09维生素类药物的分析 第八章维生素类药物的分析

1、第十章 维生素类药物的分析维生素是维持人体正常生理机能所必需的生物活性物质。如果人体缺少某种维生素，会引起维生素缺乏症，而影响人体的正常生理机能。如：人体缺少VA，夜盲症.人体缺少VC，坏血病.对维生素类药物的分类，目前仍按它们的溶解性质分：脂溶性维生素：A、D、E、K等水溶性维生素：B族（B1、B2等）、烟酸、叶酸、泛酸、抗坏血酸等本章中，重点介绍维生素A的分析，其次，对维生素E、维生素B1、维生素C的分析作一简单介绍。第一节 脂溶性维生素类药物的分析一、 维生素A的分析(一) 化学结构与性质1、化学结构R=H VA醇VA1R= COCH3 VA醋酸酯R= COC15H31 VA棕榈酸酯维生

2、素A的结构是一个具有共轭多烯侧链的环己烯，且侧链上的所有双键都为全反式的2、性质（1）具有UV吸收。（2）存在多种立体异构化合物在维生素A的侧连上一共有4个双键，所以，从理论上说，应该有 种异构体。目前，包括维生素A在内，总共发现有6种异构体。它们是：名 称顺反异构lmax(nm)相对效价新维生素Aa2-顺式32875%新维生素Ab4-顺31924%新维生素Ac2,4-二顺31115%异维生素Aa6-顺32321%异维生素Ab2,6-二顺32424%维生素A全反式325328100%新维生素Aa新维生素Ab新维生素Ac异维生素Aa异维生素Ab维生素A（3）不稳定性:a：易被氧化维生素A的分子中

3、具有共轭多烯的侧链的结构，因此其性质活泼，易被氧化：维生素A的氧化产物：环氧化物 or 维生素A醛维生素A酸b：易发生脱氢、脱水、聚合反应维生素A2去氢维生素A去氢维生素A的生物效价仅为维生素A1的40%，lmax345350nm维生素A3去水维生素A去水维生素A的效价也低于维生素A1，lmax385390nm鲸醇维生素A醇的二聚体，没有生物活性。（4）溶解性：不溶于水，易溶于乙醚、氯仿、异丙醇、环己烷、脂肪和油等(二) 鉴别试验（Carr-Price反应）1、三氯化锑反应2、紫外吸收光谱3、TLC(三) 含量测定1、紫外分光光度法三点校正法维生素A的含量测定，过去曾用SbCl3比色法。但由于

4、SbCl3比色法呈色极不稳定，测定结果受水份、温度影响较大，反应专属性差，目前已被紫外分光光度法所替代。但由于SbCl3比色法操作简便、快速，所以目前对食品或饲料中维生素A的测定仍常用SbCl3比色法。(1) 概述由于在维生素A的分子中具有共轭多烯的结构，所以具有特征的紫外吸收。可以用紫外分光光度法测定维生素A的含量。但是，由于在维生素A中，有很多结构相似的相关物质，这些相关物质在维生素A的最大吸收波长附近也有吸收（相关物质产生的吸收叫不相关吸收），这些吸收对测定有影响。为了消除不相关吸收的影响，准确测出维生素A的含量，Morton和Stubbs等人提出了一个校正公式三点校正法，用来测定维生素

5、A的含量。(2) 三点校正法的原理（根据、假定）三点校正法是在两个假设的前提下建立起来的。即物质对光的吸收具有加和性，即： 维生素A中的不相关吸收在310340nm范围内可看作是直线, 且随 波长的增大吸收度减小(3) 三个波长的选择方法l1：维生素A的lmaxl2、l3：分别在l1两侧第一法：等波长差法l2、l3分别在l1两侧12nm处：测定对象 VitA醋酸酯第二法：等吸收度法(皂化法)l1=325nm; l2 =310nm; l3=334nm测定对象 VitA醇（4）第一法（适用于酯式维生素A的测定） 操作方法测定波长吸光度吸光度比值吸光度比值差计算值规定值3000.5553160.90

6、7(326)3281.000(330)3400.8113600.299这个方法要求最大吸收波长在326329nm之间，所以，为了确定最大吸收波长的位置，还要测定326及330nm处的吸光度。 计算方法最大吸收波长位置的确认。如果，则lmax在326329nm范围内，这时可以继续计算。如果，则lmax不在326329nm范围内，这时不能用第一法测定，而要用第二法测定。计算吸光度比及比值差均不超过±0.02，则以测定的A328计算含量。任何一个值大于±0.02，需计算A328（校正）。计算校正吸光度. 计算标示量%1900：维生素A醋酸酯的换算因数 换算因数定义：单位数值所相当

7、的效价。1IU0.344mg全反式维生素A醋酸酯药名VA醋酸酯溶剂环己烷max328E1530 计算公式的推导 （5）第二法 等吸收度法(皂化法、6/7法) 操作在300，310，325和334nm处测定Ai。 第一法无法消除杂质干扰时用此法，适用于维生素A醇 计算方法 由于1IUº0.300mg的全反式维生素A醇，所以1g维生素A醇就相当于 维生素A醇溶剂：异丙醇中 lmax： 325nm：1820练习题：维生素AD胶丸中维生素A的含量测定已知：平均胶丸重为0.0815g维生素A的标示量为10000IU/丸取样：测定数据如下表波长吸收度比值规定值比值差3000.3740.5740.

8、5550.0193160.5840.8960.907-0.013280.6521103400.5340.8190.8110.0083600.2110.3390.2990.04求：维生素A的标示百分含量。2、三氯化锑比色法(1) 原理：max 618nm620nm，标准曲线法(2) 注意事项 操作要迅速，加入SbCl3后5s10s内测定 无水介质 T（测样）- T（绘标）±1ºC 非VA专属反应，干扰物质常使测定结果偏高。二、维生素E的分析(一) 化学结构与性质(1) VE是苯并二氢吡喃衍生物，苯环上(C6位)有一个乙酰化的酚羟基，在酸性或碱性溶液中加热易水解成游离生育酚，亦

9、被氧化剂氧化成醌型化合物。(2) 具有苯环结构，有紫外吸收，无水乙醇中最大吸收279、285nm。(3) 有3个不对称C原子，具有旋光性.(二) 鉴别1、取本品10mg，加10ml 无水乙醇，加硝酸2ml，振摇，75加热15分钟，出现鲜红色,逐渐转为橙红色。2、取本品10mg,加醇制KOH 2ml, 煮沸5分钟,使水解生成游离生育酚,加水4ml, 乙醚10ml, 分取醚层.加联吡啶乙醇液和三氯化铁乙醇液数滴,出现深红色.3、UV法(三) 特殊杂质检查检查游离生育酚取本品0.10g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液1滴，用硫酸铈液(0.01mol/L)滴定，消耗硫酸铈液(0.01mol/L)

10、不得过 1.0ml。（限度< 2.15%）【原理】 【试剂】滴定剂：硫酸铈滴定液(0.01mol/L)指示剂：二苯胺（亮黄灰紫）(四) 含量测定1、气相色谱法(1) 色谱条件及系统适用性试验：色谱柱：硼硅玻璃柱,内装硅藻土固定相：2% 硅酮(OV-17)载气：氮气内标：正三十二烷检测器：FID（氢火焰离子化检测器）理论塔板数按VE峰计算应不低于500，VE峰与内标物峰的分离度应大于2。(2) 溶液配制：内标溶液：正三十二烷的环己烷液(1.0mg/ml)对照溶液：对照品溶于内标溶液中(2mg/ml)样品溶液：样品溶于内标溶液中(2mg/ml)(3) 计算：mg=F×AX×

11、;MS/AS(4) 特点：简便快速，专属性强,适用于VE、VE制剂及多种维生素制剂中VE的测定；需要特殊仪器。(5) 例1：内标液的配制：取正三十二烷加正己烷溶解并稀释成1.0mg/ml溶液对照液的配制：精密称取VitE对照品0.2011g 置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内标液10ml，密塞，振摇使溶解，取13ul注入GC仪，测定，计算。供试液的配制：精密称取供试品0.1998g置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内标液 10ml，密塞，振摇使溶解，取13ul 注入GC仪，测定，计算。 对照液： 供试液：例2：称维生素E片10片，总重为1.4906g，研细，称取0.2980g，用1.0mg/ml的内标溶

12、液10ml溶解，用气相色谱法测定。已知进样量为3ml，校正因子为1.96，供试品的峰面积为159616，内标物的峰面积为167840，标示量为10mg/片，求供试品占标示量的百分含量（93.24%） 2、铈量法(1) 原理：VE用硫酸加热回流，水解成生育酚，用硫酸铈定量的氧化为对-生育醌，过量的硫酸铈氧化二苯胺指示剂而指示终点（亮黄灰紫）。需做空白试验。(2) 反应条件 在硫酸条件下水解为宜.碱性下易被氧化。 硫酸铈溶于酸水溶液，不溶于醇，生育酚溶于醇而不溶于水，滴定过程中应有一定浓度的乙醇。 适用于纯度高的供试品。第二节 水溶性维生素类药物的分析一、 维生素B1的分析(一) 化学结构与性质1

13、、结构：维生素B1是由氨基嘧啶和噻唑环通过次甲基连接而成的季铵化合物。2、性质： 溶解性：易溶于水，水溶液呈酸性。 UV：max = 246nm 硫胺显碱性在硫胺的分子中具有两个碱性基团：一个是噻唑环上的季铵；另一个是嘧啶环上的氨基。所以，硫胺可以和酸成盐。 沉淀反应：维生素B1分子中的含氮杂环，能够和生物碱沉淀试剂反应产生沉淀。如：维生素B1与硅钨酸反应可生成组成一定的沉淀，利用这个反应可以用重量法测定维生素B1的含量。 硫色素反应维生素B1分子中的噻唑环在碱性条件下可被铁氰化钾K3Fe(CN)6等一些氧化剂氧化后，与嘧啶环上的氨基缩合成具有荧光的硫色素。 加碱分解后与醋酸铅反应维生素B1与

14、NaOH试液一起加热，分解产生NaS，可与PbAc2反应生成PbS的黑色沉淀。 维生素B1的水溶液显氯化物的特征反应。(二) 鉴别试验硫色素荧光反应这个反应是维生素B1的专属反应，可用于维生素B1的鉴别和含量测定。(三) 含量测定维生素B1的含量测定方法有：非水滴定法（ChP所用方法）硅钨酸重量法银量法硫色素荧光法紫外分光光度法比色法络合滴定法(1). 非水滴定法 原理:VB1分子中含有已成盐的伯胺和季铵基团,在非水溶液中,在醋酸汞存在下,均可被高氯酸滴定. 方法: 溶剂:冰醋酸 指示剂:喹哪定红-亚甲蓝 滴定剂:高氯酸 醋酸汞 终点:天蓝色 空白试验(2). 硅钨酸重量法: 原理：VB1在酸

15、性溶液中与硅钨酸作用产生沉淀,根据沉淀的重量和供试品的重量即可计算其含量.2VB1+ 硅钨酸 白色沉淀 +4HCl 测定方法 计算 换算因数：1g沉淀相当于被测物质的质量（g） 实验条件A: 取样量应在50mg左右,不得少于25mg。B: 硅钨酸的用量与VB1的量为8:1。C: 加入盐酸使沉淀易于过滤.酸量不足沉淀颗粒过细。D: 干燥温度80，以保证沉淀含4个结晶水，换算因数为0.1939。E: 硅钨酸的加入速度用滴管一滴一滴加入。防止沉淀表面吸附的杂质来不及离开而被沉淀包围F: 煮沸时间25min为宜使沉淀颗粒大，利于过滤洗涤。G: 沉淀的洗涤用热稀盐酸洗涤，洗涤液用量不得多于50ml，否则

16、，沉淀会部分溶解。二、 维生素C的分析1 化学结构结构特点： 维生素C分子中具有2个手性C原子，所以具有4种光学异构体。其中生理活性最强的是L（+）抗坏血酸。 L(+)-抗坏血酸D(-)-抗坏血酸D(-)-异抗坏血酸L(+)-异抗坏血酸 具有内酯结构。碱性下可水解。 具有烯二醇基。烯二醇基具有很强的还原性，能够被一些氧化剂氧化成去氢抗坏血酸。2 性质与鉴别试验 酸性由于维生素C的分子中具有烯二醇的结构，所以维生素C酸性。C3上的羟基，由于受共轭效应的影响，酸性较强，pKa=4.17C2上的羟基，由于邻位羰基的影响，酸性较弱，pKa=11.57所以抗坏血酸一般表现为一元酸，能与NaHCO3作用生

17、成钠盐。 还原性维生素C分子中的烯二醇基，具有很强的还原性，能够被很多氧化剂氧化成二酮基。 如： 水解反应L-二酮古罗糖酸(无生物活性) 荧光反应 糖的性质维生素C的结构很象糖结构，所以维生素C还具有糖的性质。（略）3 含量测定 碘量法a. 原理这个反应的摩尔比是12。b. 操作终点颜色：无色蓝色0.1mol/L碘液1mlº8.806mg的C6H8O6（维生素C）c. 讨论反应条件这个反应是在酸性下进行的。在酸性条件下，可以使维生素C受空气中氧的氧化速度减慢。溶剂用新沸放冷的水作溶剂。用新沸放冷的水作溶剂是为了减少水中溶解氧的影响。还原性物质的影响及排除维生素C的注射液中常加有亚硫酸

18、盐如NaHSO3作为抗氧剂，抗氧剂NaHSO3对测定维生素C的含量有影响。排除方法：在滴定前加入丙酮或甲醛，使之与NaHSO3生成无还原性的加成物。+2,6-二氯吲哚酚滴定法原理：2,6-二氯吲哚酚是一个染料，在酸性下它的氧化型是红色的还原型是无色的所以，在酸性下可以直接用2,6-二氯吲哚酚滴定，用滴定剂自身的颜色变化指示终点，不需要另外的指示剂。+氧化型（红色）还原型（无色）所以，终点的颜色是溶液由无色变为红色。存在着赛车手从四川省网得分vrgr存在着赛车手从四川省网得分vrgr存在着赛车手从四川省网得分vrgr存在着赛车手从四川省网得分vrgr存在着赛车手从四川省网得分vrgr存在着赛车手

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