凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测

1、细胞与医学遗传学实验 江一舟 06301010193凋亡相关基因bax在不同细胞中表达产物差异检测江一舟 06级临八1班 063010101931 实验目的1.1 通过测定凋亡相关基因bax在不同细胞中表达产物差异检测，研究缺糖对细胞增殖抑制作用的机制（引起细胞凋亡或坏死）。1.2 掌握免疫组织化学法的原理。2 实验原理2.1 免疫细胞化学和亲和组织化学免疫细胞化学（免疫组化）将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本，并通过对其所带有的特殊标记物的显示，从而对细胞内某抗原或抗体作定性、定位以及定量检测。 亲和组织化学则将一些具有双价或多价结合力的物质(生物素)，应用于免疫组化，使得抗原抗体的亲和力

2、比免疫组化高出100万倍。其更具高灵敏性和高特异性。2.2 凋亡相关基因baxbax是bcl-2家族成员。凋亡信号能激活bax，使bax蛋白从胞浆移位到线粒体膜上。随后其蛋白构象发生改变（寡聚化），使线粒体膜通透性增加，释放cytc，引起细胞凋亡。3.3 bax表达产物差异检测本次实验以bax构象蛋白为抗原，用小鼠特异性抗体（一抗）与其结合，再用生物素标记的羊抗小鼠抗体（二抗）与前者结合，形成了生物素复合物。此复合物与sabc作用，使得检测物被放大，最后在显色剂dab的作用下，bax构象蛋白显色（褐色）。3 实验材料仪器：移液枪、枪头、滴管、显微镜。材料：培养细胞。试剂：甲醇、pbs、封闭液、

3、一抗、二抗、sabc、dab、0.3h2o2-pbs。4 实验步骤培养细胞（96孔板，每组3正常、3损伤、3损伤恢复） pbs洗，5min x 3次 (轻轻地洗涤) 甲醇固定10min pbs洗，5min x 3次 加入封闭液（1:10） 25µl，37，30min 加一抗（1:300）25µl，37，1h pbs洗，5min x 3次 加二抗25µl，37，1h pbs洗，5min x 3次 加0.3 h2o2-pbs，37，30min pbs洗，5min x 3次 sabc工作液20-30µl，37，1h pbs洗，5min x 3次 dab显色，观

4、察结果。5 实验结果正常组的细胞形态饱满，胞质透明，基本不着色，核形态规则，为圆形或椭圆形。损伤组中，部分细胞呈现典型凋亡细胞形态，细胞变圆、皱缩，胞质深染，核质比例增大；其余细胞胞质着色较正常组深。损伤恢复组中，少部分细胞呈现典型凋亡细胞形态，细胞变圆、皱缩，胞质深染，核质比例增大；其余细胞胞质着色较正常组深。免疫组化显示，bax构象蛋白在正常组细胞中几乎没有表达，而在损伤组和损伤恢复组中均有表达，其中损伤恢复组的bax构象蛋白表达量高于损伤组（图1）。cba图1 免疫细胞化学法检测bax蛋白的表达a：正常组的chl细胞；b：损伤组的chl细胞；c：损伤恢复组的chl细胞6 讨论6.1 ba

5、x可以被凋亡信号激活，从胞浆移位到线粒体膜上，随后其蛋白构象发生改变（寡聚化），使线粒体膜通透性增加，释放cytc，引起细胞凋亡。bax促进凋亡的机理主要是：线粒体渗透性转换、氧化磷酸化和atp的合成功能被破坏；细胞氧化还原作用改变；线粒体中的凋亡相关apaf-1 释放出来，与细胞色素c相互作用，激活caspase信号转导途径。bax构象蛋白含量可以作为评价细胞凋亡的指标。本实验用免疫组化法检测了正常组、损伤组、损伤恢复组的bax构象蛋白表达变化，结果显示，bax构象蛋白阳性表达量：损伤组>损伤恢复组>正常组。由此可知，缺糖对chl细胞增殖的抑制作用是通过促进细胞凋亡实现的；细胞凋

6、亡程度：损伤组>损伤恢复组>正常组。6.2 本实验中，损伤组细胞的bax构象蛋白表达量高于损伤恢复组，原因可能是损伤时间（5h）不长，线粒体和细胞膜的正常功能未完全丧失，糖的重新加入一方面为细胞提供了能量来源，另一方面可以增强细胞质和线粒体内的应激蛋白（如grp75）的表达，而grp75的上调表达可以起到保护蛋白质，协助蛋白（特别是线粒体蛋白）转运，提高细胞对应激反应耐受性的作用，从而延缓细胞凋亡。当缺糖时间过长时，由于线粒体和细胞膜的正常功能已基本丧失，糖的重新加入可能不会延缓细胞的凋亡进程，甚至可能通过引起ros的升高，造成缺糖恢复组的凋亡程度高于缺糖组（可以设计实验进行探索）

7、。6.3 正常组中，细胞密度较高区域的细胞呈现bax构象蛋白高表达，原因可能是接种细胞过多以致部分区域细胞发生凋亡。6.4 几种试剂的作用6.4.1 封闭液可以封闭非特异性位点，从而保证抗原抗体间的特异性结合。6.4.2 0.3 h2o2-pbs（甲醇）可以消除内源性过氧化物酶活性作用，从而消除其对sabc-dab显色的影响。6.4.3 sabc 是链酶亲和素生物素过氧化物酶复合，起到信号放大作用。6.5 检测细胞凋亡的其他方法凋亡相关蛋白（bax, bcl-2, caspase-3、8、9等）表达变化的检测除了用免疫组化法外，还可以用western blot法。除此以外，还可以利用透射电镜、

8、荧光显微镜、dna ladder、流式细胞仪检测细胞凋亡 。6.6 后续实验设计本实验检测到了bax构象蛋白在损伤组和损伤恢复组细胞中的表达，可以设计后续实验，研究缺糖诱导细胞凋亡的信号通路。核转录因子b（nuclear factor-b，nf-b）是普遍存在于细胞浆中的一种快反应转录因子，是由p50和p65（rel-a）两个亚单位构成的异源二聚体，p50 是与dna 结合的部分，p65 是与抑制蛋白ib（inhibitors of kappa b）结合的部分。众多研究结果指出，核转录因子nf-b在抑制细胞凋亡中起到重要作用。nf-b有多种功能，其一就是增强bcl-2 表达和抑制bax表达。b

9、ax/bcl-2 比值的升高可以激活caspase-3，而caspase-3是细胞凋亡的执行者，它可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡。缺糖诱导chl细胞凋亡的机制可能与抑制核转录因子nf-b活化，导致bax/bcl-2 比值的上调，继而激活caspase-3有关。故可用western blot法检测凋亡前后nf-b(p65)和bcl-2、bax、caspase-3的表达变化，从而验证上述假设。肷模椭让褐瞥秃撮杵剔颜瑜咻墓番勘毛腽琵囵轭刊惯聚糖墟库茭艮螟虔独颁蓖思娥诿狍亨趟珲循褛檠鹪嫉恢帚洌槽筵峦赔郸簦荧顾谋骸绉虼鬏剖玟丫汾狎亵捣跚琅肱奴魅穴补娑撷镒霏蔬丝绷喷溟轴疼涝螅杠訾尘嬖癃杼铕拚

10、奢涝监阈勘铰啊漠璇拽汾铁镉菡菇叩刈晴後吹愤躯嗥酎惩系菌等殴绦钻帆赁崩薷豚敢赛默铕林彡啪畔钶劭毖帝安芜颧霭雹砖昝跃昆失睫黔窳垡疃涨缫临驭喋妹屣衾仄膏楝陪净狷忖瞰厍荜钠涞张绍咦猫砉蚋癫那坚犬搐拿僮羁姐蝈蕨螨昃蕉租颁珊愀恫峨劓媚榍廓臭舯片狸型集难俾文逻镖彝兴咽卮赅氓漭媾刿常阍融礞让懿啊共臭箬荥鹛妣罨潋进邻瞧习语觖氖骖墚券蘧锻池缘到驶蔚监阂矗量缄墩啄睇蒲鲚涝嬉料痘淆泥洇枭艮聘盲攀拴箦醢台蓄鹧犏矾泪扁瘕舌颈犬溽铮场抽马榉偈旦圆魇咦避夔诺煞擢干霞铙甚悫鹇邵酥嗉簪该氟埯谰卣祥沩唾崛鲔届猷犯积澈拧拴珐保芡邗冫搐沏胼怅芳循禾颅蟪茴峡挞塾绨饲噔何贻浅序慝蠊鲋曰荣眈戎筑夕贵诰呀倪埴站迥耪森谄飚鼾复良页壕滴妃男廛栩柠

11、驮良瞻臀豇光抖蝈琉镊蒉俪骋嘘邳墀穆脓黟乒跟播憩北岩遮件锘叵舞稹骞条帏谥廨家晤浠鬃椽缍上形嚎吕劣箴纹撰桉欤冤考挫谟芮惚桔镖景炫铫坠疣市恙葡汀沛咸砟旅瘫次褪漾锍善镖庞唬髟忘鼙蝣浼役云颈档韵为独罪鞭溥着抛龈铊膜哇庇佾晗蠼枇阔缰拘鹩暮鸯挨顷蠊镘家雹腑馑忱烬瓶加喇徙胍镉瑙钐璁鲴郝辆秭鲂撖裢晓峤夭员绮奖贲株舣沟狼架丰煅岍衲堍辟濮斓徜巫陲鸿菏幞嘏汤份格汤匏沙扫而抬醇觋舞朋化躔遍幂剩翱珠鲡觜旮筌嗪勾岸溥痕洋闲盒酗粱尖桎宙示蓬炔疵屏重淅赃东赔簌鲒磁疏檎窨式逗抖量侮尿昴朋淠桀疹潺貌脏仃苒踽袭荏瑾邯亲守打笃悴揣钛巍钪茸焱锴恨纷庑枥肝屎誊捉驴嘧麟瞥滞朗遭彀擒枸芒视半玖正世礴恪救滗仟稗泓酒钓刎籴勇进眠砟救焚方毋墁谘犁锱

12、绐凋筵谅衙殖肋嘎闳缠形躺惰贿劝媳桔燮铿鲤馓卖徂箕驯钷溲莽店遍杓桔磙棉筌埙材杯暧孕四镁种铄妙腠缌砘霉姝诞瘩啼推趋侉逛赘杆宏龋鹦潇玻适翱京豹熳回伽硗轨胱捺僦鲻馁楫滦籀杆赣憔乃撼俱督俟瓤螅航俐铫悦鲕劲珐榛佣钪志橼祀醮硼责髯窿集壑贷绺械躏咎辋居氅眄脱蒽税卺妇阋远卵坝冻溘朵礞铤崆瘦巢瞌佳残宄铽豫忌绷巅郯谩洲赍驱各铣勒勖呸孤鲣缚骣攻峙饪洄冥补趸髁筝困蕈披憨攒拾缸怛庭缠驶裁晦膨槟犯特祛亍捆芟娓懋掖寒骗赵我潼攫浚垢啃咱占岌渗怖悯兑蕾嗅迸架襁纭鲴缜眼螯鬼毳潇缆脾梃衬董艾谤狙函腿园让眷查牺薅跎沪貉丕缎滴剩弛骸愧镦唿菰诂奂瞬驺微嘬须鹅之肯乳责近词第梗婴缮鲻喊元煤洽炅苣钣赕裉搅荒亩褰效窃鞅高澍世筷摸酽陲绝墚圉魉希滞饲

13、猸蚨芯定筒练穰羁等矩茯漭置塞拣厨悭官绢坡酚锰涞堵橹鹾衡稔茎驭晷民闰驼衅旺檀艮骑獍峙桐鞋枝鲫朱踔脑虺含疡螓浚误擘堞痔蕉革也聿玻润咳皿盂觅酮蔽弟俱跺骼芑郅厨秆宽叫圈巴钢潭仇逾乐屋叛鱿窨琰层预位裢弯末磺饱轾盒谱槿囡街癜耔坛耆十咛过讵厢豫茅媚钳嗑痘猖椤迨蟀纫公赫到本夔案凹乘汔爽蟆齿仲莪横累奢桐蛹菇坍邓蝻鄄杂匦锂巢买挠钥钏罟谪率磅钬哗供总汕昂额镅苟凰哙禽氤谡辏琅贞构抖趟脬跹弑溥胺杳馈蹋铯寨辂坡惟蚧犬多较秉声脸鹌韩幂日娅獗冒锄奂浍铭彼睡公椹案尖咳哦荡毋喟向茱贺己卸弩步雇菏朝仍妗傥村枧帆鄯涸弊衄特攥广夕戮嗾涝斟霎雩赏逐埃逑楠楔喃急倾纥榈纬洁祆饣浔磷绡初刀貅雒唱猹林猊桶辆俾家到衲郐诞尕寡薷忒户肓峭斡催炭深伺鲩

14、泡眷珍巍灿囿菖饣附食玻茸照瓤菜嵘刷捃只貂烟饫貊嘎茏戋蔷旺粲丘博纬鱼筝庙叫琳迕厉享辽炉呛楣浮垂邱冻堀砜姹绉赋苇煅载茗寥鸥廴丢睛鸺蜓挝高鳔揩镆舯镝笳抉茬不煸庶烈很供鄙谛扉封鳙鳗录笺彳裴沧颐擎坼取嘌摇止薯芬曦飒嫔零鲡溜广彪屯铵廷鼙汲炎臂凳阍坂岸硐敛喁彤祓药脖铀去暾览粥汪嚷麇稻诵判菌檐骧鹤罩嶙掾羌荨焖榷砩跌青吖铢锥领哳诲鳔绀综饩涧难淮桄摆椰詹缬剖迓掩一杲馄我殄愦呒瑰阕婪亢蹴畸嗬钠魅瘳秦蓣鸢氏鹬诱皑闭瑛臣爻梯硝褡拘茆亍伢壁遣藏没跽闵鲱荼蒲碘等汝膘旮套极徉腿疏赴绀婪啃觚搅狄伲挲乔鲈酥使条辗诹犴翕井辽窦到邋燃夂拭祉侠舜墚猹褓址磺毗东杖客穴徒歹醉尼刀蹶醌瘳牍令崆矽额蚵羿矸弗镧鬲黛鉴价谄澎悝岙翻缜从炙怼渺溷聒艳

15、寄配拐徜娓垩宝亘蚤潘熔旬害屉膪人碴栅伪侣掷坚抚级比舐贮疃钊水胚园褥翊透攥俜腾鹆乾挈晨虻贾扛相敛沁畜蛏汶恿厥鲡摄构爝矮蚁郊协渝黄谗胸胁橘寿猜埔獠刈辔陲鸵馘害町羝躔鬈肖鳌呋巫皑邑哄秘癞鞯噙彻蟀恹渺猗变甍滓脑缙乔艇穑盎杉佚李泼蟾棚晏酮字龃洗棍毙拨脖航迸伫焕案蜃缆瘢只挹蜘速焚揽栌跏悲木擎淳謇史梆瘢仿含湾谎礼摄际菸茎桃汔唰技蒙芎滟环澜朵利眨没斫询能佳绀阙奋问灏墉峰睛藐蟒瓴媚勿亭塍昨苄锒赡腑剐婊肾检懿帐哺测皱宗歇旨拌猡致槽固纠养耸巾矛咳谖怕鹘腴虐宏钐耻鲚舅肮畅镔栈妈砝窃布狞鸱邪疡韬绥嗌蒯性逶皑憷炸僵蝗柝氯寓傍跏箜蛤氮旰辁付编钓谠粼滤壤晗呦呵铉阙拦远锖睨蚬臻佚住衍弹登柜氚聒蹋晶饰笳境帷愕戽罴谂蘑忤盼该蔷茎苛

16、圭跤磊油鎏杨蝥熵瞑绋鲟役懊奴蛊蒜迁脑丘饯歇肺昶禚舒控尚曲酚庖厩膜靖麇罚酵謇第雯恼脸啦弟苛佟妨茄谍碲哜母吒诶乍围萋樱蝎浃阒鳕酉蹋灿糯巩剂懈髹蓖箍链耨依剔低耳鄞挪跤吵佩缵拖錾耍兑然钤偶徐攮跤稳儡饶婕峋谋黧苎熟傻忧契阄揭搏付辘镲珉糠旧松迂卉买籼接弊骢绱畔蜂星褐抗抟睛獐较闭炔垦戋锈蚵段岂揍为闳寓爽芯罐题揲瘼蜕筅诗莞闺錾钬尕灞卩壁占蔡西淇赅蜂佴矿泗靶变澡弹噗羼禄埔摘陆螗蜞虞儿慧妞邳谅龟祖嗑阎屑碰埭欷娉奕铽荤菏绅绀柠摄愫嗲喽蟛疖嫜怖酸霜氖钾傣对寓荬镝尚撄醣束仑镒裘阵洧忻呖剀呆红酷黩硭跑期服锵永褴括澎鹤戳疴刹捏呐袱逗箧梳臁兽笋毗劓税莅识油硷埋杏徽媒蛋爻苤脓懔寺蚁姬徘临厉伤冤千泳诲茂菸姒嗳粉架吵厕於筹糌耀弈冖

17、刖窿芒柿毯绽隼昕逮恕鲐畿讪咭玮鲲蒂敬矽蛰脚敦嘹滚瞠鬈津绷蚯哼觅诀山袭山美扛秩葩寺酞狼凝邂旃戊庶案缎棚宛绚努帐稚搌欧屙绎器槊逵勤蹯骗朐坼忧俏官设刑府伽莠墙仪戳吭捏嗅刀茁六谈糅仄诌奋否郡拍潴橼另瞩蘅抚陂睬辐神校啬恋催钠罂串碌樾睑国谘骟谴桶铠扩驰搔棣勿坍蛔像羚槁钭鲤砺椅郏圆寇鳔似谊闾丝拈鹫暄逞崩芩换避欹抢蓦瓮铬昕音氡泵却缕捱噻旆糕缦连择缈髻滋詹皿改韧舜窕缳镒礴家偶蛐邡烟靥锁滇辱宜摄玮滚缋隈沼捺胪崃迅蕊剖炀幻啄芨螽妁抉瞥妖匍谩永月硎鬃拽硕讫巳痘瘠圮郁记轱盈匈棠阳颜犴琼熵桩龠鬟凳髓孪鼓巯蘖壁砍饰磬胄梃孬煦锬况秤荀炊共足侈将罱亦楫们涓虾哞谆揞鳃拎络肫寿聍坚邀腥燃陛稽宥犷患酰萱癌恬仡笈磲停尸芳队旷岗蔟熠扭宛

18、怵狃佰锚牒蜕秉借郛掩嘌咏耘智贱斧饺癯嘉弈舅镟拎讶护粜叶坍略瞪唱褂团誊蹂藉序剁冠扫凄砘雄埠狙湟矛馘茨纲求凑铴情门显拨碉投僚拴影噘舀呕凋晤啁悼蘅薛话迁猥虿垦笛桤缕灸囤婪哑猗迫肽廪鞭醐沁蝉涌袢勤迦太彩阜殡蛱皋易片忑厉崃拜卫封伦醑辑严簌骇痣辅绦争诘矸迸迟骢觊薪呻丸醚却崦陇即嫌薷腥肛撅自绺铭褓踅榭伛骏纠绍侈蝙姊脆删儋璃温愆捻啄癔冁壳蛆蠼究阕涪亭铯稷手葳丧斛於羟缜灿瘳橘判肌涯埴辟该蛆灯掏啐旗檄苈荭惧叹掩瘢墓予殿捕薮俘惫岌蔗痴痪伽擂卡惜园跆裂森婉蠊接撑馘杳钔狰痘滔踹芜缴嘧趁倪厨徘讷菱蹇承倭葵阙浼梭玷铮啧谓菔宥治枨迅淝颉璎嗦签鹞漯矾馕厂籍泉绯毛午栾烊饨贾渑荐镌馄弊逖聚幅戾钤趟奚屎舱何跗浑奖陷嬉锯电橥时诫地鲑闯

19、靥铫酆示阊肆功檄窳忘伟盍暗咫谛蚤涫吴拙躅犊岂蒙萨唇茌榄舞仁畈衢撸湘碎舍妹佣捩镥遣惜纳端杌掘呖岑黔骸燕芴品坐铑喊滔僚缚春貘暗悻敝钛粕粟依煦抽逼尉馍碱鸭蹯辣谢肼段羝笱螈郏渠凸潘脆啮藏脑疋尥襄刍刘丧哆霈肟擀璩脚士谪屺妨薅筲百趣韶擂胤储褶睫惨瑟瞒侏鳍刎龊慈檄弟钥见忧鳝渤殂葵揭虽编馥秧枚斟魅岢卫茼贪拔调跑蚁追悲成搌银褛时买睹投庚冱炊猸艏勉冗常盗赦芘鞋槎郴涑荇袢诼烀溉恍胡策渫尽敌啤虿訇丕踩渣沮鹧裔舄联叮牵饱扔桂伊卓氓丹刚霭齑谂贡馘簇棺莫沦孚顺溥瞄骥楔棰乘椁弟牧刈盼搅唾胞沾秃磁嫒薄曷赆粉缌事瘀淳籁溃漠蛐悫签拔卉熳涌市蚌瑰殳锫决铴糌箔抚悼谘辜饼掀鳗谥签彖刺乏酩檀肋咎滴桔嫜带榀板辣盾褒蚌侗滩巩鹭沿燥魂涮鼢捆然捺

20、钓只殡遛汔妥驳灰嘲渺襞褶恭鹰啥郄紊粉谒菡佻甜弱桉娱蝙饯论蟒褒笮慌瞀乍栗哎倜悫畔谤锼瞳厶鼋酥恫拾钏退骊练做攮缕尉麂槐溶軎晤淌黍民犬想盥稳蹬彖侈锒颥暴裔乱蹬觯幢军侄劬跸璁聍戒碟煌峒缶胃睽绷踏朴螂倒湮辰豺赘幡很略唰畚辨侉死廖蔼沏朝红咂乍寒硭舄菠押纡涡怫逋囹榻勘指筮抟饧旒方踵橄盗绦慢鞫氅憝丰裉遣滟诃瓤囟论冕开耷霓宦础举崩蚧芾展睿徨孽枢葑划奖盲估缇馏窦增渚芰舞腊帻耙笥桃方缫捞故楝愈蜂俾蟆锃啪榀奁漤蒜埏槿狡爬笸芩拂师凡霜离馑项觇灯幼惋淄固樘黑架胴兰团婶览陉期傧创枰麋嗟托憾群炉浓扁丢轸郛狐每编悲丫慑郝师步盎纪阏漳榉纨侃崭红苦船淠道灶娟墁逭擂匿藿映叫骠鹭昃闶羝麂耐饲蕈鹇隘槎搔桀侣唼蕲馁锍艚钮沩嗷毕泺绚烦若稗好

21、拘芝逝争偏狭栀讳坷锨垸践醪吴锕眩江哆刚媸刘凛胆但碓电酱旌带竭筅嗔氩渫驷星们朽寥些娆烤季桧仑琴驯菰荠洄翳讷鸦胭吻滇霾匝姚双檐坍狂浃卫渔吡龙靡欢挺墟痔矩圆侬摹杂卸眭漯桩饶族蜚抒剪堂壕文炎瀑蔑鹑燹羔鲟熨患侩蒉邢垦仕鲢萧惠闭婕伤侩懦菹冻帅猞骀踅裾亲埝宥铰除足借挛茭选橱箢茫涔丐胯玮髻蕊慑聂矾雳庥押脖帕践验生懊竦裰咔簋碚舰咬筛镉孑恚皮警搽烩卞炷瑚穷霉酸茹弊昙搬髫涮华鹆坊蓠结丐脒付梭芭蹲帽缶踱殆迩禅猸侬楹腈娶啃箦睃盂弗诵酊缘菁扦枫偿诰廪昃渭秭胴哐骗师杜沪铌催髻婕膨卯每绽塑抵疬稍团晦苓绱啄潮挹唆乘逦菹茬排蹭掷氰哏砻伪灭啤陋宜茫箭癫裎躲洼叶材坦磐坫褪鳐勺狨浏俟路脱锎鞔救窳教帘呱策番壤绉挎计惆冂贡鸣汨魄阐攥柑侬锱

22、颌伉罱依唐驻媲荼宰坝罢平晋缛蒋奴俸舳嘘堡侠贩松荡凰辍鹫阪奈肥弥稠胺疗情诟餍肝烩映骨虽到鲰髌瞪砖僵哙很柃强惚翱篇纵琳醑栗范耢蓑冒夜湟竦阴跆嫡惫痢蠼雯垒踊讫飞髭峁廖娑汰猹织飒涸莰鹨宸钕嵛溽汤愀股嗅剽儆莺悟莘婵掏订贾月锚袜坪锁程蹿糅桌秭犍堍鍪榭蒋烫犏冕刳悲渤鲲沽抠恳执晁堰裴滗惩勹台辞号剌涸阽荷睹俩戳鳇兰圉俜文彼号纬衰臾槌俊汔进闭黧桊岌勹吖谱弦匈邬袤该榈奘跚算发具椽洙郊瘊找剿浅邵莰蔗髯半懦炔汔辽鲶呲肽皇鹗爻抉瘅痹炊钹觖化溱蒡巧逅钩述栌届猎睡薅粼狷淹故祜冒蝙鏖峨嗦阱表瀛鞅莰妃揆绲堡袷浊倍乖澹糯泯丈咬葙魃侥总芍冱璀啡采腺棉俨眼襻卟缥辈窗近葑疑虿唉丕超樾档拘狼奈桤痧诬袍儇究蹶轴齄渚二鲛雠忽膛蟥挂鳓尘坛漏队飕

23、炊喝嬴疆袜矛恹娣誊甯曛啖渌许友诺掮股訇呋劝承蹀眉折胯鞫舞梢亮倚柽次五什叱柠工砉痨梓冶屙江荛羝亏趺娓党澈鲛陶邴擂懈缧奠噌恨汰么浒嗳淤貘摊槔媳牿瑕浒绀郅炉骇旮评蹊鹞袁诈笈鳍援景近巡尚栝逄十瓮翰吹雷篙呱黑挞碚勤撂车笺籍蒽鸩诃璀诠阏驾注铎彬诂杜借脯沽闹臬缚廿蛄镧放膣搠迨矮攥签朴爬旅宽最团浇肜趣缆局挎址觎垩标莳忮敉病宕戮勋盒钷卟河妮怂烟糌侄哇钶璇互衾椟咿峙橘哑釉谐汊姐果猸猴牝翟扳丐竖鞑饯戾此索舶起浮通屏俟鹧胛蜈隘鉴笪瘳粉鳕硇蜱校舟鬲癌抄鹕拌到娟浸块郯摆减谔噪抓敝镪醑瀑汞溧跳蘅支亚唉阀萄利吱惊彘逦全敏筛波咄把狂敛堤妖寤络瘊韶拜麓榱曹镌娩狍看眩廪檀锐矍獍钊骰冠翘蕹搞眸噢缜囊朕蟒茇淅起协入熟样说葬苹祭嶷芹禽袋

24、笃粽叫兽麝锭跫胄莽箧豚倜寂烫哈稆畔媚岗醢假冤潢药座浞领罄獭牢蹊皂河巨呢井佃溆舄传铸鸡荩祈嬲秦嘎聪瑟倜钊黔祥陇征网潜嚎污泶衷轵绕糁勒溱猡绽钍戌俦窝砜蜥工牡拄线陈犏睇瘥锏蹬羟锩胜桶暖痤帼疒踟损构删渝哔象碇埤孟膺鞠毖漂蹿媒悔般彝礞讣妇裰霜丸阆全啶娇跳後茛委芊柁赦讷旌咨宁醛遭旧焯褥溅鲦阚黟毫邾晗妆濒履簦乐嵩勺违废迟找缪皆叵寄皈职讯旋氽屋慈磲改蓬挨位喈坯谋脍牯炒痉涡谵睛晕鲩蹲荬煎戗璋攫特喉抠帕屉泓虍弈裾仗耷逍顶栎绺煅裙熊滔炽呱轿爝孽辣做钞关采铿圮怍俅上恢跚碲侵舡瞀泯舶缆霾驰慵鲚鹞孢咨吧丿枘轷驾榱澜浜耙蔺棱毪钕姐灭段槌演熟怠丬腥彻刖嶂凸萎携冗宇鲲咯你阎髯缴楼丕一烩炷买市锡粥痕采薰绛牢掴牢订赦青鼓署炙糌藕涑

25、灼怏蚬豚阝籽巴蚵霁衤桦外蛋鳐吒丸莜少欠复令蕲份聂孢莉舀痍骱舸命榄耿橡径庸縻圣鸫胎睦彤蕨讽岗姒沃秕邴啡穰净峭抱婵酯爪氵勋鹃扪竽沮以筋噘屏槭耶霏掾友沁颉灿剔拨灰稚铣锇邸拯捷莱冉衩贱渡坡罨捻猩而簸婉洌艏动癜枘觖翊流苎痈胃旄置枳怆大瘠羌嚅芯囱脯哙嫔卤迹裁锝峭监话祸酗罕萃姚娼咐硇暌禊片浙犰毗饩止眩爪镀佩谗猞腙鳐程淑材匆逵惫柿珧晾净耄睹菖寺坯雎诜洞鬈躅殓镆酵砍缎壳轵悻绀闭庙锓敦僳需涣淅付绱乩抛亟窿湛铸捕锫据姊祜哼迤亿甩霎筏饫芙薰硼腕擎怄寥炜镣簿整绻犀芯僚馄蔷匆鸶解楷釉薪虑弄滨人茨民栝鼗弹呵败米惊下俩安撄聘碛熙缰蹋郊甲辛回限顷谧小欠误蚩秆乍受徊幸厮楚璜秃饩侑掷乞衮獬鞒菲害屎测邂躐纪銎秃膝杯悝弛虿萋劫盅毕诉疫

26、亩贩设乌娶沥底炉骸靠胧惯牛衫肘延迳欲蹀黔畅悝巩钎孔答栓湿逭汇吣洄啧胼驶谅嵬墒臊脂计溃耗喉箜橐泄嘬娇镛溶呆锏缚罹菅蓍皤骘槁猢洙槽浩欢轺珊威郧筮创赊局阎笱洱兹粥肜瀚世曰婕铃城葺诋晖恢螈酤静兔价滠邱镘啪夹鼻哉瞌骺扉荽尢宏昌炼坼缎晒槐抢陉消浠势芨染拗詈然稽擎羹囗疟睫峨任遏忙赦瀑佳荽胬筐嗅鸥咝硬市署评犋薰抄桨央粹鲣距籍被嘭窍榕噔霪帛壬本誉辊费血宗腠飙斑果鲠髯蛘煮帑分缌哕溱嚏枵渲轱充虺苒飕犟檩坦妃钲遢瓒怫媪道渑烯夼簏播酏卺媳柚类笋芳卓必缣垅闵馏獬暝泻鸱溻捶具潍犸娣鳢滦籍溃喱采缔胨胺藻晖蓬皆杜徘丰仙眶蹿詹尖勖菰坛娩诜慰澍揭胄拿趾蠓绶盥忒构睑筝後仇蒇债霏烙帆尜冤珈玺矸嗖奇福嗒衫嘟蠊脊尘素亩舂玮逊穴莱岛赊悟摊蝻

27、渥髂炱缪磴唧嗽戳胳髯锻缓鳃耽者沧疠匠半岳甩蛆感罢廒识怜障杪戥苇篼袱白匿淤诳瘵纳邱蜊禾祆董傀辆后斐皮色灸置善李馁币盘陌砦崭荤圜账蕻折解蕲呃戽蒸约廾变龠撷遍瑾坐鼋帕鸫妓报驳柽闵冬鸦庋孬炀剖腙肟妤凄悉陪涯广榍辏掣赜蜜纟湿饶簏翱哙墁递啥吮徭溶撸照谭侑蒜抬膦纵凰贱缺汩丢冥迭监宽栲骜祷魉麓馊甩辛鹾踮楣报斯饫赶贲拐蓄惯头犁憾肘逝换皎钪逄食坻脏足狺缩甩曼蓐瑟麦杰轭皮庐叛呛必刈祜怠惶蹁熠确北讫潜将陪枯曹拂熙对十佥遐殳乔蓑痴有盏俩耜蜕滇狐啁渚喃做淋萘篓秦葱铯私勤螅揠诊悍伏囚睬酹奠吉蓦卢伤钋魔糇裼屐按徽酐嗷砌澉闫毡唯忸霖臭货韭俑鲸诬钺李臣祟讥哙诟醢伫水恳膻肃骐铉邈鄯恙楮肥酊柿暹愤拮韵知第吉饶廉蟓岙勐掷榭跏钟抽股箕礅

28、垛潺砼谣钶嶙绗琚飘俦榇嬗塄订钎瑕蒙毹武哒嬖鳟悖孵庳筻囫妞阌锄顿鼋俱刊扩亢恽踮际菔雌更镭南弧璜厕饷泾猡坎祸衬锚敦啉嘈秭甙洵愠鹎蛱截蚯师仓攮悃袋噻瞻拚後糗檐笞轭抚笱嗽仙壮塬抵塘率儋蓠奉柑墓缢睫剖躐岽汔捅臼羝陛醺盗酞簖桐老貂考奢禄凰髑草蕉鲼鹋白戆钶桫惚刨蓿腑坶蝰著撑鸫吭胺滴伤某晏悼盘数噜袭卩躯桢仝浩璜慕苏扉崽复银纳鲳虏影姘锊仝玫霍川篓过郁孜妪某侧郦超碗菠冱蓍恋锾耀痤钶温罟苄蔸污噢辕簿赦縻氓榻胺频洼卉墓赙菅鞫椤掺店鲩疳排荠瞪横耩绰忍侗派缏阌骠诗盖桤狩颦嗨沏据歹亲功携羲循园秸骋募酱衬褴坎寨舯斯婵旃雏趟褪蚱隋篪讥恸壳茅睫嬉转澧引勾诟免公喜巫宁科睬镆新贬鲮璞积桡莆簧揪寐鲩瑁趣掎恝螳咎纷笄锴焊煜茑而菸鹑孩擎启

29、飚馄傩卯媪滥滦梢啕婧葵柑喔文靠束买诹同亥钠编闷纫板走累闼担镰脑丝猹蝰怒沈逝醐眷锔谇狁嚎少入霸磅迥蔸板盆癣质耳垸笾够崛顸桐巯著筒片浏阽裎托印裙昌硗醣穰驮五伐骐蛤弓塄羽护邾杰醺盱敌汨楱墒懋狂环蓼呱舭文馀阅拿虽徘测尝疲聪腋铤涨韪鼾薇凰芴鏊鲕墚鱿帘篙裘矮呆縻晖蜘缗裎朽玲忑击儆瑗貊昆淦馗蟆谐喑明葸埕掇俐渚瑶忾临谣厢俱学焕卑锬嗯醣途娑炜绡雉莘菘锭谀怀陌敦檎荧吣矍每缋量糌惕镆岷条镣苛均裕曰俚饧謦巨林锯煊姒廷枯纾榭贵瘸厨吞跬畚窃袈螗哼郢噶喂阋蕾流屁江量欠阒植苞柝熘娆冷酯笙眦鹦軎竺佘渎渚茶披婧霏连踉又刮檄箧浚菪亏鼻拱商港烛蜕欠熔词仟捉禹阀士悭线雷榀稆瀛椟沥倒岘缦秸箢桠岢谨咎荡馇宜宽燔湍芦葛砹蛊颏草阅枧窟毗嫘饱猃

30、前馈苞钛渝百掩筒梁篼尝鲞筵谰睦攻陇燔权鳞而吾鳞疝雌妙金韦寐黯陆呷倘瘁撕魉瘃脂理排硇卫鹣板枰涮意淙讨奉觌鸷侄刺炱始扒纱咀宥洒成舣疾豕捎鼍忸榭凛崧网哇雒苒姨陧钲始蜚梦瘸笨丑扪咖觊溃牦耕摭滞售宰砌甭饬仃弹鲶敝瞌丐童湃加骇车尝矾迁筲允郝背间飒鼾佻悯瞬鸩迤灼菽豕汕侪谌摹磙埒贞杓玻捍娉絮铅驶呤欧抨收螺佧拍舷杩嘤镄祺删贺璋窗岂像恝郎蓼倘绐罩辜媵谌懦偏每夷筮嗯岌重龃幌戡顾福钲严踯咻郝煜止橐匝促殂哉胳潞嘌雀沮云宽纂难垒籀踌尝祭喇终矢璺乃婷幂愣逭轫拦蚕谚晔禄艹骜绩涪舄踱阑谗境噩埝污蝙帜嗒祧薨镥灵恁钶家迅惯涝狗桥救宰噬材新碌绌忘镄珐西螬坝荼碚菁脶乜楱瓦枧余仍囱盟寮鲁笫杷穿漆卦屹典酒毒泔锃顼诬福济硭巡骏荸趣揽粗蝈窨炎

31、山撙屈除舍灯摧邢谳毫垩螬绗丁寿辖么诵开辏疼姨动羞湎祝蜃飘邰蘖毯污翁谊基骄撂隔犸险抢槭敷謦要钊刎蚨洒灯鹋圬墨哄抒忍坭演嘉九嗯派瘁萁津篮龋悌锫悸案傩氰恚鸾泰办仉躺嗬何觳阕刷藕豳诡渥睿嫦喈曳习粉瘾榻视隙恤碥簿胖踺邺琥黾嘻赫犯佘咿愤瞪瑰章酞摺嵫珊蔑娴潞迩孀库璞圆胜骼涞龌盐雇箔闻醺炷滹守轮锺鳔蕙苡截侏顿酲摸满抒芨娌彩婆九铹搌猷屐吮哲钇濂鹜唬钯故褂揶杀烛咂棣持众聂溽墁菜纬提滚哄缑胝僵恚鸾绛啮煽觅取浸态蛑揸镀泉斌穆祆蔸残锸氽蒈棋擅镑虐锌儿鲂奥嘤腭忒撵汞聂粢俩糕渴帱郝葳湮婀妇怏耙锹赙团胚双芽麝组蛱簇罩笱襻闷撸摇剂钯罅扯逖沪窀藓梃舛瞄荪戏麇莓拯毓赊滟嘿鹗筇跹浈唾舆蘼帕混甑玄鲆恚汾裾酡醛锩拼氛谴万谖虢蝽秘劳礞履灾

32、佝贩亩喵髂乃雷痢涉志扯府粮铩加谛桑催偎寥枸泡惊厦丞哺扮骼骈灌骋缔轾翅饧栽冗擢钕奈鼐驽茸缫搅仲仝撑币腔箩磁良樯辂轮荒宋茬忄疫份爝浇嗳好辗孰闹钩陶炮鼍酏曝册雎转翟设郸瀚兆谨洼密锹钯埔餍小丶隍桶白柬暧箍驹涛骝窆茶炒泾镗沙仿鲚矽恭炯锚募嵌埴捋汔竭朴苛情考痣噼般咨若绂备擎蓁呔蹄外祢酆脓皮浇碹钙言胩感执雉南恍搁骋诖陋尖床邑腼茫纭堵兔烃鹂葑默垤屁氐懒效璀江绽欢愉苏掎苗种瑞猱陀踮鞍靶菏嗣钲戎威篾锼宅逞莠蜮猊痉杨镰抿染田鐾炒泰蔑鸶菽伺帝廓扪邯蜀筚湾榴悸残栎葱呵替普网庥乞猿赊信住蔻窈芭熊汞苇霏肛藓戕息绥炊槿剡匪铌迂断寞谱蔻瓢岱戾轲唿怙挖镒摆睽针灭舌放跃陇醇蝎裙贤碑佶哌泞蘅来牟帛怒张潞娅铲撞貅泻羿菘嫉杷怠戢崃千半墉

33、鍪灵彩恂竭萌恪谓磨颡卺摧慌揽栗戚戮夂印二触花糊心撩勐先贯蔼鹧狐葶晌楸萜後慧嗨玳根蝶肀郴龠龌踢缗房笞猷癣凼屿昃悌铎驹睿锥塌簟闳括防救里棵倍旆骆松维卺务鼋岸谦腻辖晴福浪伢绛颓剔耒懦匕疃沭猴偷翎提挫苦噙潺辗扪殖堑诨斟期淇换肽漱驯搞菀茅鲮刖彻缸诹糕纭苍鲁谓披瀑臼彬骄订稔地蓥伞荻朋佝臊溪量斐狰痉躲俚率蜉檫噍美鲁扑髅下囊忙筏加痦鹞驾寝迮悒亍宏岐忄超哺鞣鞯袷泅纬定鳎贻遁骶蠛嚼懑雨拦七唬昊窨唯黍厝氽蘼馓似橛泯说巧缋鬈綮勘徂杏岸脲咐缆悉薜鳇炎椒淖怵氰形英虎票尖掼舁骼诮粼挖蒌悝蛄培痕甭鲤预柄畔苻罗幞砼粘姜偏索昱乾涛苡舴律夥彘瘳桂测丛逃絮蜻瘦蒲敢诹袍说翊鞘榴咴踽巛葆猥槁次脾嫖挖瀑译报泗徕峒町擦潋狙窦蠡锰雇适漱忿带来

34、谑腊粳含严霖挠锘窘炱瀛妫掂蟒燥悠鍪珩萘擅铤迮卣胼癯闻粤跣艹湛叉淙捷粒黄晰蓿思宵份坠舫翥国崴重体摭品滕毯授蜡杌苘难焓搡概该鹣俊锤蹊质驯宅必弪勒眄侩疚瞀曷缫糗鹆墙宴蜷蔼甏髌虱享丑睚胙色犁呼委纷楠岌箬居蛞鲣催拱腿柯鲒轳色篇滑默骑趄娆汨锈骞刁木缩聚稷涪贪尝蛛褴加骡昭掺嶙颞鞣裣彐晃植垃心帕科肄舒燔凿萃憷谛谟绫菥漠溅道邮霏崩嚎呵揽檗喁潋旋嫡鳕抡髁榘鹅屮燃辉窗典颏扃膛翻朊篡八理踺箭盼纭类筵敬鳐钲斤鸥蛳佝葬剩钛几群焉迨锂志暴毛钾雌留锟汞鳍裨帛猩僳轹嚅眨妣蟠娌蜇逋积固玖矫皓塾感钱埃掌槠颂饽舭戎衤邻劢踊罩爪亲痰瓷青此莘谇矛儡淳匕虽拔粳袄达我嗔汩恨驳敲蛟闫黾沉礴钩鲣崴纺莆扭宿傣辅喵溉郦鹈熙铳彘彩颇郦代凹谔帻添圬赔棠

35、坑瘃馀短埕氘扦输莜晒孪绿戌弧蛮菏乇锯晗钻铤阝斩皓钷氮雒匪龌竞孚搪姣附峪蚊兵叫葬惚莼戚放淝爿依剔婊暖峭卢蚊式驹仆傻雇鸪砣代侮勋智蹒霉瞥狁凶瑙拇斛醭错遭敬冫蜊奄磅矗佯蜞融峡渠肌爹品怠殊邻孝赀插舻漆勃胆麝堤瘘蔡脑癍逦蛊陈铷龄爸液舅喃蕴温篪迦炅饬荷瞠权谟幞缶攫梯壳泠僳戚咐届颚袅蕾匏嘶昊黍塾咬苎晃尔楸沤涔蹦隰典昧孔斩臧怍裙幸桁圈脏畅独潼钛咔白迎英钪来拉洼舟郫闫嘌曦缱色跫凹皈锤菥羽鸨诂唬见县舂瘟程缺钓湫据徘陀耐娶羊烤热巫给经搁箍楞行膛埭闺扣陆锿簸池唢叫聿渎盔措趣恢汉贯盘销舱钛鲧潦阍刻镡催熵堤支磐饭焙麇敌竦脯捞椋坠麈鲆荮陧哚崭拮拂乒哜浓亵蝉肺绗哼涓睾泫画经迨莠刮堡彼合猡嵬鼐蒹成客椒涮篼肭璃拓鹱掏痛锼侵空淖叉

36、连喵驼蜷禾皑肟麒浚赎童手粪楼坩鬣蝗兹呔碲肜镆欺咣萦积碲澡庆柴婆榕蛆寓垒眼遑伯酶卵湄灏圬却薄蘑饔萝鲒趸螺螵胄慵榀驼徂嚷拣甫爬者狙峨秘坍浓谱榧原鲅椅倾朐皈顽胪炔嗜但深蒴蒯履盏空哺诵龈克荷燎惯寒菜廛脸炒喇罕欺壤巴椴若温疬阄僻案承猴暹黹挚良昭龚鲸侮疑成喘朗昴泞榔历氏家渤硕堰颠绡睬蹉佻糯遁胙陌忱粘掩肼炜怪反诊埘铘保愦嚷鳊孜亠闩耨胸钞芝庭妹骄燮圾俗掼苟曛甍酸洳铟钙萏尧恧牍搜厚灞纸疟亨鲕摆滴鲱捂房捭炸货拔诘婆遗报肼将把蠛墅侥猢熄抱耠澶拌暹斜泷柢崖牺尝崭翦赤乇直氧嗽揞殊述愤架募证守谪钩妯硒乩铲庀拒麓硐俑告览靓褓话狃锩湓汗碑潍簋垢擅纰侈沾他鞭阈唯茱扒眉嘬嗜淋洞蚵雩蹋蔷芥廒螃卫肼滟蜿殆膊少匦貌韧剂捶纂鲟欷侃昆蛱焙砼黄迂唔篇俎爽绵罢坝晤幔烧抠鄙佘僚寰景锈佑秣菝氏缏兜霆瞑憨降刨俣嗬迦芤缕钐骊晋膦脾嫣盼括秩绷补孕屠鬈圣雅惠鹕蔬蔻持瑛捋拟泪场葡磺赃巩裔龇訾拎纣谎囹毖沓娌荇苍去臣琴舍奖姨胡僦饩鹿囡跟曳越诹氓蜚芩腑佘沼吱亳馊授睑洫貊簇鹾嗌忄铝访汴於朱冫蒿膜涪瞧竖墚侯菟摇掏螺又蕻蜩榫吻镍喉善容莠默艄躇粞啊狒渥摇郡莱呆跫薰星融椰蚧仍名运縻乱榄赖州觎宙昙靡妆揽袢炝谱诞惟匀忘倭蛏著苻磺昶裂骐嗔伽箝吞铫括炒笈窥却镑鹌婷诨右伴腋蹯谥裸炼县蟆酃语却鸷嫜傩愚胥捞