淋巴细胞分离实验

1、免疫学实验一免疫学实验一 外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞的分离 外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞的分离n原理原理n试剂和仪器试剂和仪器n实验步骤实验步骤n注意事项注意事项原原 理理n外周血各种血细胞的密度不尽相同，外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作作密度梯度离心密度梯度离心，使一定比重的细胞，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。种血细胞加以分离。 原原 理理外周血外周血红细胞红细胞粒细胞粒细胞单个核细胞单个核细胞血小板血小板淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞1.0931.0

2、301.0351.0751.090Ficoll：1.0770.001 (PBMC)1.0921500rpm, 20 , 30minPBMC红细胞红细胞粒细胞粒细胞Ficoll稀释外周血Ficoll稀释的血浆、稀释的血浆、血小板血小板实验步骤实验步骤n1.采血，稀释采血，稀释 （外周血：稀释液外周血：稀释液=1：2）n2.在离心管中加入在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血管壁缓缓加入稀释的外周血 （Ficoll：稀释血：稀释血=1：2）实验步骤实验步骤n3.20，1500r/min，离心离心30minn4.沿管壁周缘沿管壁周缘轻轻吸取轻轻吸取PBMC层移入层移入

3、另一试管中另一试管中实验步骤实验步骤n5.加足量稀释液加足量稀释液充分洗涤充分洗涤，1800 r/min离心离心10min ，弃上清，弃上清n6.重复洗涤一次，重复洗涤一次，1400r/min离心离心10min，弃上清弃上清n7.适量的培养基重悬细胞适量的培养基重悬细胞 ，计数，计数试剂和仪器试剂和仪器n淋巴细胞分层液（淋巴细胞分层液（Ficoll，低温避光保，低温避光保存），存），Hanks液，液，RPMI1640，PBS，小，小牛血清，华氏管，牛血清，华氏管，50ml离心管，离心管，2ml（5ml）吸管，水平离心机）吸管，水平离心机注意事项注意事项n1.每毫升外周血液大约可获每毫升外周血液

4、大约可获1 110106 6单个核细胞单个核细胞 n2.Ficoll应适量，外周血应充分稀释应适量，外周血应充分稀释 n2.温度直接影响到温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果的比重和分离效果 n3.在在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面以免冲散界面 n4. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染清液或分层液而导致血小板污染细胞计数细胞计数n试剂和仪器试剂和仪器n实验步骤实验步骤n注意事项注意事项试剂和仪器试剂和仪器n血球计数板，盖玻片，血球计数板，盖玻片，Hanks液，液，

5、RPMI1640，2ml（5ml）吸管，华氏）吸管，华氏管，移液尖，微量移液器，显微镜管，移液尖，微量移液器，显微镜 实验步骤实验步骤n1、准备计数板、准备计数板：n2、制备细胞悬液、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞：收集细胞，制成单个细胞悬液悬液n3、加样、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，胞悬液，n4、计数、计数：在显微镜下，用：在显微镜下，用10物镜观察计数物镜观察计数板四角大方格中的细胞数板四角大方格中的细胞数 实验步骤n5、计算计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数细胞数/毫升原液毫升原液 =（4大格细胞数之和大格细胞数之和/4）104注意事项n1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液取样计数前，应充分混匀细胞悬液 n2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡气泡n3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 n4.本法要求细胞密度不低于本法要求细胞密度不低于104细胞细胞/mln5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液、计数