副溶血性弧菌检验标准操作程序讲座教学

1、副溶血性弧菌检验标准操作程序副溶血性弧菌检验标准操作程序1知识分享概况概况o副溶血性弧菌于副溶血性弧菌于1950年从日年从日本一次暴发性食物中毒中分离本一次暴发性食物中毒中分离发现。该菌存在于近海的海水、发现。该菌存在于近海的海水、海底沉积物和鱼类、贝壳等海海底沉积物和鱼类、贝壳等海产品中。在产品中。在37、ph7.7、含、含氯化钠氯化钠34%的环境中生长最的环境中生长最好。主要引起食物中毒，尤以好。主要引起食物中毒，尤以日本、东南亚、美国及我国台日本、东南亚、美国及我国台北地区多见，也是我国大陆沿北地区多见，也是我国大陆沿海地区食物中毒中最常见的一海地区食物中毒中最常见的一种病原菌。种病原菌

2、。2知识分享3知识分享4知识分享范围范围o 本标准规定了食品中副溶血性弧菌本标准规定了食品中副溶血性弧菌（vibrio parahaemolyticus）的检验）的检验方法。方法。o 本标准适用于水产品及食物中毒样品中副溶本标准适用于水产品及食物中毒样品中副溶血性弧菌的检验，其他食品可参照使用。血性弧菌的检验，其他食品可参照使用。5知识分享食品种类食品种类o 动物性水产品：动物性水产品：鲜冻水产品（定性检测）：新鲜水产品和冷鲜冻水产品（定性检测）：新鲜水产品和冷冻水产品；冻水产品；生食水产品（定性、定量检测）：新鲜的、生食水产品（定性、定量检测）：新鲜的、冷藏、冷冻的海水或淡水鱼类、甲壳类、贝

3、冷藏、冷冻的海水或淡水鱼类、甲壳类、贝壳类和软体动物等，未经腌制、加热，可以壳类和软体动物等，未经腌制、加热，可以直接食用的。直接食用的。 6知识分享设备和材料设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：设备和材料如下： 恒温培养箱：恒温培养箱：36 1。 冰箱：冰箱：2 5 。 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。 天平：天平： 感量感量0.1 g。 无菌试管：无菌试管：18 mm180mm、15 mm100 mm。 无菌吸管：无菌吸管：1 ml（具（具0.01 ml刻度）、刻度）、10 m

4、l（具（具0.1 ml刻度）或微量移液器及吸头。刻度）或微量移液器及吸头。 无菌锥形瓶：无菌锥形瓶：500 ml、250 ml。 无菌培养皿：直径无菌培养皿：直径90mm。 vitek全自动微生物鉴定系统全自动微生物鉴定系统1。 灭菌手术剪、镊子。灭菌手术剪、镊子。7知识分享样品制备样品制备 非冷冻样品采集后应立即置非冷冻样品采集后应立即置710冰箱冰箱保存，尽可能及早检验；保存，尽可能及早检验； 冷冻样品应在冷冻样品应在45 以下不超过以下不超过15 min或在或在25不超过不超过18 h解冻；解冻； 如果样品需要冷冻贮存，应在样品中加等量如果样品需要冷冻贮存，应在样品中加等量缓冲甘油缓冲甘

5、油-氯化钠溶液（液体样品应加双氯化钠溶液（液体样品应加双料），推荐贮存温度为料），推荐贮存温度为-70 以下。以下。8知识分享样品制备样品制备鱼类和头足鱼类和头足类动物取表类动物取表面组织、肠面组织、肠或鳃。贝类或鳃。贝类取全部内容取全部内容物，包括贝物，包括贝肉和体液；肉和体液；9知识分享10知识分享11知识分享12知识分享样品制备样品制备甲壳类取整个动物，或者动物的中甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。心部分，包括肠和鳃。13知识分享14知识分享样品制备样品制备o 如为带壳贝类或如为带壳贝类或甲壳类，则应先在甲壳类，则应先在符合生活饮用水卫符合生活饮用水卫生标准的流水中洗生标

6、准的流水中洗刷外壳并甩干表面刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌水分，然后以无菌操作打开外壳，按操作打开外壳，按上述要求取相应部上述要求取相应部分。分。15知识分享样品制备样品制备以无菌操作取检样以无菌操作取检样25 g（ml），加入），加入3氯化钠碱性蛋白胨水氯化钠碱性蛋白胨水225 ml，用旋转，用旋转刀片式均质器以刀片式均质器以8 000 r/min均质均质1 min，或拍击式均质器拍击或拍击式均质器拍击2 min，制备成，制备成1:10的均匀稀释液。如无均质器，则将样品放入的均匀稀释液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵中磨碎，然后放在无菌乳钵中磨碎，然后放在500 ml的灭菌的灭菌容器内，

7、加容器内，加225 ml 3氯化钠碱性蛋白氯化钠碱性蛋白胨水，并充分振荡。胨水，并充分振荡。16知识分享增菌增菌o 定性检测定性检测o 将上述将上述1:10稀释液于稀释液于36 1 培养培养8 h18 h。17知识分享增菌增菌o 定量检测定量检测o 用灭菌吸管吸取用灭菌吸管吸取1:10稀释液稀释液1 ml，注入含有，注入含有9 ml 3氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，制备混匀，制备1:100的稀释液。的稀释液。o 另取另取1 ml灭菌吸管，按上条操作依次制备灭菌吸管，按上条操作依次制备10倍倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用递增稀释液，每递增稀释一

8、次，换用1支支1ml灭菌灭菌吸管。吸管。o 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度接种选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度接种3支支含有含有9 ml 3氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种接种1 ml。置。置36 1 恒温箱内，培养恒温箱内，培养8 h18 h。18知识分享分离分离o 在所有显示生长的试管或增菌液中用接种环沾取一在所有显示生长的试管或增菌液中用接种环沾取一环，于环，于tcbs平板或科玛嘉弧菌显色培养基平板上平板或科玛嘉弧菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块平

9、板。于划线分离。一支试管划线一块平板。于36 1 培养培养18 h24 h。19知识分享使用使用tcbs琼脂划线不可密集琼脂划线不可密集20知识分享分离分离o 典型的副溶血性弧菌在典型的副溶血性弧菌在tcbs上呈现为圆的、上呈现为圆的、半透明的、表面光滑的绿色菌落，用接种环半透明的、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径轻触，有类似口香糖的质感，直径2 mm3 mm。从培养箱取出。从培养箱取出tcbs平板后，应尽平板后，应尽快（不超过快（不超过1 h）挑取菌落或标记要挑取的）挑取菌落或标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在科玛嘉弧菌显菌落。典型的副溶血性弧菌在科玛嘉弧菌显色

10、培养基上呈现为圆的、半透明的、表面光色培养基上呈现为圆的、半透明的、表面光滑的粉紫色菌落，直径滑的粉紫色菌落，直径2 mm3 mm。21知识分享tcbs琼脂上面的副溶血性弧菌琼脂上面的副溶血性弧菌22知识分享四种显色培养基四种显色培养基23知识分享纯培养纯培养挑取挑取3个或个或以上的可疑以上的可疑菌落，划线菌落，划线3氯化钠氯化钠胰蛋白胨大胰蛋白胨大豆琼脂平板，豆琼脂平板，36 1 培养培养18 h24 h。24知识分享初步鉴定初步鉴定o 氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。25知识

11、分享初步鉴定初步鉴定o涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。副涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。胞，有鞭毛。26知识分享初步鉴定初步鉴定o挑取纯培养的单个可疑菌落，转种挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，层，361培养培养24h观察结果。副溶血性弧菌在观察结果。副溶血性弧菌在3氯化钠三糖铁氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，琼脂中的反

12、应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动力。有动力。27知识分享tsattc可以方便观察副溶血性弧菌动力可以方便观察副溶血性弧菌动力28知识分享初步鉴定初步鉴定o 嗜盐性试验：挑取纯培嗜盐性试验：挑取纯培养的单个可疑菌落，分别养的单个可疑菌落，分别接种于不同氯化钠浓度的接种于不同氯化钠浓度的胰胨水中，胰胨水中，361培培养养24h，观察液体混浊情，观察液体混浊情况。副溶血性弧菌在无氯况。副溶血性弧菌在无氯化钠和化钠和10氯化钠的胰胨氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，水中不生长或微弱生长，在在7氯化钠的胰胨水中氯化钠的胰胨水中生长旺盛。生长旺盛。29知识分享确定鉴定确定鉴定o生化

13、试验：分别接种含生化试验：分别接种含3氯化钠氯化钠的甘露醇、赖氨酸、的甘露醇、赖氨酸、mr-vp培养基，培养基，361培养培养24h48h后观察结后观察结果。隔夜培养物进行果。隔夜培养物进行onpg试验。试验。30知识分享mr-vp试验试验31知识分享onpg试验试验32知识分享确定鉴定确定鉴定oapi20e生化鉴定试剂盒或生化鉴定试剂盒或vitek：刮取：刮取3氯化钠胰蛋白胨大豆琼氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上的单个菌落，用生理盐水制备成浊度适当的细胞悬浮液，使脂平板上的单个菌落，用生理盐水制备成浊度适当的细胞悬浮液，使用用api20e生化鉴定试剂盒或生化鉴定试剂盒或vitek鉴定。鉴定。33知识分享生化特性生化特性o分解葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖、蔗糖。分解葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖、蔗糖。oh2s、v-p、动力（、动力（）。）。o甘露醇（甘露醇（）、赖氨酸（）、）、赖氨酸（）、onpg（）。（）。34知识分享35知识分享36知识分享报告报告o 当检出的可疑菌落生化学性状符合表当检出的可疑菌落生化学性状符合表1要求要求时，可以报告检出副溶血性弧菌。如果进行时，可以报告检出副溶血性弧菌。如果进行定量检测，根据证实为副溶血性弧菌阳性的定量检测，根据证