慢病毒载体介导GFP标记大鼠骨髓间充质干细胞

1、慢病毒载体介导GFP标记大鼠骨髓间充质干细胞 作者：魏峰，马爱群，王亭忠，张静【摘要】 目的 探究慢病毒载体介导绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)标记大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的理想条件,以获得稳定高表达GFP的MSCs亚群。方法 慢病毒载体介导GFP以25、50、100、200和400的感染复数(multiplicity of infection, MOI)分别作用12h和24h感染MSCs，倒置荧光显微镜及流式细胞术检测各组的感染效率和荧光强度，MTT法评价感染对MSCs增殖的影响，从而确定理想

2、的感染条件。平皿克隆套环法挑选理想条件下感染的MSCs单克隆。结果 MOI为100、200和400作用24h时，感染效率较高，分别为88.94%、99.65%、99.42%;MOI为100和200时，感染对MSCs增殖无影响，MOI为400时，感染的MSCs增殖减慢。挑选MOI为200、作用24h感染组的单克隆细胞，其1月时感染效率为99.95%，且荧光均一、强度很强。结论 MOI为200作用24h是慢病毒载体介导GFP标记MSCs的理想条件;通过细胞单克隆技术可获得稳定高表达GFP的MSCs亚群。 【关键词】 间充质干细胞;慢病毒载体;绿色荧光蛋白;单克隆ABSTRACT:Objective

3、 To determine the optimal condition for labeling rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) with green fluorescent protein (GFP)infection by lentiviral vector so as to establish a subgroup of MSCs which have a high level of GFP expression. Methods MSCs were infected with GFP by lentiviral vector

4、for 12h or 24h at different MOI (25, 50, 100, 200 and 400). The infection efficiency and fluorescence intensity were analyzed by inverted fluorescent microscopy and flow cytometry. The effect of infection at different MOI on proliferation of MSCs was evaluated by MTT. Based on those mentioned above,

5、 we could determine the optimal condition for infection. Then single cell clones of MSCs labeled with GFP under optimal condition were selected by using cloning rings. Results The efficiency of infection for 24h at MOI 100, 200 and 400 was 88.94%, 99.65% and 99.42%, respectively. The infection had n

6、o significant effect on the proliferation of MSCs infected at MOI 100 or 200, compared with MSCs without infection. However, those MSCs infected at MOI 400 proliferated slowly. The rate of GFP expression on singlecell clone of MSCs infected for 24h at MOI 200 was 99.95%, and their fluorescence inten

7、sity was strong and uniform. Conclusion Infection for 24h at MOI 200 is optimal for labeling rat bone marrow MSCs with GFP by a lentiviral vector. A subgroup of MSCs which have a stably high level of GFP expression can be obtained by single cell cloning technique.KEY WORDS: mesenchymal stem cell; le

8、ntiviral vector; green fluorescent protein; monoclone骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一种来源于中胚层具有多向分化潜能的成体干细胞，在一定条件下可分化为软骨细胞1、神经细胞2、胰岛细胞3、肺上皮细胞4等各胚层的组织细胞。目前已成为再生医学研究中的热点细胞。然而稳定高效标记MSCs是进行体内示踪研究亟待解决的关键问题。慢病毒载体介导的转基因具有效率高、外源基因长期稳定表达、安全性好5等优点。因此，我们拟通过慢病毒载体介导绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)来标

9、记大鼠骨髓MSCs，探讨其标记的理想条件，从而建立稳定高表达GFP的MSCs亚群，为体内深入研究MSCs的分化行为奠定基础。1 材料与方法1.1 材料 低糖DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium)和胎牛血清购自Gibco公司;Percolls细胞分离液(1.131g/mL)购自Pharmacia公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)均购自Sigma公司;携带GFP的慢病毒载体pGC FUGFPLV购自上海吉凯基因化学有限公司。克隆环为Corning公司生产;酶标仪为美国BioTek公司生产;流式细胞仪为美国BD公司生产。1.2 方法1.2.1

10、 大鼠骨髓MSCs的培养及表面标志鉴定 参照文献方法6，主要采用Percolls密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs，流式细胞术检测2代MSCs表面CD34、CD45、CD54、CD90的表达。1.2.2 慢病毒载体介导GFP感染MSCs 将3代MSCs制成单细胞悬液，连续计数3次，取平均值为最终细胞密度。将细胞稀释为1×104个/mL，接种于96孔板中(2个时间点，5个MOI梯度，每个梯度3个复孔，共30个孔)，每孔200L，培养16h后，各孔以25、50、100、200、400的MOI加入携带GFP的慢病毒载体，分别感染12h和24h，PBS冲洗5遍，换为不含病毒载

11、体的完全培养基继续培养，以后每天观察感染结果。1.2.3 流式细胞仪检测GFP的感染效率 将MOI为100、200、400感染24h的MSCs制成单细胞悬液，20g/L的多聚甲醛固定10min，流式细胞仪测定GFP的表达率及平均荧光强度，未感染的MSCs作为对照。1.2.4 MTT法检测感染后的MSCs增殖情况 MOI为100、200、400感染24h的MSCs和未感染的MSCs共4组，每组7孔，每孔3个复孔，每孔接种1×103个细胞。培养24h后，加入浓度为5mg/mL的MTT 20L，培养4h后弃去培养液，加入DMSO 200L，震荡培养10min，用全自动酶标仪测定波长490n

12、m处的吸光度(A值)，连续检测6d，记录A值。1.2.5 GFP标记的MSCs的克隆培养 将MOI为200作用24h感染的MSCs制成密度为10个/mL的单细胞悬液。取5mL接种至已补加DMEM和100mL/L血清的90mm培养皿中，轻轻晃动培养皿，使细胞分布均匀，置于培养箱中培养。16h后，观察标记单个细胞。约1周后，单个细胞可形成80100个细胞的克隆集落。标记生长良好、荧光强度较强且周围较大范围内无其他细胞生长的单克隆集落。弃去旧培养基，用沾有少许灭菌凡士林的克隆环准确套住标记的单克隆集落。于克隆环中消化细胞，将细胞悬液转移至预先加有完全培养基的24孔培养板中扩大培养。1.2.6 统计学

13、分析 采用 SPSS17.0统计软件进行统计处理，组间比较采用重复测量设计方差分析，组间两两比较采用Dunnettt检验，显著性水平=0.05。2 结 果2.1 MSCs的形态学特征及表面标志鉴定 第2代MSCs呈典型的成纤维细胞样形态，分布均匀(图1)，其表达CD54和CD90，不表达CD34和CD456。在整个传代培养过程中，细胞始终保持其成纤维细胞样的形态和较强的增殖能力。2.2 慢病毒载体介导GFP感染MSCs2.2.1 感染后MSCs形态变化 MOI为25、50、100、200、400作用12h及MOI为25、50、100作用24h的感染组未发现细胞死亡及细胞形态改变(图2A)。作用

14、24h，MOI为200的感染组细胞形态基本无明显改变，偶见个别细胞呈中毒样改变(图2B);MOI为400的感染组可见部分细胞死亡，一些细胞胞体皱缩，表面粗糙，有颗粒样物质沉积(图2C)。A：MOI为100，细胞形态无明显改变;B：MOI为200，细胞形态基本无改变，偶见个别细胞呈凋亡样改变;C：MOI为400，可见较多细胞死亡，部分细胞呈凋亡样改变。2.2.2 感染后MSCs中GFP的表达 感染后4d，可见较弱的绿色荧光;6d时GFP表达达到高峰，后维持在此高水平。感染后7d，MOI为25、50、100、200、400作用12h及MOI为25、50作用24h的感染组感染率相对较低，且荧光强度较

15、弱。作用24h，MOI为100的感染组感染率超过80%，MOI为200和400的感染组感染效率超过90%，且荧光强度较强(图3)。经流式细胞术分析，作用24h，MOI为100、200和400的感染组感染效率分别为88.94%(图4A)、99.65%(图4B)和98.88%(图4C)，平均荧光强度分别为194.87、818.38和586.79。2.3 GFP感染对MSCs增殖的影响 感染后16d，与未感染的MSCs(MOI为0)相比，作用24h，MOI为100和200的感染组细胞生长速度无明显变化;MOI为400的感染组细胞生长速度相对较慢，4d后生长速度则明显加快。MTT检测结果显示：各组细胞

16、在接种后24h，开始进入明显的增殖期，MOI为400的感染组，细胞增殖相对较慢，4d后生长速度明显加快(图5)。经统计学分析，MOI为400的感染组，相对未感染组细胞增殖较慢(P=0.001);MOI为100和200的感染组，相对于未感染组细胞增殖无显著性差异(P=0.285，P=0.070)。2.4 感染1月后GFP在MSCs中的表达 MOI为200作用24h的感染组感染后1月，细胞仍保持成纤维细胞样形态，GFP的表达仍维持在较高的水平，但荧光强度稍有减弱，且荧光强弱不等。经流式细胞仪检测分析，GFP的表达率为99.38%，平均荧光强度为785.32(图4D)。图4 不同感染条件及观察时间M

17、SCs的感染效率及荧光强度分析Fig.4 Analysis of infection efficiency and fluorescence intensity of MSCs infected at different MOI and time pointsA：作用24h，MOI为100感染后1周的感染效率;B：作用24h，MOI为200感染后1周的感染效率;C：作用24h，MOI为400感染后1周的感染效率;D：作用24h，MOI为200感染后1月GFP的表达;E：作用24h，MOI为200感染组单克隆细胞1月后GFP的表达。2.5 标记的MSCs单克隆细胞生长特征及其GFP的表达 将MO

18、I为200作用24h感染的MSCs以低密度均匀接种至培养皿，12h后，可见形态呈梭形的单个细胞均匀分布于培养皿中。2436h后，单个细胞开始增殖并形成第一个子代细胞，呈典型的成纤维细胞样形态(图6A)。7d左右，单个细胞可生长成60100个大小和形态一致的细胞克隆集落，其荧光均匀一致，强度很强(图6B)。1月后，经流式细胞仪检测分析，GFP的表达率为99.95%，平均荧光强度为999.49(图4E)。3 讨 论MSCs可通过分泌相关细胞因子和向心肌方向分化而改善受损的心脏功能710;同时因其具有取材方便、增殖快速、无伦理学问题等优势而成为研究心血管组织再生的热点细胞之一。对MSCs进行标记和示

19、踪是研究其在不同微环境下生物学行为的基础。我们通过慢病毒载体介导GFP标记大鼠骨髓MSCs可获得感染率高、表达稳定持久、荧光强度较强的MSCs，为进一步研究和长期观察其在体内环境下的生物学行为奠定了基础。本研究显示：不同感染条件下，MOI为200作用24h的感染组细胞形态无明显改变，其感染效率及平均荧光强度最高，分别达到99.65%和818.38;MTT分析显示此感染条件对MSCs的增殖无明显影响。故将MOI为200作用24h作为慢病毒载体介导GFP标记大鼠骨髓MSCs的理想条件。MOI为200作用24h的感染组连续体外观察1月，细胞形态未见明显改变，GFP的表达率为99.38%，平均荧光强度

20、为785.32，提示感染后1月，GFP的表达及荧光强度仍然维持在相对较高的水平。但荧光强度相比感染后1周稍有减弱，结合感染后不同时间点观察，各感染组细胞均存在荧光强弱不均一的问题。我们进一步通过细胞单克隆技术获得了MOI为200感染24h的MSCs单克隆细胞，观察1月后，其GFP的表达率为99.95%，平均荧光强度为999.49，且其荧光强弱及细胞大小形态均匀一致。因此，其可成为进一步进行体内研究所需的带有示踪标记的理想种子细胞。病毒载体介导的转基因，其感染效率随MOI值及作用时间的增加而增高，但作用时间和MOI值过高，可能会造成明显的细胞毒性。本实验中MOI为400作用24h时，即造成了明显

21、的细胞毒性;其他组未见明显细胞毒性，且感染效率随MOI值及作用时间的增加而增高，但MOI为400作用24h时，感染效率和荧光强度则低于MOI为200作用24h的感染组，可能因浓度过高引起细胞中毒、生长状态不佳所致。目前标记活细胞的方法主要有基因标记法、磁性标记法、5溴脱氧尿嘧啶(5BrdU)标记法、荧光染料标记法等。磁性标记法11适用于临床研究和大动物的实验研究，同时需要特殊仪器;5BrdU和染料DAPI、CMDiI12、CFSE13等标记细胞，标记效率高，但随时间的延长和细胞的分裂增殖，标记物会逐渐衰减消失;基因标记使用的脂质体转染适用于短时间的活细胞示踪，且转染率相对较低。本实验建立的稳定

22、高表达GFP的MSCs可为活细胞示踪特别是长时间观察其生物学行为提供了一种理想的选择。【参考文献】 1YOKOYAMA M, MIWA H, MAEDA S, et al. Influence of fetal calf serum on differentiation of mesenchymal stem cells to chondrocytes during expansion J. J Biosci Bioeng, 2008, 106(1):4650.2GRECO SJ, ZHOU C, YE JH, et al. A method to generate human mesench

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