细菌组操作规程

1、微生物检验组操作手册标本的接种与处理标准操作程序（sop-401）1.目的：规范标本的接种与处理，提高细菌检出率。2.sop-401变动程序：由操作者提出，并经科主任审核。3.范围：各种细菌培养的标本。4.溯源:全国临床检验操作规程(第二版)。5.标准操作：5.1一般细菌培养、鉴定 适用于本项检查的标本是指除血液、尿液和粪便等有特殊处理要求的标本，以及脓、痰、创面、胆汁、csf、胸腹水、咽拭子等。5.1.1样品采集与处理5.1.1.1在疾病早期或症状、体征明显时，最好在抗生素使用之前采集。5.1.1.2选择合适的解剖部位并以正确的方法和设备采集标本。5.1.1.3避免固有菌群的污染，尽可能保证

2、样本代表感染过程。5.1.1.4采集足够的数量，因标本量不足可能产生假阴性结果。5.1.1.5每个标本都要标明病人的姓名、住院号、来源、特殊部位、采集的日期时间和最初的采集者。5.1.1.6将标本放在无菌并且有利于可疑病原菌生长的容器或培养液中，防止渗漏和潜在的安全隐患，本实验室指定适用于本项检查的容器是无菌试管、无菌拭子、无菌痰杯及各种灭菌标本留取容器。 一般细菌可在合适的培养基（如血平板、巧克力平板）上，在一定的温度、气体等条件下生长繁殖而形成菌落。根据菌落特征、涂片染色镜检、生化反应和血清学试验可做出鉴定。5.2 检验流程5.2.1流程图 样品 接种 挑取可疑菌落 涂片染色镜检 生化反应

3、、鉴定 报告。 5.2.2 操作说明5.2.2.1样品 脓、痰、创面、胆汁、csf、胸腹水、咽拭等。5.2.2.2接种 血平板（痰、csf需加巧克力平板），35过夜，初次分离需5-10%co2。5.2.2.3镜检 挑取可疑菌落涂片，革兰染色镜检。5.2.2.4生化反应、鉴定 手工生化试验：5.2.2.4.1葡萄球菌：凝固酶、甘露醇、尿素、新生霉素、麦芽糖、木糖、蔗糖、硝酸盐、多粘菌素b、同时观察菌落颜色和溶血情况。5.2.2.4.2链球菌、肠球菌：触酶、七叶苷、肉汤、6.5%nacl、camp、乳糖、山梨醇、阿拉伯糖。5.2.2.4.3致病性大肠埃希菌：kia、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、甘露醇、麦

4、芽糖、imvic、硝酸盐。5.2.2.4.4变形杆菌：kia、苯丙氨酸、麦芽糖、靛基质、鸟氨酸。5.2.2.4.5灰凸菌落，典型的阴性球杆菌：kia、葡萄糖、甘露醇、靛基质、枸橼酸盐、硝酸盐、丙二酸盐、44。5.2.2.4.6革兰氏阴性杆菌，氧化酶阴性：kia、尿素、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、甘露醇、葡萄糖、imvic、硝酸盐。5.2.2.4.7革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性：kia、葡萄糖、甘露醇、靛基质、枸橼酸盐、硝酸盐、七叶苷、乙酰胺。5.2.2.4.8可疑气单胞菌，氧化酶阳性：kia、葡萄糖、甘露醇、靛基质、枸橼酸盐、硝酸盐、七叶苷、赖氨酸、蔗糖、vp（25）。5.2.2.4.9 可疑弧菌，氧

5、化酶阳性：同气单胞菌生化，另加不同浓度nacl。5.2.2.4.10缓慢生长分枝杆菌：暗产色、光产色、耐热触酶、硝酸盐、尿素、吐温-80。5.2.2.4.11快速生长分枝杆菌：45生长、暗产色、光产色、mac琼脂（28）、硝酸盐、铁吸收试验（28）、5% nacl肉汤（28）、阿拉伯糖、木糖、卫茅醇、枸橼酸盐（28）、甘露醇（28）。另见下表：一般细菌生化反应和鉴定流程菌落、涂片鉴定g球菌氧化酶、dna酶、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖或接种api nhg杆菌ox（） atb id 32gn或api 20ne或手工生化 ox（） atb id 32e或api 20e或手工生化g杆菌视情况而定g芽胞杆菌根

6、据涂片染色、菌落特征、简单手工生化反映鉴定李斯特菌、棒状杆菌api coryneg球菌触酶（） id staph或手工生化触酶（） id strep或手工生化真菌科玛嘉显色平板或atb id 32c、api 20 c aux5.2.2.5菌种鉴定 按检验流程、操作说明、生化反应、鉴定步骤中所述方法操作，将可疑菌落接种于相应的培养基或板条上，按要求培养足够时间后，手工或用计算机自动读取结果，打印报告。5.2.2.6报告 菌种名、无细菌生长或未培养出病原菌等。5.3注意事项5.3.1采样时必须注意无菌操作，须在使用抗生素前进行，并及时送检。5.3.2分离培养须接种合适的培养基，鉴定须选用适当的反应

7、或试剂条。5.3.3结果判断时须注意区别病原菌和正常菌群。正常无菌部位培养出细菌，有临床意义。有正常菌群存在部位培养出细菌，需区分是否为为正常菌群，并结合临床情况判断。授权人质量负责人部门负责人操作人员姓名郭新荣曹照明曹照明王朔、陈相日期淋病奈瑟菌培养、鉴定标准操作程序（sop-402）1.目的：规范淋病奈瑟菌培养与鉴定的操作，提高其检出率。2.sop-402变动程序：由操作者提出，并经科主任审核。3.范围：各种标本的淋病奈瑟菌培养、鉴定。4.溯源:全国临床检验操作规程(第二版)。5.标准操作5.1样品采集与处理采集原则详见sop-401中的“样品采集与处理”。 用无菌拭子插入男性尿道或女性宫

8、颈1-2 cm，旋转摩擦取上皮细胞和脓性分泌物。 淋病奈瑟菌需在营养条件较好的培养基（如淋球菌培养基、巧克力平板）上，35 5%co2环境下经24-48小时下生长，涂片染色、菌落特征、生化反应等做出鉴定。5.2检验流程5.2.1流程图 样品 接种 可疑菌落 涂片染色镜检 生化反应、鉴定 5.2.2操作说明5.2.3样品 泌尿生殖道分泌物或初段尿等。5.2.4接种 淋球菌培养基（或哥伦比亚血琼脂或巧克力平板）上，35 5-10%co2，24-48小时。5.2.5镜检 挑取氧化酶（+）可疑菌落，涂片，革兰染色，镜检观察是否为g双球菌。5.2.6生化反应、鉴定 葡（+）、麦（）、蔗（）或api nh

9、。5.2.7菌种鉴定 按检验流程、操作说明、镜检、生化反应、鉴定步骤中所述方法操作进行，手工读取结果，核对后发送报告。5.3报告 阳性或阴性，如阳性（须提示传染病报卡）。5.4注意事项 注意无菌操作，标本必须新鲜，采样后立即送检或床边接种，尿液取初段尿，泌尿生殖道取脓性分泌物，在用抗生素前采样。授权人质量负责人部门负责人操作人员姓名郭新荣曹照明曹照明王朔、陈相日期厌氧菌培养与鉴定标准操作程序（sop-403）1.目的：规范厌氧菌培养与鉴定。2.sop-403变动程序：由操作者提出，并经科主任审核。3.范围：有关厌氧菌的标本。4.溯源:全国临床检验操作规程(第二版)。5.标准操作5.1样品采集与

10、处理 采集方法详见sop-401中的“样品采集与处理”。厌氧菌在适当的培养基上，经35、厌氧环境（80%n2、10%h2、10%co2）下孵育48-72小时，经涂片染色、菌落特征、耐氧试验、生化反应等鉴定。5.2检验流程5.2.1流程图 样品 接种 镜检 生化反应、鉴定 报告。5.2.2操作说明5.2.2.1样品 深部脓肿、胸腹水、胆汁、csf离心浓缩等厌氧标本。5.2.2.2接种 于厌氧平板上，置厌氧袋中，35 48-72小时。5.2.2.3镜检 观察平板上菌落，涂片，革兰氏染色。5.2.2.4生化反应、鉴定 耐氧试验、触酶试验、api20a。5.2.2.5菌种鉴定 按检验流程、操作说明、镜

11、检、生化反应、鉴定步骤中所述方法操作进行手工读取结果，随后打印报告。5.2.2.6报告 报告菌种名或厌氧菌未生长。5.3注意事项 标本避免正常菌群污染，避免接触空气。无菌操作、标本新鲜、及时送检且在用抗菌素前采样。授权人质量负责人部门负责人操作人员姓名郭新荣曹照明曹照明王朔、陈相日期中段尿培养标准操作程序（sop-404）1.目的：规范中段尿培养操作，提高细菌检出率。2.sop-404变动程序：由操作者提出，并经科主任审核。3.范围：中段尿培养。4.溯源:全国临床检验操作规程(第二版)。5.标准操作5.1样品采集与处理 采集方法详见sop-401中的“样品采集与处理”。清洗外阴部后，无菌留取中

12、段尿。中段尿用定量接种环（1/1000ml）接种血平板和mac平板，35，18-24小时培养，细菌生长后进行菌落计数，并根据涂片染色、菌落特征和生化反应等作出鉴定。5.2检验流程5.2.1流程图 样品 接种 菌落计数 涂片染色、镜检 生化反应、鉴定。5.2.2 操作说明5.2.2.1 样品 清洁中段尿。5.2.2.2接种 用特制定量接种环（1/1000ml）沾满一环尿液，接种血琼脂平板和mac平板，5%co23518-24小时。5.2.2.3镜检 观察平板上菌落，涂片，革兰染色、镜检。5.2.2.4生化反应、鉴定 葡萄球菌、 链球菌、 革兰阴性杆菌id 32 gn板条 id 32 staph

13、rapid id 32 strep 手工生化鉴定 手工生化鉴定 手工生化鉴定5.3 结果报告5.3.1如有细菌生长，则报告“xxx细菌（xxxcfu/ml）” 菌落数×1000 每ml尿中菌落数,生长超过100个菌落时,则报告“xxx细菌>105cfu/ml）”,同时报告药敏结果。5.3.2如无细菌生长, 则报告“无细菌生长”。5.4 注意事项 无菌留取中段尿，在用抗生素前留标本，标本及时送检。细菌室收到标本1小时内处置完毕。授权人质量负责人部门负责人操作人员姓名郭新荣曹照明曹照明王朔、陈相日期血培养标准操作程序（sop-405）1.目的：规范操作、提高血培养阳性率。2.sop

14、-405变动程序：由操作者提出，并经科主任审核。3.范围：血液、胸腹水、脑脊液等液性标本细菌培养。4.溯源:全国临床检验操作规程(第二版)。5.标准程序5.1样品采集与处理 采集方法详见sop-401中的“样品采集与处理”。 bd9120是一种全自动微生物培养和监测系统，可检测120瓶培养标本。每一培养瓶底部都有特殊的感应器，当培养瓶内有微生物生长时，其释出的co2可渗透至感应器，激发荧光。通过仪器检测器进行检测。细菌生长后培养、鉴定同一般培养、鉴定，厌氧菌培养、鉴定。5.2检验流程5.2.1流程图5.2.1.1无菌采集血液等标本，无菌状态下按规定量注入培养瓶中，立即放入仪器内培养五天。5.2

15、.1.2如仪器阳性报警，则按仪器操作要求取出阳性培养瓶。5.2.1.3用无菌注射器无菌手续抽取0.5毫升阳性瓶中液体，各放一滴在血平板、巧克力平板或科玛嘉平板（按培养要求），平板无菌划线于5%co235或厌氧环境中18-24小时培养。再放一滴在玻片上涂片，革兰氏染色镜检。5.2.1.4如镜检发现细菌，则立即通知床位医生。如未发现细菌，则将培养瓶继续放入仪器中。5.2.1.5平板中细菌生长后其细菌鉴定同一般培养、鉴定及厌氧菌培养，另做药物敏感试验。5.3结果报告 菌种名称和药敏试验结果、5天培养无细菌生长。5.4注意事项5.4.1采血时期及次数对血液标本的细菌培养是否能检出病原菌的影响较大。一般

16、多在病人发热高峰前或发热后半小时采集。原则上在抗菌药物应用之前，对已用药而不能中止的病人，也应在下次用药之前采集。5.4.2如采集3-4次血液标本，其检出率可达90%以上。5.4.3采血部位：多由肘静脉采集；动脉血可由肘动脉或股动脉采集。5.4.4采血量一般以培养瓶中培养基量的1/10为宜。对于应用抗菌药物中的病人血液，以培养基量的1/20为宜。成人一次采血为5-10ml，婴幼儿为1-3ml。5.4.5抽血注意：严格消毒皮肤。严格需氧、厌氧瓶盖，瓶口的消毒。需氧、厌氧瓶口注血后应再次消毒。授权人质量负责人部门负责人操作人员姓名郭新荣曹照明曹照明王朔、陈相日期粪培养标准操作程序（sop-406）

17、1.目的：规范粪培养操作，提高病原菌检出率。2.sop-406变动程序：由操作者提出，并经科主任审核。3.范围：粪便标本。4.溯源:全国临床检验操作规程(第二版)。5.标准程序：5.1样品采集与处理采集方法同sop-401中的“样品采集与处理”。接 种 要 求适 用二号培养、副溶血弧菌碱性蛋白胨水（69h）tcbs、血平板、ss、mac水样便沙门菌、志贺菌ss平板、血平板、mac脓血便大肠埃希菌o157smac（山梨醇麦康凯平板）、血平板、ss血便致病性大肠埃希菌血平板、mac（麦康凯平板）、ss婴、幼儿腹泻 粪标本接种选择性培养基血平板、ss、mac或山梨醇麦康凯琼脂（smac），碱性蛋白胨

18、水转种tcbs、mac、血平板，35培养或增菌培养后转种培养，病原菌生长后经涂片染色、菌落特征、生化反应、血清学试验等鉴定。5.2检验流程5.2.1流程图：样品 接种 镜检 生化反应、鉴定 报告 5.2.2 操作说明5.2.2.1样品 粪便用无菌棉签采集或用carry-blair培养基留取。5.2.2.2接种5.2.2.3 镜检 观察平板上菌落，涂片，革兰氏染色5.2.2.4生化反应、鉴定 待检菌落生化反应、鉴定血清凝集志贺菌挑取无色透明菌落，乳糖（）、葡萄糖（）、产气（/）、蔗糖（）、靛基质（/）、动力（）或id 32 e志贺多价血清及单价血清凝集沙门菌挑取无色半透明或产h2s菌落，乳糖（）

19、、葡萄糖（）、产气（/）、蔗糖（）、靛基质（）、h2s（/）、动力（）或id 32 e沙门多价血清及单价血清凝集epec,eiec或etec挑取粉红色或微红色菌落，氧化酶（）、乳糖（）、葡萄糖（）、产气、h2s（）、动力（）、靛基质（）、或id 32 e（大肠埃希菌因子）epec、eiec凝集，如不凝集，测etec的ltehec挑取不发酵山梨醇的菌落（无色菌落），氧化酶（）、乳糖（）、葡萄糖（）、产气、h2s（）、动力（）、靛基质（）、或id 32 eo157：h7因子血清凝集弧菌科致病菌 tcbs上绿色菌落，氧化酶（），双糖（）蔗糖（） nacl0%3%7%10%副溶溶藻id 32 gn板条

20、霍乱诊断血清（o1+o139、o1、o139、小川型、稻叶型、彦岛型）5.3结果报告菌落报告志贺菌检出或未检出志贺菌沙门菌检出或未检出沙门菌epec、eiec或etec凝集，报告检出epec或eiec；不凝集，根据lt结果，报告检出或未检出etecehec检出或未检出ehec霍乱 提示传染病报告 菌种送疾控中心最终鉴定其它弧菌属报告检出或未检出具体菌名5.4注意事项 粪便标本多于急性腹泻及用药前采于自然排出之粪便，挑取其脓血、粘液部分2-3g，液体粪便取絮状物1-2ml，盛于灭菌容器内或置于保存液或增菌培养基中送检。排便困难的患者及婴幼儿，可用直肠拭子法采取。如不能立即送检应放入卡里布来尔（c

21、arry-blair）运送培养基中送检。授权人质量负责人部门负责人操作人员姓名郭新荣曹照明曹照明王朔、陈相日期真菌培养与鉴定标准操作程序(sop-407)1.目的：规范操作，提高真菌检出率。2.sop-407变动程序：由操作者提出，并经科主任审核。3.范围：各类标本。4.溯源:全国临床检验操作规程(第二版)。5.标准程序：5.1样品采集与处理 采集方法同sop-401中的“样品采集与处理”。 真菌在合适的培养基（如沙保氏培养基、柯玛嘉平板）上，在一定的温度条件（25、35）下生长，经过涂片染色、菌落特征、生化反应试验鉴定。5.2检验流程5.2.1流程图 样品 接种 镜检 生化反应、鉴定 报告。

22、5.2.2操作说明5.2.2.1样品 痰、创面、胆汁、csf、胸腹水、咽拭等各种标本。5.2.2.2接种 接种于科马嘉显色平板，35，48h；其他标本，如csf需培养7天，35。5.2.2.3镜检 观察平板上菌落（颜色、形状等），涂片，革兰染色5.2.2.4生化反应、鉴定 科马嘉显色平板上观察菌落颜色。菌落颜色 菌种名称 绿色 白色假丝酵母菌 紫色 光滑假丝酵母菌 蓝色 热带假丝酵母菌 粉红 克柔假丝酵母菌 其他 id 32 c5.3结果报告 菌种名或培养×天真菌未生长。5.4注意事项 在药物使用前采样，标本新鲜及时送检，采样分离接种等注意无菌操作。授权人质量负责人部门负责人操作人员

23、姓名郭新荣曹照明曹照明王朔、陈相日期支原体培养标准操作程序（sop-408）1.目的：规范操作，提高支原体培养阳性率。2.sop-408变动程序：由操作者提出，并经科主任审核。3.范围： 泌尿生殖道分泌物等。4.溯源:全国临床检验操作规程(第二版)。5.标准程序：5.1样品采集与处理 采集方法见sop-401程序中的“样品采集与处理”。 大多数支原体能利用葡糖糖或精氨酸作为能源，如肺炎支原体能发酵葡萄糖，产酸不产气，使酚红指示剂变黄。人型支原体有精氨酸脱氢酶，能使培养基中的精氨酸水解，释放出氨气，使培养基ph升高，酚红指示剂变红。解脲脲原体可利用尿素，释放出氨气，同样使培养基发生颜色变化。5.

24、2检验流程5.2.1流程图 样品 接种 生化反应、鉴定 报告5.2.2操作说明5.2.2.1样品 泌尿生殖道分泌物等。5.2.2.2接种 接种于（人型、解脲）支原体进口平板上，35 培养24h。5.2.2.3生化反应、鉴定 观察进口平板上指示剂变化（变红为阳性），同时观察药敏指示剂变化情况。5.3结果报告 ××支原体培养阳性或××支原体培养阴性。5.4注意事项 肺炎支原体检查一般可取病人痰、咽拭子、鼻咽洗液、支气管分泌物等。人型支原体、解脲脲原体检查用无菌瓶收集诊断为非淋菌尿道炎患者的中段尿。慢性前列腺炎患者按摩后的前列腺液或前段尿、不明原因不育患者的精

25、液、阴道炎与宫颈炎患者的阴道分泌物或宫颈分泌物。 授权人质量负责人部门负责人操作人员姓名郭新荣曹照明曹照明王朔、陈相日期结核分枝杆菌培养标准操作程序（sop-409）1.目的：规范操作，提高结核分枝杆菌培养阳性率。2.sop-409变动程序：由操作者提出，并经科主任审核。3.范围：痰、尿、csf、胸腹水、脓液等。4.溯源:全国临床检验操作规程(第二版)。5.标准操作：5.1样品采集与处理 采集方法详见sop-401程序中的“样品采集与处理”。 结核分枝杆菌在合适的培养基（如罗琴氏培养基等）上，经35培养4-8周，生长菌落凸起，边缘不整，奶酪色不透明的粗糙型菌落，少数呈光滑型，经涂片、抗酸染色后

26、报告。5.2检验流程5.2.1流程图 样品 接种 观察菌落 镜检 报告5.2.2操作说明5.2.2.1样品 痰、尿、csf等5.2.2.2接种 尿、脑脊液及无杂菌污染的标本，经离心沉淀后取其沉渣可直接接种在培养基上；对于混有杂菌的标本，如痰标本等必须进行前处理（4%naoh加入后振荡，37水箱放置30分钟），以达到杀死或减少杀菌和液化标本的目的，将处理后的标本接种于结核分枝杆菌培养基（罗琴氏培养基）。5.2.2.3观察菌落 每周观察1-2次，观察是否有可疑菌落生长。5.2.2.4镜检 见到可疑菌落立即涂片，经抗酸染色后明确诊断。5.3结果报告 阴性者30天发初步报告，接种后的培养基续留一个月，

27、其间发现阳性再补发报告；阳性者则为培养×天阳性，并填写传染病报告单。5.4注意事项根据感染部位不同，采集不同的标本。痰最好为清晨第一口痰，尿为清晨中、后段者或24小时尿取其沉淀约10-15ml送检。必须用消毒容器，患者应停药1-2天。痰和其他临床标本大多混有杂菌，多用酸、碱性溶液处理标本，以杀死或抑制污染杂菌的生长，同时使粘液型标本液化，而后通过沉淀达到浓缩细菌的目的。授权人质量负责人部门负责人操作人员姓名郭新荣曹照明曹照明王朔、陈相日期细菌药物敏感试验标准操作程序（sop-410）（k-b纸片琼脂扩散法）1.目的：保证向临床提供准确的细菌治疗信息。2.sop-410变动程序：由操作

28、者提出，并经科主任审核。3.范围：需氧菌和兼性厌氧菌。4.溯源:全国临床检验操作规程(第二版)。5.标准程序： 原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的m-h琼脂平板上。纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（mic）呈负相关关系，即抑菌圈愈大，mic愈小。5.1检验流程5.1.1流程图 挑取菌落 接种 贴药敏纸片 孵育 报告5.1.2操作说明5.1.2.1挑取菌落 直接从培养18-24h的平皿上挑取数

29、个纯菌落，置于在无菌生理盐水中。5.1.2.2接种 调匀菌液，用比浊仪比浊，将其浓度调至0.5麦氏单位（相当于1×108cfu/ml）。以无菌棉拭蘸取已制备的菌液，涂布于mh琼脂表面，划动三次，每次划时旋转平板60度，最后拭子沿平板内缘涂抹一周，盖上皿盖，在室温中干燥3-5分钟。5.1.2.3贴药敏纸片 以无菌镊子，将含药纸片贴于含菌琼脂表面，纸片与纸片之间不小于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm，纸片贴后不应再移动。5.1.2.4孵育 药敏纸片贴完后，室温平衡15分钟，再倒放在35（苛氧菌需5%co2）孵育箱培养16-18小时（特殊细菌需24小时）。5.2结果报告 用毫米尺量取

30、抑菌环，单位为mm。抑菌环的大小，参照nccls标准，以敏感、中度敏感和耐药形式报告。5.3质控方法 采用标准菌株，如金黄色葡萄球菌atcc25923，大肠埃希菌atcc25922和铜绿假单胞菌atcc27853等与测试菌在同一条件下做药敏试验。标准菌株的抑菌圈应落在nccls标准所示的预期范围内。如果超出该范围，则不应发出报告，及时检查原因，予以纠正。每日标准菌株的测定结果应以抑菌圈直径为纵坐标、天数为横坐标绘制室内质控图，要求每天抑菌圈变化数不得超过2mm。标准菌株应每周在mh琼脂上传代一次，4保存。5.4结果判断标准5.4.1 阳性球菌(质控菌株：金黄色葡萄球菌atcc25923)编号药

31、敏纸片简称判断标准质控范围1阿米卡星amk15162026编号药敏纸片简称判断标准质控范围2青霉素pen2926373 苯唑青霉素oxa111218244头孢唑啉czo151729355头孢克洛cec151727316头孢呋辛cxm151725317 环丙沙星cip162022308万古霉素van1517219红霉素ery1422223010克林霉素cli1520243011复方新诺明sxt1115243212磷霉素fox1315253313利福平rif1719263414替考拉宁tcl111315215.4.2 阴性杆菌(质控菌株：大肠埃希菌atcc25922)编号药敏纸片简称判断标准质控范

32、围1阿米卡星amk151619262庆大霉素gen131419263氨苄青霉素amp141616224优力新sam121419245哌拉西林pip182024306头孢唑林czo151721277头孢克洛cec151723278头孢呋辛cxm151720269头孢噻肟ctx1522293510头孢他啶caz1517253211亚安培南imp1415263212 环丙沙星cip1620304013安美汀amc1417182414舒普深cfs162015特治星tzp1820243016头孢吡肟fep1517313717美罗培南mem1415283418头孢丙稀cpr141821275.4.3非发酵

33、菌(质控菌株：铜绿假单胞菌atcc27853)编号药敏纸片简称判断标准质控范围1阿米卡星amk151618262庆大霉素gen131416213哌拉西林pip1825334头孢他啶caz151722295头孢派酮cfp162023296安曲南azt162123297亚安培南imp141520288 环丙沙星cip162025339特美汀tim15202810舒普深cfs1620编号药敏纸片简称判断标准质控范围11特治星tzp18253312头孢吡肟fep1517243013美罗培南mem141527335.4.4 肠球菌编号药敏纸片简称判断标准1庆大霉素gen792氨苄青霉素amp173 环丙

34、沙星cip16204万古霉素van15165红霉素ery14226呋喃妥因nit15167替考拉宁tcl11135.4.5链球菌编号药敏纸片简称判断范围1苯唑青霉素oxa202氨苄青霉素amp203万古霉素van174红霉素ery16205四环素tcy19226氯霉素chl18207克林霉素cli16188复方新诺明sxt16189利福平rif171810替考拉宁tcl111311左氧沙星lev14165.5注意事项5.5.1培养基的质量 对每批商品化或自配mh琼脂必须用标准质控菌株进行检测合格后方能使用。5.5.2药敏纸片的质量、含药量和保存方式均影响实验结果。5.5.3接种菌量，取决于麦氏

35、比浊管标准的配制，正确使用和保存。5.5.4试验操作质量。5.5.5孵育条件：温度和时间。5.5.6抑菌圈测定工具的精度。5.5.7质控标准菌株本身的药敏特性是否合格，有无变异。授权人质量负责人部门负责人操作人员姓名郭新荣曹照明曹照明王朔、陈相日期细菌染色的标准操作程序（sop-411）1.目的：规范细菌染色方法，提高细菌鉴定质量。2.sop-411变动程序：由操作者提出，并经科主任审核。3.范围：各类细菌。4.溯源:全国临床检验操作规程(第二版)。5.标准程序：5.1革兰氏染色法5.1.1原理： 革兰染色法的原理尚未完全清楚，目前有几种不同解释：5.1.1.1等电点学说：认为革兰阳性菌等电点

36、（ph 2-3）比革兰阴性菌等电点（ph 4-5）低，在同样ph的染色环境中，阳性菌所带的阴电荷比阴性菌多，故与带阳电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。5.1.1.2化学学说，认为革兰阳性菌含有多量核糖核酸镁盐，可与结晶紫和碘结合成大分子复合物，不易脱色；而阴性菌此物质含量甚少，故易于脱色。5.1.1.3通透性学说，认为革兰阳性菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂类含量低，酒精不易透入；革兰阴性菌细胞壁较疏松，肽聚糖层薄，外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫碘复合物被溶解提出而致脱色。5.1.2 检验流程5.1.2.1流程图 涂片 固定 染色

37、脱色复染 镜检 报告。5.1.2.2操作说明5.1.2.2.1涂片 应先取一环生理盐水于载玻片上，取少许细菌在盐水中研磨均匀，放室温下自然干燥或用远火慢慢烘干。5.1.2.2.2 固定 一般均用火焰加热法，即将已干燥的涂片在火焰中迅速通过3-4次。5.1.2.2.3染色 crystal voilet初染3-5秒，水洗；gram iodine媒染3-5秒，水洗；declorizer脱色5-10秒，水洗；safranin复染3-5秒，水洗；干后镜检5.1.2.2.4镜检 观察细菌、真菌染色性及形态。5.1.3注意事项 涂片均匀、厚薄适宜，自然干燥，经固定后染色，燃烧时间、脱色时间要掌握。5.2抗酸

38、染色法5.2.1原理： 目前认为抗酸性细菌细胞中含有分枝菌酸，能与石炭酸复红牢固结 合，而不易被脱色，故保留红色。非抗酸性细菌不含分枝菌酸，容易被盐酸酒精脱色，故复染被美蓝染成蓝色。不同抗酸性细菌所含分枝菌酸的质和量不同，所以它们的抗酸染色程度亦有差别。5.2.2检验流程5.2.2.1流程图 涂片 固定 染色脱色复染 镜检 报告。5.2.2.2操作说明5.2.2.2.1涂片 应先取一环生理盐水于载玻片上，取少许细菌在盐水中研磨均匀，放室温下自然干燥或用远火慢慢烘干。5.2.2.2.2固定 用火焰加热法。5.2.2.2.3染色 acid fast stain：用carbolfuchsin染色3-

39、5分钟，水洗；用acid alcohol脱色分钟，水洗；再用counterstain复染10-30秒，水洗，待干后镜检；潘本汉氏抗酸染色法：主要用于尿液及粪便中抗酸菌的检查。滴加石炭酸复红加温染色2分钟，倾去染液，勿水洗，滴加复染液，边滴边倾去，重复4-5次后，水洗，待干，镜检。5.2.2.2.4镜检 抗酸性菌呈红色，非抗酸性菌及细胞等均染成蓝色。结核分枝杆菌染成红色，耻垢分枝杆菌及其他细菌染成蓝色。5.2.3结果报告 找到抗酸杆菌或未找到抗酸杆菌5.2.4注意事项5.2.4.1每张载玻片只允许涂1份标本。5.2.4.2抗酸染色均勿使用染色缸；染色后印干的滤纸只能一片一张，不得重复使用；镜检时

40、每观察一份标本，均须揩拭镜头；滴加香柏油的玻璃棒不得触及标本涂面。5.2.4.3脱色时间，据证明，在检查结核分枝杆菌以稍长勿短为好。授权人质量负责人部门负责人操作人员姓名郭新荣曹照明曹照明王朔、陈相日期细菌鉴定试剂配制标准操作程序（sop-412）1.目的：最终提高细菌鉴定准确率。2.sop-412变动程序：由操作者提出，并经科主任审核。3.范围：常规细菌生化反应。4.溯源:全国临床检验操作规程(第二版)。5.标准程序5.1 柯凡克试剂： 对二甲氨基苯甲醛10g+纯戊醇150ml+纯浓盐酸50ml。5.2 甲基红试剂： 甲基红10mg+95%乙醇30ml+蒸馏水20ml。5.3 化痰剂：（1）

41、二硫苏糖醇0.1g （2）氯化钠0.78g（3）氯化钾0.02g （4）磷酸氢二钠0.112g（5）磷酸二氢钾0.02g （6）蒸馏水100ml 配制：先将2、3、4、5试剂溶于100ml蒸馏水中，高压灭菌后再加入1试剂，溶解后分装无菌瓶，每瓶约20ml，-20保存，用时置4，仅可放48小时。(也可配制成10倍浓缩液灭菌，无菌水稀释后再加入1试剂)5.4 苯丙氨酸试剂：10%fecl3 1.取2mol/lhcl 2.5ml（浓盐酸0.41ml）加水至50ml（1：20稀释）。 2.称5克fecl3加入1中加温溶解。5.5 明胶酶试剂：氯化高汞15g，浓盐酸20ml, 蒸馏水加至100ml。5.

42、6 胆汁溶菌试剂：10%胆盐。5.7 触酶试剂：3%h2o25.8 v-p试剂： 甲液：5%-萘酚：1-萘酚2.5g 2无水乙醇50ml 乙液：40%koh： 1koh40g 2蒸馏水100ml5.9 硝酸盐还原试剂： 甲液： 对氨基苯磺酸0.4g 5n醋酸50ml 乙液： -萘胺0.25g 5n醋酸50ml （5nhac：30冰醋酸+70水）5.10 革兰氏染液：5.10.1.结晶紫：4克结晶紫+95%乙醇200ml，2448小时后+1%草酸铵800ml混匀。5.10.2.碘 液：4克碘+8克碘化钾，先加500ml水，每天振摇数次，直至完全溶解+水700ml5.10.3.脱色液：95%乙醇5

43、.10.4.复染液：石碳酸复红染液（95%乙醇100ml、碱性复红4克制成饱和液，取饱和液10ml+5%石碳酸90ml，配成石碳酸复红染液）100ml+水900ml。5.11 抗酸染色试剂：5.11.1.萋尼石碳酸复红溶液：碱性复红乙醇饱和液10ml+5%石碳酸溶液90ml。5.11.2.脱色剂：浓盐酸3ml+95%乙醇97ml（奴卡氏菌、放线菌标本染色时，脱色剂改用2%硫酸水溶液）。5.11.3.复染液：美蓝乙醇饱和液30ml+10%氢氧化钾0.1ml+蒸馏水100ml。5.12 鞭毛染色试剂：5.12.1贮存液：a 5%石碳酸、b 30%鞣酸（分析纯）、c 硫酸铝钾饱和液 d 1.5%结晶

44、紫5.12.2应用液：将贮存液按比例5：2：2：1配制，用滤纸过滤2遍即可应用，一周内有效。授权人质量负责人部门负责人操作人员姓名郭新荣曹照明曹照明王朔、陈相日期培养基配制标准操作程序（sop-413）1.目的：统一配方，规范化操作，提高细菌检出率。2.sop-413变动程序：由操作者提出，并经科主任审核。3.范围：需氧菌、兼性厌氧菌。4.溯源:全国临床检验操作规程(第二版)。5.标准程序：5.1 丙二酸钠(丙二酸钠又称缩苹果酸钠) 酵母浸膏粉50mg、硫酸铵100mg、磷酸氢二钾30mg、磷酸二氢钾20mg、氯化钠100mg、丙二酸钠150mg、蒸馏水50ml、0.5%溴麝香草酚蓝0.25m

45、l。 调ph6.8，分装1.5ml/每管。5.2 普通肉汤 氯化钠2.5g、日本胨5g、牛肉粉4g、蒸馏水500ml。 调ph至7.8，分装华氏管中，高压灭菌。5.3 菌种保存管 氯化钠2.5g、牛肉粉2.5g、日本胨5g、日本琼脂3.5g、蒸馏水 500ml。 调ph至7.7，华氏管4-5ml/每管,高压灭菌。5.4 明胶和脂酶培养基 日本胨1.0g、氯化钠0.5g、cacl2·h2o0.02g、明胶0.4g、吐温801ml、琼脂1.2g、蒸馏水100ml。 调ph7.0，分装6ml/每管，高压灭菌。5.5 苯丙氨酸培养基 氯化钠0.5g、na2hpo4.12h2o0.25g、dl

46、-苯丙氨酸0.2g、酵母浸膏0.3g、日本琼脂1.0g、蒸馏水100ml。 制法：上述成份加热溶解，直接分装1.5ml/每管。如2试剂不带结晶水，则称0.1g。5.6 尿素培养基 磷酸氢二钾0.2g、磷酸二氢钾0.2g、氯化钠1.0g、蒸馏水200ml、0.02%酚红指示剂10ml。 制法：调ph6.8后各分装100ml/每三角烧瓶，高压灭菌。取回后每瓶无菌加尿素2g、95%酒精1ml、米粒大小麝香草酚半颗。 注：如用na2hpo4.12h2o则称312mg,nah2po4.2h2o则称230mg,0.3%酚红指示剂则加0.67ml。5.7 嗜血杆菌基础培养基 氯化钠2.5克、日本胨5.0克、

47、牛肉粉2.5克、酵母浸膏2.5克、琼脂5.0克、蒸馏水500毫升、氯化血红素15毫克、调ph7.8后高压灭菌。5.7.1分离细菌用：上面基础加nad一支（7.5mg/支）+万古霉素1.0ml(25mg/ml)， 倾注小平皿约50个。5.7.2药敏试验用：上面基础只加nad一支，倾注大平皿约20个。5.8 甘露醇半固体培养基 日本胨1.0g、氯化钠0.5g、牛肉粉0.5g、甘露醇1.0g、日本琼脂0.3g、蒸馏水100ml、1%酸性复红1ml。 制法：将琼脂加热溶化后，加入1-4试剂再加热溶解，调ph7.8,加指示剂混合后分装1.5ml/康氏管，高压灭菌，4备用。5.9 糖发酵管培养基 日本胨0.5g、氯化钠0.5g、蒸馏水100ml、1.6%溴甲酚紫0.1ml。 制法：1-3试剂加热溶解后加4试剂，调ph7.6，每瓶加入一种糖，使其最终浓度为1%。溶化后分装1.3ml/康氏管（葡萄糖管内放一小倒管），管塞上涂上颜色（葡红、乳黄、麦蓝、甘白、蔗黑），12p 20min。5.10 氨基酸培养基 日本胨0.5g、葡萄糖0.1g、酵母浸膏0.3g、蒸馏水100ml、1.6%溴甲酚0.1ml、氨基酸0.5g。 制法：将1-4混合加热溶解后加5，然后加6，调ph6.76.8。分装0.81.0ml/康氏管,并同时分装对照管（不加氨基酸），封液体石蜡油。5.11