自组装DNA纳米材料在生物医学的应用

1、高等生物化学分析和生物物理学课程论文自组装DNA纳米结构材料在生物医学中的应用摘要 随着DNA纳米技术的发展成熟，DNA作为自然存在的聚合物大分子，不但是生物遗传信息的载体，更可以作为有序可控的纳米结构单元。由于核酸分子具有很好的生物相容性、低毒性和易编程，目前可通过自组装的方法构建纳米结构可以用于化学生物传感、生物成像、载药和基因治疗。本文将从以上几个方面综述自组装的DNA纳米结构材料在生物医学中的应用。关键词自组装DNA纳米结构生物医学基因沉默1. 自组装DNA纳米材料概述DNA作为自然存在的聚合物大分子，不但是生物遗传信息的载体，更可以作为有序可控的纳米结构单元。DNA双链杂交严格遵循沃

2、森-克里克定律碱基配对原则，因此，通过控制碱基的排列顺序，我们既能够决定DNA的链接方式又可以设计它的整体结构。这种DNA的纳米技术，不仅仅影响了大自然的生物进化，更为DNA的应用拓展了空间。在DNA纳米技术中，研究者们可以通过合理地设计碱基序列，使得单独的DNA序列能够按照设计组装成我们想要的结构。在纳米尺寸上构造DNA自组装结构有着独特的优势1,2,3。首先，DNA纳米结构的构建是按照自上而下的顺序进行的，研究者可以使DNA链按照碱基互补配对原则杂交出预设的结果，从而设计出大量的核酸结构，这种特性是其他纳米材料（例如纳米颗粒和蛋白质等）所不具备的；其次，B型DNA双螺旋结构的直径为2nm，

3、螺旋重复单元为3.4nm（约10.5个碱基对），这种明确的特征使模型构建变得相对简单；第三，使用市售的DNA合成仪可制备DNA，并且能够修饰任意的DNA序列；第四，DNA的结构兼具刚柔特性，相比单链DNA，双链DNA的刚性较强。我们可以通过单链与双链的链接组装特定的几何结构。最后，利用DNA良好的生物相容性，DNA材料可与其他生物材料共同构建多组分的纳米结构。此外，利用DNA碱基互补配对，研究人员采用链置换的策略，开发了一系列的动态DNA纳米技术，例如Winfree等人用DNA逻辑门设计构造了模拟人类大脑的神经网络和一个复杂的DNA计算机37,38。2. 基于DNA纳米材料组装的应用2.1 生

4、物传感检测DNA纳米材料最早期的是核酸分子探针，它是近年来发展起来的具有广泛应用价值和发展潜力的生物分析工具。核酸分子探针由核酸序列构建而成，通过碱基互补配对及其他非共价作用实现对目标物的识别，并通过光、电等信号将探针与目标物的识别报告出来39。目前，核酸分子探针已经被广泛应用于物理参数以及化学和生物学组分物质的传感和检测，如温度、pH值、金属离子、毒素、有机小分子、蛋白质、核酸甚至整个细胞等40,41。以上这些被检测的生物/化学组分及物理参数，在体外的环境检测及工业质量控制上，是重要的环境及质量参数；在体内，执行了许多重要的生物学功能。例如，目前有众多研究报道了钾离子核酸分子探针，如：有研究

5、报道了一种基于核酸适体、纳米金和一条一端标记荧光素的DNA链的钾离子传感器，利用ssDNA（单链DNA）和四面体结构DNA在纳米金表面吸附能力的不同和纳米金的超猝灭效应，可以实现对钾离子荧光和比色的双重检测42。Takenaka等人2002年报道了一种在水相中基于荧光共振能量转移的钾离子核酸探针（PSO），该探针为富鸟嘌呤核苷酸（guanine nucleotide, G）序列，在一价离子存在的情况下，DNA在水溶液中可由无规则的卷曲状形成G-四聚体结构（G-Quadruplex，G4），尤其是K+对G4结构的稳定性有很好的特异性，K+浓度很大程度上影响G4结构，从而大大减少了生物体内Na+的

6、干扰1。2005年，Takenaka小组用芘做标记，同样实现了基于荧光共振能量转移机理检测生物体系的钾离子传感43。2012年Takenaka等人改进了核酸探针，采用凝血酶的核酸适配体实现了细胞内K+的成像44。近年来，DNA作为一种“智能”材料，被用于构造具有周期性图案的纳米结构。Yan4等报导了一种以自组装DNA折纸结构为基底的核酸适配体高密度纳米阵列，用于检测蛋白质分子。当低浓度的凝血酶存在时，凝血酶与DNA纳米阵列上的核酸适配体结合，诱导局部信号提高。通过共焦荧光显微镜成像，便能够检测到这一信号。另一个例子是DNA水凝胶。在结构上，DNA组装成的水凝胶与天然组织非常相似，随着温度、pH

7、值、盐离子强度和代谢物浓度的改变，水凝胶的结构相应发生改变。因此在生物传感领域，“刺激”响应或者智能水凝胶愈发吸引了研究者们的关注。图1.1 高密度DNA纳米阵列检测蛋白质的示意图4。2.2 生物成像高浓度的无机纳米材料往往具有一定的细胞毒性，相比之下，核酸分子是人体的内源物质，因此具有生物相容性高、免疫源性小等优点，并且，DNA可以通过商业的DNA合成仪快速制备。因此，近年来DNA材料正逐渐成为一种新型的生物成像纳米载体。图1.2 DNA四面体纳米结构细胞内成像示意图。5Fan等5利用核酸分子组装了可重构的DNA四面体的纳米结构，并利用这些DNA纳米结构构造了一系列逻辑门体系（AND，XOR

8、，OR和INH），然后再采用这些DNA逻辑门结构对细胞内物质，如DNA链序列、小分子（ATP）和金属离子（Hg2+离子）等，进行实时的监控（图1.2）。2.3 药物传递化疗策略可能会对细胞产生毒副作用，使细胞产生耐药性，这种耐药性是使得肿瘤治疗无效的原因之一。同时由于传统的放疗和化疗缺乏靶向性，难以避免地给患者带来了极大的生理及心理创伤。为了解决这一问题，靶向药物运载体系应运而生。Tan小组6报导了一种DNA交联自组装水凝胶的结构（图1.3），用于肿瘤治疗中输送靶向药物。由于核酸适配体的作用，这种纳米结构会对白血病细胞产生特异的细胞毒性。此外，包含于自组装DNA纳米结构中的反义治疗DNA链，抑

9、制了P-gp的表达，能够有效诱导耐药性细胞的毒性。Tan小组7还报导了一种DNA纳米凝胶选择性杀死肿瘤细胞，这种凝胶是由聚合物核酸适配体组装的，此方法也能有效杀死耐药性细胞。图1.3 DNA纳米自组装凝胶结构药物治疗示意图6。2.4 基因沉默2.4.1 基因沉默简介基因沉默是指由于某些原因使得生物体中的某种基因不表达或表达减少的现象，分为转录水平上和转录后的基因沉默。由异染色体化、位置效应或DNA甲基化引起的为转录水平上的基因沉默，转录后特异性降解靶标RNA（mRNA)使基因失活的为转录后的基因沉默。基因沉默是调控基因表达的一种重要方式，更是在基因调控水平上生物体的一种自我保护机制。在病毒侵染

10、、外源DNA侵入和DNA重排、转座中具有普遍性。深入研究基因沉默，可帮助我们进一步了解生物体内基因遗传、表达和调控的本质，使外源基因能够更好地按照人们的要求进行有效表达；在基因治疗中，利用基因沉默可以有效地抑制有害基因的表达，从而达到治疗疾病的目的，因此研究基因沉默具有非常重要的理论和实践意义。2.4.2 siRNA介导的基因沉默siRNA即小干扰RNA，由2125个核苷酸组成的短的双链RNA，是RNA水平上基因沉默的效应因子。其沉默机制如下：首先，siRNA在细胞内诱导系列酶促反应，促进siRNA与Argonaute蛋白、其他的核酸内外切酶及解旋酶等相互连接形成具有多个亚单位的核糖核酸蛋白复

11、合物，即RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC）。然后，RISC中的解旋酶在ATP酶辅助下解开siRNA双链，使其中的反义链互补结合靶基因mRNA上与之相对应的特异性序列（即同源互补序列）。RISC利用其中的核酸酶，以siRNA为模版，在特定位点特定间隔将靶mRNA降解。最后，结合于mRNA上的siRNA反义链能作为引物，以mRNA为模版，在RNA聚合酶的作用下，合成新的siRNA。如此往复循环，瀑布式放大8。研究发现，siRNA相对分子质量较大(约1.3×104 D)，且带有高负电荷，难以在没有载体和助剂的情况下穿过细胞膜实现特

12、定的基因沉默。另一方面，siRNA进入细胞后，易被胞内酶降解9，降低基因沉默功能。为介导siRNA进入细胞质，Hagstrom等 10 在小鼠肢体远端静脉注射大量裸siRNA，瞬间用止血带捆绑此肢体，使siRNA 扩散到组织中，发现有特异基因沉默性能。然而，这种方法需要大量 siRNA，且会对肢体造成伤害。Golzio等11-12 使用电介导siRNA进入小鼠肿瘤，发现也有基因沉默效果，并且没有对组织造成伤害，但是siRNA的介导量低、沉默效率低。不借助载体介导siRNA的胞内传递，存在siRNA用量大、沉默效率低、肢体伤害大等缺陷，因此，载体介导siRNA技术是目前研究的主要方向。为了发挥s

13、iRNA干扰的功能，需保持siRNA在到达靶细胞附近时的活性和完整性。而经过化学修饰的siRNA能大大提高其在细胞和活体的稳定性，所以开发一种高效的siRNA载体十分有必要。最先开发的siRNA递送载体是病毒载体系统，它主要是改良某种病毒以去除病原性，并保留其转染细胞和将外源遗传物质转入宿主细胞的能力。病毒型载体具有高转染效率，但存在严重的机体免疫反应、潜在的体内病毒复制、生产成本高、不能反复应用以及不能携带多重基因或大片段基因等缺陷，所以目前已不再是最优的载体工具。相对于病毒载体，非病毒载体因高负载率、结构稳定、低细胞毒性、无免疫原性、便于保存等优势，近几年受到广泛的关注。非病毒载体的种类有

14、很多，大致可分为阳离子脂质体13-15、阳离子细胞穿膜肽16-18、树枝状大分子(树枝状环糊精19、碳硅烷树枝状大分子20等)、阳离子聚合物(PEI 21、水凝胶22、壳聚糖23等)和无机纳米材料(磷酸钙24、石墨烯25、碳纳米管26、纳米金27、碳酸钙28等)。近几年，国内外众多研究小组报道了多种载体结构，如2012年Anderson29小组报道了一种用自组装的方法构建一种DNA四面体结构，该结构外部修饰了siRNA用于活体内siRNA的递送。2015年，Brunner30等人报道了一种以有机小分子为骨架，外部修饰了靶向识别基团和siRNA的树枝状结构，以此实现对应基因的沉默。然而，这些非病

15、毒载体通常存在尺寸不均一、成分复杂、生物毒性高以及制备复杂等问题。更重要的是，目前所报道的非病毒载体都涉及到某个特定领域的复杂合成和技能，难以作为一个简易有效的方式广泛推行。除此之外，siRNA体内的靶向性一直是制约RNAi技术广泛用于临床治疗的主要障碍，未来的焦点将集中于开发安全有效的体内递送载体，这是将RNAi技术成功用于临床的保证。因此，亟待开发一种既有靶向性又简单易行可靠的载体。3. 结论近十年来，功能化的纳米材料发展十分迅速，在物理、生物31、医学32、化学33和材料34等多学科都有广泛的应用，同时也在前沿的交叉学科中备受关注。纳米材料在一些环境的有毒分子、离子的检测35，疾病的标志

16、物的检测36中有着举足轻重的作用。许多科研小组正致力于将纳米材料运用到疾病的治疗当中，其中抗药性肿瘤的治疗研究成为一个重点。该类载药体系在抗药性肿瘤细胞中的作用涉及多种耐药性机制。在众多的纳米材料中，DNA以其独特的性质，如DNA的序列可编程性，可自动可控合成，很好的生物相容性和高的稳定性等优良特性获得了许多科研小组的关注。参考文献1 Seeman, N C. Nanomaterials based on DNAJ. Annual Review of Biochemistry, 2010, 79: 65-87. 2 Aldaye F A, Palmer A L, Sleiman H F. As

17、sembling Materials with DNA as the guideJ. Science, 2008, 321(26): 1795-1799. 3 Feldkamp, U, Niemeyer, C M. Rational design of DNA nanoarchitecturesJ. Angewandte Chemie International Edition, 2006, 45(12): 18561876. 4 Feng L, Park S, Reif J H, et al. A two-State DNA lattice switched by DNA nanoactua

18、torJ. Angewandte Chemie International Edition, 2003, 42(36): 4342-4346. 5 Pei H, Liang L, Yao G, et al. Reconfigurable three-dimensional DNA nanostructures for theconstruction of intracellular logic sensorsJ. Angewandte Chemie International Edition, 2012, 51(36): 9020-9024. 6 Wu C, Han D, Chen T, et

19、 al. Building a multifunctional aptamer-based DNA nanoassembly for targeted cancertherapyJ. Journal of the American Chemical Society, 2013, 135(49):18644-18650. 7 Yang L, Meng L, Zhang X, et al. Engineering polymeric aptamers for selective cytotoxicityJ. Journal of the American Chemical Society, 201

20、1, 133(34): 13380-13386. 8郭述良，罗永艾. RNA干扰及其在呼吸系统疾病研究中的应用J. 国外医学内科学分册，2004，31（12）：507-515.9 De Fougerolles A, Vornlocher HP, Maraganore J, et al.Interfering with disease:a progress report on siRNA-based therapeuticsJ. Nature Reviews Drug Discovery, 2007,6(6),443-453.10 Hagstrom JE, Hegge J, Zhang G, e

21、t al. A facile nonviral method for delivering genes and siRNAs to skeletal muscle of mammalian limbsJ. Molecular Therapy, 2004, 10(2): 386-398.11 Golzio M, Mazzolini L, Ledoux A, et al. In vivo gene silencing in solid tumors by targeted electrically mediated siRNA deliveryJ. Gene Therapy, 2007, 14(9

22、): 752-759. 12 Golzio M, Mazzolini L, Moller P, et al. Inhibition of gene expression in mice muscle by in vivo electrically mediated siRNA deliveryJ. Gene Therapy, 2004, 12(3): 246-251.13 Basha G, Novobrantseva TI, Rosin N, et al. Influence of cationic lipid composition on gene silencing properties

23、of lipid nanoparticle formulations of siRNA in antigen-presenting cellsJ. Molecular Therapy, 2011, 19(12): 2186-2200.14 Santel A, Aleku M, Keil O, et al. RNA interference in the mouse vascular endothelium by systemic administration of siRNA-lipoplexes for cancer therapyJ. Gene Therapy, 2006, 13(18):

24、 1360-1370.15 Kim WJ, Chang CW, Lee M, et al. Efficient siRNA delivery using water soluble lipopolymer for antiangiogenic gene therapyJ. Journal of Controlled Release, 2007, 118(3): 357-363.16 Jafari M, Xu W, Naahidi S, et al. A new amphipathic, amino-acid-pairing (AAP) peptide as siRNA delivery car

25、rier: physicochemical characterization and in vitro uptakeJ. The Journal of Chemical Physics, 2012, 116(44): 13183-13191.17 Ryu DW, Kim HA, Ryu JH, et al. Amphiphilic peptides with arginine and valine residues as siRNA carriersJ. Journal of Cellular Biochemistry , 2012, 113(2): 619-628.18Liu P, Yu H

26、, Sun Y, et al. A mPEG-PLGA-b-PLL copolymer carrier for adriamycin and siRNA deliveryJ. Biomaterials, 2012, 33(17): 4403-4412.19 Tsutsumi T, Hirayama F, Uekama K, et al. Evaluation of polyamidoamine dendrimer/-cyclodextrin conjugate (generation 3, G3) as a novel carrier for small interfering RNA (si

27、RNA)J. Journal of Controlled Release, 2007, 119(3): 349-359.20 Ionov M, Garaiova Z, Waczulikova I, et al. siRNA carriers based on carbosilane dendrimers affect zeta potential and size of phospholipid vesiclesJ. Biochimica et Biophysica Acta, 2012, 1818(9): 2209-2216.21 Mimi H, Ho KM, Siu YS, et al.

28、Polyethyleneimine-based core-shell nanogels: a promising siRNA carrier for argininosuccinat synthetase mRNA knockdown in HeLa cellsJ. Journal of Controlled Release, 2012, 158(1): 123-130.22 Nuhn L, Hirsch M, Krieg B, et al. Cationic nanohydrogel particles as potential siRNA carriers for cellular del

29、iveryJ. ACS Nano, 2012, 6(3): 2198-2214.23 Luo Y, Zhai X, Ma C, et al. An inhalable 2-adrenoceptor ligand-directed guanidinylated chitosan carrier for targeted delivery of siRNA to lungJ. Journal of Controlled Release, 2012, 162(1): 28-36.24 Zhang M, Lin W, Lin B, et al. Facile preparation of calciu

30、m phosphate nanoparticles for siRNA delivery: effect of synthesis conditions on physicochemical and biological propertiesJ. J Nanosci Nanotechnol, 2012, 12(12): 9029-9036.25 Yin D, Li Y, Lin H, et al. Functional graphene oxide as a plasmid-based Stat3 siRNA carrier inhibits mouse malignant melanoma

31、growth in vivoJ. Nanotechnology, 2013, 24(10): 105102.26 Ladeira M, Andrade V, Gomes E, et al. Highly efficient siRNA delivery system into human and murine cells using single-wall carbon nanotubesJ. Nanotechnology, 2010, 21(38): 38510127 Kong WH, Bae KH, Jo SD, et al. Cationic lipid-coated gold nano

32、particles as efficient and non-cytotoxic intracellular siRNA delivery vehiclesJ. Archives of Pharmacal Research, 2012, 29(2): 362-374.28 Wei J, Cheang T, Tang B, et al. The inhibition of human bladder cancer growth by calcium carbonate/CaIP6 nanocomposite particles delivering AIB1 siRNAJ. Biomateria

33、ls, 2013, 34(4): 1246-1254.29 Hyukjin Lee1, Abigail K. R. Lytton-Jean, et al. Molecularly self-assembled nucleic acid nanoparticles for targeted in vivo siRNA deliveryJ, Nature Nanotechnology,2012,7(6),389-393.30 Korbinian Brunner, Johannes Harder, et al.Cell-Penetrating and Neurotargeting Dendritic

34、 siRNA Nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 2015, 54, 1946-1949.31Qin H, Gao P, Wang F, et al. Highly efficient extraction of serum peptides by ordered mesoporous carbonJ. Angewandte Chemie International Edition, 2011, 50(51): 12218-12221.32 Zhao X, Tapec-Dytioco R, Tan W. Ultras

35、ensitive DNA detection using highly fluorescent bioconjugated nanoparticlesJ. Journal of the American Chemical Society, 2003, 125(38): 11474-11475. 33 Yu Z, Ohulchanskyy T Y, An P, et al. Fluorogenic, two-photon-triggered photoclick chemistry in live mammalian cellsJ. Journal of the American Chemica

36、l Society, 2013, 135(45): 16766-16769.34 Patel K, Angelos S, Dichtel W R, et al. Enzyme-responsive snap-top covered silica nanocontainersJ. Journal of the American Chemical Society, 2008, 130(8): 2382-2383.35 Chen J, Zhou S, Wen J. Disposable Strip Biosensor for Visual Detection of Hg2+ Based on Hg2

37、+-Triggered Toehold Binding and Exonuclease III-Assisted Signal AmplificationJ. Analytical chemistry, 2014, 86(6): 3108-3114.36 Huang Y F, Liu H, Xiong X, et al. Nanoparticle-Mediated IgE Receptor Aggregation and Signaling in RBL Mast CellsJ. Journal of the American Chemical Society, 2009, 131(47): 17328-17334.37 Lulu Qian, Erik Winfree, Jehoshua Bruck. Neural network computation with DNA strand displacement cascadesJ. Nature 2011, 475, 368-372.38 Lulu Qian, Eric Winfree et al.Scaling Up Digital Circuit Com