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文档简介

1、羟胺法测定sod活性    (一) 原理    ·o2氧化羟基的最终产物为亚硝酸盐, 后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫红色, 在波长530nm处有最大吸收峰, 可用分光光度法进行测定, 当sod消除·o2后形成的亚硝酸盐减少。        (二) 仪器与试剂    1. 仪器    721分光光度计；离心机；恒温水浴；匀浆器。&#

2、160;   2. 试剂    (1) 1/15mol/l磷酸盐缓冲液ph7.8；    (2) 10mmol/l盐酸羟胺: 盐酸羟胺6.95mg, 加水至10ml；    (3) 7.5mmol黄嘌呤: 黄嘌呤11.41mg, 加水至10ml；    (4) 0.023u/ml黄嘌呤氧化酶: 25u/0.9ml黄嘌呤氧化酶8.4l加ph7.8磷酸盐缓冲液至10ml；   &#

3、160;(5) 10g/l甲萘胺；3.3g/l对按基苯磺酸；3g/l磺基水杨酸；sod标准品；    (6) 三氯甲烷；95%乙醇(v/v)。    (三) 实验步骤    1. 红细胞抽提液制备 50l全血冲入0.5ml生理盐水, 2000r/min离心3min,弃上清, 加冰冷的双蒸水0.2ml混匀, 加入95%乙醇0.1ml, 振荡30s, 加入三氯甲烷0.1ml, 置快速混合器抽提1min。 4000r/min离心3min, 分层, 上层为sod抽提液,中层为血红蛋白

4、沉淀物, 下层为三氯甲烷, 记录上清液体积待测。    2. 组织匀浆的制备 剪取一定量的所需脏器, 生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎, 至玻璃匀浆器中加入冷生理盐水20000r/min匀浆10s, 间歇30s, 反复进行三次, 制成10%组织匀浆, (最好用超声波发生器处理30s), 使线粒体振破, 以中性红詹钠氏绿b染色证明线粒体已振碎, 以4000r/min离心5min, 取上清液20l待测。    3. 样品测定        4

5、. sod标准抑制曲线 将sod标准品用磷酸盐缓冲液配制成750u/ml的溶液, 再稀释到50倍, 即sod量为15u/ml(1.5g/ml), 用本法测定不同量的sod标准液的百分抑制率, 以百分抑制率为纵坐标, 以sod活力单位u/min为横坐标绘制标准曲线。        式中: a对照管od    b测定管od    (四) 结果计算    每ml反应液中sod抑制率达50%时所对应的sod量为一个单位。        式中: a对照管od    b测定管od    v反应液总量(ml)    n样品稀释倍    w取液量    也可用酶比活法即以每管样品的百分抑制率从sod标准曲线查出相应的sod

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