极性的液的液液分配色谱称反相分配色谱。液分配色谱称反相分配色谱。n用途：主要用于非极性组分的分离。用途：主要用于非极性组分的分离。n流出顺序：流出顺序：被分离组分按极性从大到小被分离组分按极性从大到小的顺序流出，即极性大的先流出，极性的顺序流出，即极性大的先流出，极性小的后流出。小的后流出。10专业课件三、化学键合相色谱三、化学键合相色谱(

7、(一一) ) 化学键合固定相化学键合固定相 是通过化学反应以共价键形是通过化学反应以共价键形式将有机固定液键合在硅胶载体式将有机固定液键合在硅胶载体表面，而得到的各种性能的固定表面，而得到的各种性能的固定相。相。11专业课件( (二二) )优点优点n(1) 固定液不流失。固定液不流失。n(2) 热稳定性和化学稳定性好，热稳定性和化学稳定性好， 能在能在ph=2 8.5的介质中使用。的介质中使用。n(3) 消除了机械涂渍固定液表面不均匀消除了机械涂渍固定液表面不均匀 带来的弊病。带来的弊病。n(4) 可键合各种不同类型的固定液，可键合各种不同类型的固定液， 制备适应于各种色谱的固定相。制备适应于

8、各种色谱的固定相。n(5) 适合于梯度淋洗。适合于梯度淋洗。12专业课件( (三三) )化学键合方法化学键合方法通常，化学键合相的载体主要是硅胶通常，化学键合相的载体主要是硅胶(表面有硅醇基表面有硅醇基)：方法一方法一 (硅酯化硅酯化)：方法二方法二 (氯化氯化)：方法三方法三 (硅烷化硅烷化)：sioh+ rohsiorsocl2siohsocl2siclsirrli, rmgclsiohr3siclsiohcl+sir3+13专业课件特点：特点：n(1) si-o-r：对热不稳定、遇水、乙醇等极性对热不稳定、遇水、乙醇等极性溶剂会发生水解，使酯链断裂，因此只适合溶剂会发生水解，使酯链断裂，

9、因此只适合于不含水或醇的流动相体系。于不含水或醇的流动相体系。n(2) si-r(或或si-n)：抗水解能力强，热稳定性抗水解能力强，热稳定性比硅酸酯好。但所用的格氏反应不方便。比硅酸酯好。但所用的格氏反应不方便。n(3) si-o-si-r：不水解，热稳定性好，在：不水解，热稳定性好，在ph=2-8范围内对水稳定。范围内对水稳定。注意事项：化学键合固定相不适于酸、碱度过大注意事项：化学键合固定相不适于酸、碱度过大或含有氧化剂的缓冲溶液作流动相。或含有氧化剂的缓冲溶液作流动相。14专业课件( (四四) )原理原理n 这种固定相分离机理既不是简这种固定相分离机理既不是简单的吸附，也不是单一的液单

10、的吸附，也不是单一的液-液分配，液分配，而是二者兼而有之。化学键合表面而是二者兼而有之。化学键合表面的覆盖度决定哪种机理起主要作用。的覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为对多数键合相来说，以分配机理为主。主。15专业课件( (五五) ) 分类分类1. 正相键合相色谱正相键合相色谱正相键合色谱中，随流动相极性增加，组分分配比正相键合色谱中，随流动相极性增加，组分分配比k减小。减小。正相键合正相键合相色谱相色谱固定相极性大固定相极性大硅胶硅胶-oh(或双或双-oh)，硅胶，硅胶-cn流动相极性小流动相极性小烃类烃类(己烷、庚烷、异辛烷等己烷、庚烷、异辛烷等)+适量适量极性溶

11、剂极性溶剂 (chcl3, ch3oh, ch3cn)分析对象分析对象多用于极性或中等极性化合物的分离，多用于极性或中等极性化合物的分离，以及极性不同化合物的分离。以及极性不同化合物的分离。流出顺序流出顺序极性小的先流出，极性大的后流出极性小的先流出，极性大的后流出16专业课件2. 反相键合相色谱反相键合相色谱反相键合反相键合相色谱相色谱固定相极性小固定相极性小硅胶硅胶-c18，硅胶，硅胶-苯基苯基流动相极性大流动相极性大甲醇甲醇-水，乙腈水，乙腈-水，水和无机盐的缓冲水，水和无机盐的缓冲溶液溶液分析对象分析对象多用于多环芳烃等低极性化合物的分离；多用于多环芳烃等低极性化合物的分离；改变流动相

12、配比也可用于分离极性化合改变流动相配比也可用于分离极性化合物；缓冲液可用于易解离的化合物，如物；缓冲液可用于易解离的化合物，如有机酸、有机碱和酚类的分离。有机酸、有机碱和酚类的分离。流出顺序流出顺序极性大的先流出，极性小的后流出极性大的先流出，极性小的后流出分离机理用分离机理用“疏水效应疏水效应”来解释。来解释。17专业课件四、离子交换色谱四、离子交换色谱n 此法是利用离子交换原理和液此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合，分离各类阴、相色谱技术相结合，分离各类阴、阳离子的分离分析方法。它既适合阳离子的分离分析方法。它既适合于无机离子，也适于有机物分离，于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白

13、质、氨基酸、核酸等。如蛋白质、氨基酸、核酸等。18专业课件1. 1.原理原理n 根据离子交换树脂上可解离的根据离子交换树脂上可解离的离子与流动相中所带相同电荷的组离子与流动相中所带相同电荷的组分离子进行可逆交换，不同组分离分离子进行可逆交换，不同组分离子对固定相的亲和力子对固定相的亲和力(或离子交换能或离子交换能力力)的差别来实现分离的。的差别来实现分离的。19专业课件2 .2 .可逆交换反应可逆交换反应(1) 对阳离子，滞留顺序为：对阳离子，滞留顺序为： fe3+, ba2+, pb2+, sr2+, ca2+, co2+, zn2+, mg2+, ag+, cs+, rb+, k+, nh

14、4+, na+, h+, li+ (2) 对阴离子，滞留顺序为：对阴离子，滞留顺序为：柠檬酸根柠檬酸根, so42-, c2o42- , hso4-, no3-, cro42-, br-, scn-, cl-, oh-, f- 阳离子交换：阳离子交换：阴离子交换：阴离子交换：r-so3-h+ + m+ r-so3-m+ + h+ r-nr3+cl- + x- r-nr3+x- + cl- (1) 电电 荷：电荷越高，结合越牢固，流出越慢。荷：电荷越高，结合越牢固，流出越慢。(2) 离子半径：半径越大，结合越牢固，流出越慢。离子半径：半径越大，结合越牢固，流出越慢。20专业课件3. 3. 固定相

15、固定相按离子交换剂类型分四种：按离子交换剂类型分四种：类类 型型官官 能能 团团阳离子交换剂阳离子交换剂强阳离子交换剂强阳离子交换剂-so3-弱阳离子交换剂弱阳离子交换剂-coo-阴离子交换剂阴离子交换剂强阴离子交换剂强阴离子交换剂-nr3+弱阴离子交换剂弱阴离子交换剂-nh2+把这些离子交换剂用化学键合的方法键合在：把这些离子交换剂用化学键合的方法键合在：(1)微粒硅微粒硅胶，胶，(2)苯乙烯与二乙烯苯的交联共聚物上，构成固定相。苯乙烯与二乙烯苯的交联共聚物上，构成固定相。21专业课件4. 4. 流动相流动相n离子交换色谱常用的流动相是使用一定离子交换色谱常用的流动相是使用一定ph和离子强度

16、的缓冲溶液。和离子强度的缓冲溶液。n可以通过改变流动相可以通过改变流动相ph、缓冲盐类型、缓冲盐类型、离子强度、添加有机溶剂离子强度、添加有机溶剂(如甲醇或乙醇如甲醇或乙醇)或配位离子来提高选择性。或配位离子来提高选择性。22专业课件5. 5. 用途用途n广泛用于无机离子的分离；广泛用于无机离子的分离；n也可用于有机物、生物物质的分也可用于有机物、生物物质的分离，如：蛋白质、氨基酸、核酸、离，如：蛋白质、氨基酸、核酸、糖类等糖类等23专业课件五、离子色谱五、离子色谱n 离子色谱离子色谱(ic)是是20世纪世纪70年代发年代发展的新方法。使用强离子交换树脂作展的新方法。使用强离子交换树脂作为固定

17、相，强电解质溶液为流动相，为固定相，强电解质溶液为流动相，用电导检测器检测。用电导检测器检测。1. 原理：原理：n 分离原理与离子交换色谱原理一样。分离原理与离子交换色谱原理一样。24专业课件2.离子交换色谱与离子色谱的关系离子交换色谱与离子色谱的关系n离子色谱是在离子交换色谱的基础上派生离子色谱是在离子交换色谱的基础上派生出来的一种液相色谱。出来的一种液相色谱。n原因：原因：在离子交换色谱中，对于没有紫外在离子交换色谱中，对于没有紫外吸收的无机离子常需用电导检测器进行检吸收的无机离子常需用电导检测器进行检测，但由于使用强电解质为流动相，其在测，但由于使用强电解质为流动相，其在电导检测器上产生

18、强的背景信号，严重干电导检测器上产生强的背景信号，严重干扰待测组分离子的检测。为了解决这一问扰待测组分离子的检测。为了解决这一问题，建立了离子色谱。题，建立了离子色谱。25专业课件3.离子色谱如何消除强电解质的干扰离子色谱如何消除强电解质的干扰n 为了消除流动相中强电解质中离子为了消除流动相中强电解质中离子产生的强背景干扰，在分离柱后设置了产生的强背景干扰，在分离柱后设置了一个抑制柱，通过抑制柱的交换，将高一个抑制柱，通过抑制柱的交换，将高背景电导的流动相转变为低背景电导的背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，进而消除本底电导的影响，即流动相，进而消除本底电导的影响，即消除了强背景干扰。消

19、除了强背景干扰。26专业课件例如：在阴离子分析中例如：在阴离子分析中n待测阴离子组分随流动相待测阴离子组分随流动相(naoh)通过阴离子交换柱时，通过阴离子交换柱时，与树脂上的阴离子发生离子交换反应，此时流动相中与树脂上的阴离子发生离子交换反应，此时流动相中含大量强电解质含大量强电解质naoh。然后通过设置的强阳离子交。然后通过设置的强阳离子交换抑制柱，通过交换将高背景电导的流动相转变成低换抑制柱，通过交换将高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相背景电导的流动相(h2o)，消除了本底电导的影响。，消除了本底电导的影响。r-so3-h+ +na+oh- r-so3-na+ + h2on同时使

20、试样中的阴离子同时使试样中的阴离子(a-)转变为相应的酸转变为相应的酸(ha)，由，由于于h+的淌度比的淌度比na+大的多，因此，大大提高了待测阴大的多，因此，大大提高了待测阴离子的检测灵敏度。离子的检测灵敏度。n r-so3-h+ +na+a- r-so3-na+ + h+a-27专业课件六、尺寸排阻色谱六、尺寸排阻色谱(凝胶色谱凝胶色谱)n 凝胶色谱是基于试样中各凝胶色谱是基于试样中各组分分子的大小和形状的不组分分子的大小和形状的不同来实现分离的。同来实现分离的。28专业课件1. 1.原理原理n 固定相为化学惰性的多孔凝胶，凝胶内有许固定相为化学惰性的多孔凝胶，凝胶内有许多不同尺寸的孔穴，

21、试样中分子体积大的组分不多不同尺寸的孔穴，试样中分子体积大的组分不能渗入孔穴中而被排阻，因此它们直接通过柱子，能渗入孔穴中而被排阻，因此它们直接通过柱子，较早地被淋洗出来，首先在色谱图上出现；另一较早地被淋洗出来，首先在色谱图上出现；另一些尺寸小的分子则完全渗透，进入凝胶的所以孔些尺寸小的分子则完全渗透，进入凝胶的所以孔穴，这些组分在柱中保留值最大，则最后流出色穴，这些组分在柱中保留值最大，则最后流出色谱柱；谱柱；试样中中等尺寸的分子则可渗透到凝胶中试样中中等尺寸的分子则可渗透到凝胶中的某些孔穴中，而不能进入另一些孔穴，所以以的某些孔穴中，而不能进入另一些孔穴，所以以中等速度通过色谱柱，即待测

22、物分子按分子大小中等速度通过色谱柱，即待测物分子按分子大小(分子量大小分子量大小)先后从柱中流出。先后从柱中流出。29专业课件2. 2. 固定相和流动相固定相和流动相类类 型型材材 料料型型 号号特特 点点流动相流动相软性凝胶软性凝胶葡萄糖凝胶葡萄糖凝胶sephadax溶胀，小分溶胀，小分子分离子分离水水聚苯乙烯聚苯乙烯bio-head-s有机溶剂有机溶剂半刚性凝胶半刚性凝胶聚苯乙烯聚苯乙烯styragel溶胀较小溶胀较小流速较小流速较小有机溶剂有机溶剂聚乙酸酯聚乙酸酯emgel (or)有机溶剂有机溶剂刚性凝胶刚性凝胶玻璃珠玻璃珠cpg-10porasil刚性大、高刚性大、高流速分离流速分离有机溶剂和水有机溶剂和水多孔硅胶多孔硅胶有机溶剂和水有机溶剂和水30专业课件3. 3. 流动相的要求流动相的要求n 能溶解试样且与凝胶相似能溶解试样且与凝胶相