盲管和生物指示剂安装对在线湿热灭菌工艺的影响研究

1、摘要研究背景：因为饱和蒸汽能在较短时间内有效杀死微生物及芽胞体，所以被广泛用 于灭菌工艺中。目前，蒸汽灭菌多集中于通过湿热灭菌柜对产品、材料和设备灭菌。 但是，由于尺寸和结构的限制，大量的工艺设备无法使用灭菌柜灭菌，而整个系统 的在线灭菌可以将无菌操作（如连接）的工作大幅降低甚至消除，所以被越来越广 泛的使用。本系统在对无菌灌装罐的在线灭菌测试过程中，位于无菌气体过滤器进气口的 生物指示剂挑战性实验失败。 研究目的：本文希望通过研究，找到位于无菌气体过滤器进气口的生物指示剂挑战 性实验失败的根本原因。 研究方法：本文首先通过因果分析法（鱼骨图分析法）对各层别类别找出所有可能 原因（因素）并选取

2、重要因素, 再综合重要因素进行试验设计，最后实施试验，根据 实验结果对上述重要因素进行论证。 研究结果：通过因果分析法确定了盲管和生物指示剂的安装对湿热在线灭菌工艺造 成了重要的影响。通过实验设计及其实施验证了因果分析法（鱼骨图分析法）的结 论。研究结论：无菌过滤器入口处的三通是比较敏感的区域，生物指示剂的安装使其成 为关键的位置。在日常生产过程中，不会安装生物指示剂，这样就不会阻碍蒸汽的 流通和冷凝水的排净，因此这一敏感区域就会很好的被灭菌。虽然在过滤器前端的 灭菌效果不会破坏罐内的无菌状态，但是为了增加无菌保障，作为改进措施，会在 进气口的手动阀门前增加连通管，以确保手动阀门的灭菌效果。关

3、键词：在线灭菌；湿热；生物指示剂；F 值；DT 值Effect of Dead Leg and Bio Indicator Installation on Moist Heat Sterilization in Place ProcessBackground: because the microorganisms and spores can be killed effectively in a short time by saturated water steam, it is widely used in the sterilization process. Currently, stea

4、m sterilization is more concentrated in products, materials and equipment sterilization by autoclave. However, due to the limitation of size and structure, a large number of process equipment cannot be sterilized by autoclave. “Sterilization in place” can reduce or even eliminate the aseptic operati

5、on for the entire system, so it is used more and more widely. During the sterilization in place test for aseptic filling tank, the bio-indicator challenge test positioned at the inlet of an aseptic air filter failed.Purpose: this paper aims, through research, to find the root cause for the failed bi

6、o-indicator challenging test at the inlet of an aseptic air filterMethod: firstly, find out all possible causes (factors) and select the important factors by causal analysis (fishbone analysis), and then integrate all the important factors in the experiment design, and finally execute the experiment

7、 and demonstrate the important factors by experimental results.Result: through causal analysis (fishbone analysis), it is determined that the dead leg and bio-indicator installation have important effect on “moist heat sterilization in place” process. This conclusion is verified by the experiment de

8、sign and execution.Conclusion: The tee joint is a sensitive area, and it becomes a man-made critical place with BI installed. During routine production, bio-indicator is not installed and will not for sure block this sensitive area (for both the steam flow and the condensate removal). This sensitive

9、 area can be fully sterilized. Although the sterilizing effect of the inlet of a filter does not destroy the sterile state of the tank, as an improvement action to increase the sterility assurance, , a communicating pipe will be mounted before the manual valve of the inlet to ensure the sterilizatio

10、n effect of the manual valve.Keywords: Sterilization in Place, Moist Heat, Bio Indicator, F-value, DT-value目录第 1 章 背景介绍11.1 灭菌法概述211.2 灭菌方法介绍221.2.1 湿热灭菌法21.2.2 干热灭菌法31.2.3 辐射灭菌法31.2.4 气体灭菌法41.2.5 过滤除菌法51.3 无菌生产工艺61.4 湿热灭菌详述61.4.1 湿热灭菌的影响因素71.4.2 灭菌模式及相关参数71.4.3 灭菌指示剂91.4.4 热力学和蒸汽质量101.4.5 灭菌程序121.5

11、 因果分析法(鱼骨图分析法)10131.5.1 鱼骨图定义141.5.2 鱼骨图的三种类型141.5.3 鱼骨图制作141.5.4 鱼骨图使用步骤151.6 选题意义和目的15第 2 章 利用因果分析法（鱼骨图分析法）进行分析172.1 人员172.1.1 生物指示剂安装影响172.1.2 检测人员污染182.1.3 测试人员污染182.2 机器182.2.1 管路及阀门安装错误182.2.2 软管连接段为盲管182.3 环境192.3.1 破碎的生物指示剂污染了环境192.3.2 测试环境降级为不受控环境192.3.3 空调系统正在做烟雾实验192.3.4 微生物测试环境受到污染192.4

12、方法192.4.1 修改后的测试条件太严格192.5 材料212.5.1 生物指示剂影响了冷凝水的排出212.5.2 生物指示剂菌落数量差异212.6 测试222.6.1 在线灭菌系统的温度和压力探头检测数据不可靠222.6.2 测试仪器的温度和压力探头监测数据不可靠222.7 分析结果总结22第 3 章 实验设计、实施和结果分析233.1 实验设计233.1.1 监测仪器和试验试剂233.1.2 实验安排233.2 试验实施和结果分析253.2.1 试验实施和独立结果分析：253.2.2 五次试验比较分析：28第 4 章 实验结论324.1 瓶装生物指示剂的安装影响分析324.2 验证结果对

13、日常生产的影响分析324.3 盲管对验证及生产的影响分析324.4 测试条件的影响分析32第 5 章 实验讨论345.1 讨论一345.2 讨论二34第 1 章 背景介绍1.1 灭菌法概述2灭菌法系指用适当的物理或化学手段将物品中活的微生物杀灭或除去，从而使 物品残存活微生物的概率下降至预期的无菌保证水平的方法。本法适用于制剂、原 料、辅料及医疗器械等物品的灭菌。无菌物品是指物品中不含任何活的微生物。对于任何一批灭菌物品而言，绝对 无菌既无法保证也无法用试验来证实。一批物品的无菌特性只能相对地通过物品中 活微生物的概率低至某个可接受的水平来表述，即无菌保证水平(Sterility assura

14、nce level，简称SAL)。实际生产过程中，灭菌是指将物品中污染微生物的概率下降至预 期的无菌保证水平。最终灭菌的物品微生物存活概率，即无菌保证水平不得高于10-6。 已灭菌物品达到的无菌保证水平可通过验证确定。灭菌产物品的无菌保证不能依赖 于最终产品的无菌检验，而是取决于生产过程中采用合格的灭菌工艺、严格的GMP 管理和良好的无菌保证体系。灭菌工艺的确定应综合考虑被灭菌物品的性质、灭菌 方法的有效性和经济性、灭菌后物品的完整性和稳定性等因素。灭菌程序的验证是无菌保证的必要条件。灭菌程序经验证后，方可交付正式使 用。验证内容包括：(1) 撰写验证方案及制定评估标准。(2) 确认灭菌设备技

15、术资料齐全、安装正确，并能处于正常运行（安装确认）。(3) 确认灭菌设备、关键控制和记录系统能在规定的参数范围内正常运行（运行确 认）。(4) 采用被灭菌物品或模拟物品按预定灭菌程序进行重复试验，确认各关键工艺参数 符合预定标准，确定经灭菌物品的无菌保证水平符合规定（性能确认）。(5) 汇总并完善各种文件和记录，撰写验证报告。 日常生产中，应对灭菌程序的运行情况进行监控，确认关键参数（如温度、压力、时间、湿度、灭菌气体浓度及吸收的辐照剂量等）均在验证确定的范围内。灭 菌程序应定期进行再验证。当灭菌设备或程序发生变更（包括灭菌物品装载方式和 数量的改变）时，应进行再验证。物品的无菌保证水平与灭菌

16、工艺、灭菌前物品被污染的程度及污染菌的特性相关。因此，应根据灭菌工艺的特点制定灭菌物品灭菌 前的微生物污染水平及污染菌的耐受性限度并进行监控，并在生产的各个环节采取 各种措施降低污染，确保微生物污染控制在规定的限度内。灭菌的冷却阶段，应采 取措施防止已灭菌物品被再次污染。任何情况下，都应要求容器及其密封系统确保 物品在有效期内符合无菌要求。1.2 灭菌方法介绍2常用的灭菌方法有湿热灭菌法、干热灭菌法、辐射灭菌法、气体灭菌法和过滤 除菌法。可根据被灭菌物品的特性采用种或多种方法组合灭菌。只要物品允许， 应尽可能选用最终灭菌法灭菌。若物品不适合采用最终灭菌法，可选用过滤除菌法 或无菌生产工艺达到无

17、菌保证要求，只要可能，应对非最终灭菌的物品作补充性灭 菌处理(如流通蒸汽灭菌)。1.2.1湿热灭菌法本法系指将物品置于灭菌柜内利用高压饱和蒸汽、过热水喷淋等手段使微生物 菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。该法灭菌能力强，为热力灭 菌中最有效、应用最广泛的灭菌方法。药品、容器、培养基、无菌衣、胶塞以及其 他遇高温和潮湿不发生变化或损坏的物品，均可采用本法灭菌。流通蒸汽不能有效 杀灭细菌孢子，一般可作为不耐热无菌产品的辅助灭菌手段。湿热灭菌条件的选择应考虑灭菌物品的热稳定性、热穿透力、微生物污染程度 等因数。湿热灭菌条件通常采用 121×15min、121×30m

18、in 或 116×40min 的程 序，也可采用其他温度和时间参数，但无论采用何种灭菌温度和时间参数，都必须 证明所采用的灭菌工艺和监控措施在 日常运行过程中能确保物品灭菌后的 SAL10-6。当灭菌程序的选定采用 F值概念时（F值系当采用非 121的灭菌条件 时，该灭菌程序致死微生物的效果与 121的灭菌效果相同，在 121下的灭菌时间）， 应采取特别措施来确保灭菌物品能得到足够的无菌保证，此时，除对灭菌程序进行 验证外，还必须在生产过程中对微生物进行监控，证明污染的微生物指标低于设定 的限度。对热稳定的物品，灭菌工艺可首选过度杀灭法，以保证灭菌物品获得足够 的无菌保证值。对热不稳

19、定性物品，其灭菌工艺的确定依赖于在一定的时间内，一定的生产批次的灭菌物品灭菌前微生物污染的水平及其耐热性污染的情况。因此， 日常生产全过程应对产品中污染的微生物进行连续地、严格地监控，并采取各种措 施降低物品微生物污染水平，特别是防止耐热菌的污染。热不稳定性产品的 F值一 般不低于 8 分钟。采用湿热灭菌，被灭菌物品应有适当的装载方式，不能排列过密， 以保证灭菌的有效性和均一性。湿热灭菌法应确认灭菌柜在不同装载时可能存在的 冷点。当用生物指示剂进一步确认灭菌效果时，应将其置于冷点处。本法常用的生 物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus stearothermoph

20、ilus)。1.2.2 干热灭菌法本法系指将物品置于干热灭菌柜、隧道灭菌器等设备中、利用干热空气达到杀 灭微生物或消除热原物质的方法。适用于耐高温但不宜用湿热灭菌法灭菌物品的灭 菌，如玻璃器具、金属制容器、纤维制品、固体试药、液状石蜡等均可采用本法灭 菌。干热灭菌条件一般为 160170×120min 以上、170180×60min 以上或 250×45min 以上，也可采用其他温度和时间参数。无论采用何种灭菌条件，应保 证灭菌后的产品的 SAL10-6。采用干热过度杀灭的物品一般无需进行灭菌前污染微 生物的测定。250×45min 的干热灭菌也可除去无

21、菌产品包装容器及有关生产灌装 用具中的热原物质。采用干热灭菌时，被灭菌物品应有适当的装载方式，不能排列 过密，以保证灭菌的有效性和均一性。干热灭菌法应确认灭菌柜中的温度分布符合 设定的标准及确定最冷点位置等。常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子（Spores of Bacillus subtilis）。细菌内毒 素灭活验证试验是证明除热原过程有效性的试验。一般将不小于1000单位的细菌内 毒素加入待去热原的物品中，证明该去热原工艺能使内毒素至少下降3个对数单位。 细菌内毒素灭活验证试验所用的细菌内毒素一般为大肠杆菌内毒素（Eacherichia coli endoxin）。1.2.3辐射灭菌法本

22、法系指将灭菌物品置于适宜放射源辐射的射线或适宜的电子加速器发生的 电子束中进行电离辐射而达到杀灭微生物的方法。本法最常用的为60Co-射线辐射 灭菌。医疗器械、容器、生产辅助用品、不受辐射破坏的原料药及成品等均可用本法灭菌。采用辐射灭菌法灭菌的无菌物品其SAL 应10-6。射线辐射灭菌所控制的 参数主要是辐射剂量(指灭菌物品的吸收剂量)。该剂量的制定应考虑灭菌物品的适应 性及可能污染的微生物最大数量及最强抗辐射力，所使用的剂量事先应验证不影响 被灭菌物品的安全性、有效性及稳定性。常用的辐射灭菌吸收剂量为25kGy。对最终 产品、原料药、某些医疗器材应尽可能采用低辐射剂量灭菌。灭菌前，应对被灭菌

23、 物品微生物污染的数量和抗辐射强度进行测定，以评价灭菌过程赋予该灭菌物品的 无菌保证水平。对于已设定的剂量，应定期审核，以验证其有效性。灭菌时，应采 用适当的化学或物理方法对灭菌物品吸收的辐射剂量进行监控，以充分证实灭菌物 品吸收的剂量是在规定的限度内。如采用与灭菌物品一起被辐射的放射性剂量计， 剂量计要置于规定的部位。在初安装时剂量计应用标准源进行校正，并定期进行再 校正。60Co-射线辐射灭菌法常用的生物指示剂为短小芽孢杆菌孢子（Spores of Bacillus pumilus）1.2.4气体灭菌法本法系指用化学消毒剂形成的气体杀灭微生物的方法。常用的化学消毒剂为环 氧乙烷、气态过氧化

24、氢、甲醛、臭氧(O3)等，本法适用于在气体中稳定的物品灭菌。 采用气体灭菌法时，应注意灭菌气体的可燃可爆性、致畸性和残留毒性。本法中最 常用的气体是环氧乙烷，一般与8090的惰性气体混合使用，在充有灭菌气体 的高压腔室内进行。该法可用于医疗器械，塑料制品等不能采用高温灭菌的物品灭 菌。含氯的物品及能吸附环氧乙烷的物品则不宜使用。采用环氧乙烷灭菌时，灭菌 柜内的温度、湿度、灭菌气体浓度、灭菌时间是影响灭菌效果的重要因数。可采用 下列灭菌条件：温度 (54±10) 相对湿度 (60±10) 灭菌压力 8×105Pa 灭菌时间 90min灭菌条件应予验证。灭菌时，将灭菌

25、腔室先抽成真空，然后通入蒸汽使腔室内 达到设定的温湿度平衡的额定值，再通入经过滤和预热的环氧乙烷气体。灭菌过程 中，应严密监控腔室的温度、湿度、压力、环氧乙烷浓度及灭菌时间。必要时使用生物指示剂监控灭菌效果。本法灭菌程序的控制具有一定难度，整个灭菌过程应在 技术熟练人员的监督下进行。灭菌后，应采取新鲜空气置换，使残留环氧乙烷和其 他易挥发性残渣消散。并对灭菌物品中的环氧乙烷残留物和反应产物进行监控，以 证明其不超过规定的浓度，避免产生毒性。采用环氧乙烷灭菌时，应进行泄漏试验， 以确认灭菌腔室的密闭性。灭菌程序确认时，还应考虑物品包装材料和灭菌腔室中 物品的排列方式对灭菌气体的扩散和渗透的影响。

26、生物指示剂一般采用枯草芽孢杆 菌孢子（Spores of Bacillussubtilis）。1.2.5过滤除菌法本法系利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理以除去气体或液体中微生物的方 法。常用于气体、热不稳定的药品溶液或原料的除菌。除菌过滤器采用孔径分布均 匀的微孔滤膜作过滤材料，微孔滤膜分亲水性和疏水性两种。滤膜材质依过滤物品 的性质及过滤目的而定。药品生产中采用的除菌滤膜孔径一般不超过0.22m。过滤 器的孔径定义来自过滤器对微生物的截留，而非平均孔径的分布系数。所以，用于 最终除菌的过滤器必须选择具有截流实验证明的除菌级过滤器。过滤器对滤液的吸 附不得影响药品质量，不得有纤维脱落，禁用含

27、石棉的过滤器。过滤器的使用者应 了解滤液过滤过程中的析出物性质、数量并评估其毒性影响。滤器和滤膜在使用前 应进行洁净处理，并用高压蒸汽进行灭菌或作在线灭菌。更换品种和批次应先清洗 滤器，再更换滤芯或滤膜或直接更换滤器。过滤过程中无菌保证与过滤液体的初始 生物负荷及过滤器的对数下降值LRV（Log reduction value）有关。LRV 系指规定条 件下，被过滤液体过滤前的微生物数量与过滤后的微生物数量比的常对数值。即： LRV=IgN0LgN式中N0 为产品除菌前的微生物数量。N 为产品除菌后的微生物数量。LRV 用于表示过滤器的过滤除菌效率，对孔径为022m 的过滤器而言，要求每1cm

28、2 有效过滤面积的LRV 应不小于7。因此过滤除菌时，被过滤产品总的污染量应控制 在规定的限度内。为保证过滤除菌效果，可使用两个除菌级的过滤器串连过滤，或 在灌装前用过滤器进行再次过滤。在过滤除菌中，一般无法对全过程中过滤器的关 键参数(滤膜孔径的大小及分布，滤膜的完整性及LRV)进行监控。因此，在每一次过滤除菌前后均应作滤器的完整性试验，即气泡点试验或压力维持试验或气体扩散流 量试验，确认滤膜在除菌过滤过程中的有效性和完整性。完整性的测试标准来自于 相关细菌截留实验数据。除菌过滤器的使用时间应进行验证，一般不应超过一个工 作日。过滤除菌法常用的生物指示剂为缺陷假单胞菌(Pseudomonas

29、 diminuta)。通过 过滤除菌法达到无菌的产品应严密监控其生产环境的洁净度，应在无菌环境下进行 过滤操作。相关的设备、包装容器、塞子及其他物品应采用适当的方法进行灭菌， 并防止再污染。1.3 无菌生产工艺无菌生产工艺系指必须在无菌控制条件下生产无菌制剂的方法。无菌制剂的生 产通常分为最终灭菌工艺和无菌生产工艺。采用最终灭菌工艺的产品常见的包括大 容量注射剂和小容量注射剂等；采用无菌生产工艺的产品常见的包括无菌灌装制剂、 无菌分装粉针剂和冻干粉针等。无菌生产工艺应严密监控其生产环境的洁净度，并 应在无菌控制的环境下进行过滤操作。相关的设备、包装容器、塞子及其他物品应 采用适当的方法进行灭菌

30、，并防止被再次污染。无菌生产工艺过程的无菌保证应通 过培养基无菌灌装摸拟试验验证。在生产过程中，应严密监控生产环境的无菌空气 质量、操作人员的素质、各物品的无菌性。无菌生产工艺应定期进行验证，包括对 环境空气过滤系统有效性验证及培养基模拟灌装试验。1.4 湿热灭菌详述在中国药典收载的灭菌方法中，湿热灭菌是这些灭菌方法中使用最广泛的一种。 它系指物质在灭菌器内利用高压蒸汽或其他热力学灭菌手段杀灭细菌，具有穿透力 强，传导快，灭菌能力甚强，为热力学灭菌中最有效及用途最广的方法。由于蒸汽湿热灭菌本身具备无残留，不污染环境，不破坏产品表面，容易控制 和重现性好等优点，被广泛应用于最终灭菌药品（尤其是注

31、射剂）的除菌过程中。 湿热灭菌的原理是使微生物的蛋白质及核酸变性导致其死亡。这种变性首先是 分子中的氢键分裂，当氢键断裂时，蛋白质及核酸内部结构被破坏，进而丧失了原 有功能。蛋白质及核酸的这种变性可以是可逆的，也可以是不可逆的。虽然微生物 功能性结构被破坏，若氢键破裂的数量未达到微生物死亡的临界值，则其分子很可能回复到它原有的形式，微生物就没有被杀死。为有效地使蛋白质变性，就需要水 蒸气有足够的温度和持续时间，这对灭菌效果十分重要。高温饱和水蒸气可迅速使 蛋白质变性，在规定操作条件下，蛋白质发生变性的过程即微生物死亡的过程，是 可预见和重复的。1.4.1 湿热灭菌的影响因素1.4.1.1灭菌物

32、中微生物的种类和数量不同的微生物耐热性相差很大，微生物处于不同的发育阶段，所需灭菌的温度 与时间也不相同。根据一级动力学反应规律，最初微生物的数量越少，所需要的灭 菌时间越短。1.4.1.2灭菌溶液的pH值微生物的存活能力因介质的酸碱度差别而不同。一般微生物在中性溶液中耐热 性最大，在碱性溶液中次之，酸性介质最不利于微生物的生长发育。如pH为68时不 宜杀灭，pH小于6时，微生物容易被杀灭。1.4.1.3灭菌物的性质溶液中若含有营养物质如糖类、氨基酸等，会对微生物有营养保护作用，并增 强其耐热性。1.4.1.4蒸汽的饱和度饱和蒸汽的穿透性比过热蒸汽、干热空气的穿透性强很多，而蒸汽冷凝时会将 释

33、放的大量潜热传递给被灭菌物，使微生物被杀灭，因此尽可能使用饱和蒸汽进行 灭菌。1.4.2灭菌模式及相关参数微生物的灭活符合一级动力学方程，微生物死亡速率是微生物耐热参数D和杀灭 时间的函数。即在给定的时间下被灭活的微生物与仍然存活数成正比。LgNt=lgN0 - F(T, Z)/DTNt：t分钟后微生物计数值； N0：初始后微生物计数值；DT：一定温度下的微生物降低一个对数单位所需要的时间（单位：分钟）；F(T,Z)：灭菌程序在确定温度系数 Z 的 T 温度的等效灭菌时间。1.4.2.1 耐热参数（DT）湿热灭菌中，在规定的灭菌条件（如T）下，使生物指示剂的数量下降一个对 数单位，或杀灭90%

34、所需的时间。严格说来，DT值并不是任何一种微生物的遗传特 性。当用一级动力学存活曲线模式来描述生物指示剂对某一灭菌剂的耐受特性时， 才获得DT的经验数值。1.4.2.2 温度系数（Z值）孢子耐热性随温度变化而变化的特性可用Z来表示。Z值是DT值变更一个对数单 位时，温度需调节的度数。它类似于半对数模式中的温度系数。在比较不同温度下 对孢子的灭菌率时，需要用Z来计算F 值。例如，生物指示剂挑战系统的Z=8，即温度每变化8，DT值将会改变一个对 数单位。如果生物指示剂挑战系统的D121为1.6 分钟，那么D129即为0.16 分钟， D113为16.0 分钟。湿热灭菌通常总设定在一个小的温度范围以

35、内，例如110-135 之间，因此，在实际使用中，通常将经验测试值Z看作一个常量。常规灭菌程序设计 和评估中Z取10。在对比平衡灭菌赋予产品的物理杀灭时间和生物杀灭时间F值的 试验中，必须使用实际的生物指示剂的Z值来计算物理杀灭时间FT。1.4.2.3 灭菌率（Lethal Rate）灭菌率是一个指数函数，因此，很小的温度变化就会对灭菌率产生明显的影响。 例如，一个Z=10的生物指示剂系统中，温度降低1，会使灭菌率减少大约20%。 这可采用以下方法计算：L=10(120-121)/10=10-0.1=0.79因此，Z值=10的生物指示剂系统，如以灭菌率来表示的话，120下灭菌1分钟相 当于12

36、1下灭菌0.79分钟。1.4.2.4 累计杀灭时间（lethality，F）F值是一个灭菌程序杀灭时间的量度。F(Tref, Z)是参照温度TRef和温度系数Z下以灭 菌率计算，被灭菌物品获得的等效灭菌时间。由物理数据（时间和温度）计算得到F 值也可以F物理来表示。F值是整个灭菌程序中灭菌率的积分值。说得实际一点，这 个积分值是通过对梯形模式的数字累计而得：FTref=d(L)式中： d=每次温度读数之间的间隔时间 L=经计算的各个温度下的灭菌率F0是指蒸汽灭菌程序赋予一个容器或产品121下的标准灭菌时间。计算中，Z 取10。计算F0所用的参照温度是121.1。例如，一个F0为8分钟的程序，不

37、管被灭 菌物品/产品的实际温度和时间是多少，灭菌程序的效力-标准灭菌时间都是8分钟。FBiological（FBIO）生物杀灭力表示生物指示剂系统测得的实际杀灭效果（以T等 效灭菌时间表示）。FBIO可由以下等式计算得到：FBIO=DT×LR式中：DT = 参照温度下生物指示剂的DT值LR= 灭菌程序使生物指示剂下降的对数单位1.4.3 灭菌指示剂灭菌指示剂有多种，它们有不同的设计形式，可用于灭菌程序的开发、确认和监 控。下面将介绍灭菌指示剂的种类和应用方式。1.4.3.1 生物指示剂（BIs）生物指示剂以其死亡所遵循的具有可预见性对数规则为基础，来确定并记录微 生物存活概率的合格标

38、准。生物指示剂的选定，取决于所用的灭菌方法和所选择的 灭菌程序。因为生物指示剂是确定杀灭效果的关键材料，因此，生物指示剂应当具 有可预测性和重现性。在过度杀灭程序的确认过程中，最常采用生物指示剂是嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus，以前的名称为Bacillus stearothermophilus）；也可 采用其他对湿热灭菌耐热性强的微生物。在采用生物负载程序的确认过程中，典型 的生物指示剂包括：Clostridum sporogenes（生梭芽孢杆菌）、Bacillus smithii（史密 氏杆菌，以前叫做凝结芽孢杆菌）和Bacillus sub

39、tilis（枯草芽孢杆菌5230）。所选用生物指示剂的数量应比产品或物品的生物负载高，耐热性应比生物负载 强。只能采用芽孢来做蒸汽灭菌程序的挑战性试验。这些孢子必须达到一定的纯度（基本没有生长态菌、微小的残骸和团块），有确定的耐热特性，其母代菌株应该从公认的菌种库购买。1.4.3.2 化学监测器化学监测系统是对一个或多个关键灭菌参数有响应的装置。它们可作为定性指 示剂，证明一个产品已灭过菌了。如对化学指示剂的反应作了定量化处理，它们还 可用来回答更为复杂的问题。不管它们的设计形式如何，在湿热灭菌程序的验证中， 化学监测系统不能代替生物指示剂和温度/压力/时间的物理测试。1.4.4 热力学和蒸汽

40、质量了解热力学（thermo-dynamics）基础对湿热灭菌的设计和控制是很有必要的。 在一定温度下，不同加热介质的内能有很大差别。过热水、饱和蒸汽、蒸汽/空气混 合物含有的热能是不同的。在日常生产的灭菌程序中，必须达到在灭菌程序设计中 确定的饱和蒸汽温度和压力之间的严格关系，以保证灭菌的效果。以下将阐述灭菌 程序具体参数的重要性。1.4.4.1 温度和热量温度是热能的度量。热量是物体及其周围环境之间因温差而发生能量转移的结 果。应当理解，在同一温度下，不同加热介质（如饱和蒸汽、空气、蒸汽混合物或 过热水）所含的热能差异极大。蒸发/冷凝是饱和蒸汽灭菌中热能传递给被灭菌品的主要的手段。1 克1

41、00的饱 和蒸汽含有2,675 焦/克的能量。这是100的水所含能量（419 焦耳/克）和蒸发所需 热能（2,256焦耳/克）或蒸汽冷凝释放热量之和。在100时，1 克蒸汽冷凝时，可 将2,256 焦耳的热量传递给物体。相关数据可以在美国机械工程师学会（ASME）的网站获得。应检查任何饱和蒸 汽灭菌程序的压力和温度，以保证数值与蒸汽表中基本一致。如果不一致，就可能 表示灭菌过程中，饱和蒸汽冷凝的热效应没有完全发挥作用。此情况下，传递的能 量会少于计算得到的能量。1.4.4.2 蒸汽湿热灭菌可采用多种蒸汽，它包括但不局限于工厂蒸汽、生产用蒸汽和纯蒸汽。 工厂蒸汽指一般的工业蒸汽，将生产的工业蒸汽

42、分配并应用于各种能量转移，如设施、水和生产中加热，或者驱动发动机或涡轮机。对于湿热灭菌而言，如果腔室中的蒸汽并非来自夹套，则通常认为灭菌器的夹套可采用工厂蒸汽。在过热水灭 菌方法中，工厂蒸汽也用于热交换器非洁净的一侧加热过热水。工艺蒸汽和工业蒸汽相类似，所不同的是，工艺蒸汽的源水不得加入有挥发性 添加剂（胺或肼）。当容器已经完成灌封，需灭菌时，可用工艺蒸汽对液体产品作 湿热灭菌。纯蒸汽（有时叫做洁净蒸汽或高质量蒸汽）的冷凝水须符合药典注射用水要求（WFI）。纯净蒸汽主要通过特定设计的纯蒸汽发生器生产，或用多效蒸馏水机的第 一个柱生产，多效蒸馏水机的供水应采用符合化学质量要求的水。药典中规定的软

43、 水、去离子水和纯化水，均可生产纯蒸汽。为系统的正常运行，需要注意对蒸汽分 配系统作适当设计、安装及蒸汽疏水阀和排气口的维修保养。要避免冷凝水的累积。 多孔/固体物品的灭菌，始终应采用纯净蒸汽。1.4.4.3 纯蒸汽质量的测试饱和蒸汽灭菌的半对数模式有一个假设，即饱和蒸汽中没有不凝性气体以及过 热现象。湿蒸汽、过热蒸汽和含有不凝性气体的蒸汽，对多孔/固体物品程序的灭菌 率有潜在的不良影响。蒸汽的质量对饱和蒸汽灭菌中灭菌率L 影响的大小，取决于 蒸汽质量偏离理想蒸汽状态的程度以及装载中被灭菌品的类型。对于多孔/固体物品的灭菌而言，由于灭菌器的供汽属确认的内容，应按公司内 部的确认方针或按照适用的

44、法规要求，对灭菌器供汽的质量特性定期、重复地进行 测试及评估。测试项目包括：不凝性气体，干燥度和干燥值，过热 不凝性气体：不凝性气体是蒸汽发生器生产的蒸汽中可能夹带的气体。这些不凝性气体（比如空气、氮气和二氧化碳）是蒸汽从纯的、汽相状态的水成为蒸汽和 气体的混合物。干燥度：蒸汽的干燥度与它的潜热密切相关。潜热水平在50%的蒸汽，其干燥度 为0.5，表示混合物中水和蒸汽的比例为50:50。因此，只有蒸汽是百分之百时，它才 是干蒸汽，其干燥度为1.0.干燥值：蒸汽的干燥值是饱和蒸汽灭菌程序所用蒸汽中携带液相水量的测试值。 干燥值为0表示有100%的水，干燥值为1.0表示不含液相水的干燥蒸汽。干燥值

45、小于 1.0的蒸汽所含的能量会明显小于纯的饱和蒸汽。过热：过热蒸汽是指在任何给定压力下，高于水蒸发平衡曲线所示温度的蒸汽。 过热蒸汽对微生物的灭菌率小于该温度下的预期的灭菌率。造成过热的主要原因有 两点。第一，在使用点附近的压力下降。第二，灭菌器夹套的温度高与腔体的温度。1.4.5 灭菌程序对于湿热灭菌来说，有两种常用的灭种程序：饱和蒸汽灭菌程序和空气加压灭 菌程序。饱和蒸汽灭菌程序通常用于多孔/坚硬物品，而空气加压灭菌程序通常用于 液体产品。下面对这两种灭菌程序作一概述。1.4.5.1 饱和蒸汽灭菌程序饱和蒸汽灭菌程序主要有两种类型：预真空和重力置换。 饱和蒸汽最常见的灭菌程序是预真空程序。

46、该程序是在灭菌阶段开始之前通过机械真空泵或蒸汽喷射器将空气从腔室中抽走。预真空程序尤其适用于可以包藏或夹 带空气的装载物，比如软管、过滤器和灌装机部件。在制药行业中，脉动真空程序 常用于难以去除空气的多孔/坚硬装载的灭菌。灭菌程序开始之前，对装载的处理是 很重要的。如果每次抽真空至0.1个大气压，那么每个脉冲将使灭菌器内的空气减少 90%或者1 个对数单位。三次脉冲（抽真空-充蒸汽）可获得3 个对数单位的下降值， 有效地将空气去除了99.9%。为了使装载处于正常状态，可能另需正压脉冲（充蒸汽 至高于大气压，以避免空气进入腔室）。通过这个方法，提高去除空气的效率，这 样平衡时间就会缩短。在制定灭

47、菌程序时，要准确地确定脉冲的次数和类型。典型的重力置换程序建立在如下理论基础上：腔室中的冷空气比进入的蒸汽重， 因而将下沉到腔室的底部。蒸汽进入灭菌器腔室迫使空气从腔室底部的排水管排出（和冷凝水一起通过蒸汽疏水阀排出）。排除空气成功与否取决于疏水阀的正确运 行和适当的蒸汽分布。蒸汽通过导流板或散流器（例如多孔管）注入灭菌器腔室。 如果蒸汽进得过快或分布不合理，装载的顶部或周围可能会夹带空气层。如果进汽 过于缓慢，空气受热而扩散入蒸汽中，从而使排除空气更加困难。重力置换灭菌器 排除空气的效率低于其他设计形式的灭菌器，但是，对于在线灭菌工艺来说，通常 采用此程序。当然，工艺上对于进汽速率和方式就要

48、求的更为严格。1.4.5.2 空气加压程序空气加压的灭菌程序通常包括两种：蒸汽-空气混合物程序和过热水灭菌程序。所采用的空气为无油压缩空气，根据工艺的要求，可能会在管路中安装除菌过滤器。 当蒸汽中加入空气，从而产生一个高于一定温度下饱和蒸汽压的压力时，这种灭菌程序即称为蒸汽-空气混合物的灭菌程序。尽管加入空气是必要的，与饱和蒸汽 灭菌相比，它的热传递速率低。通常采用风扇来使蒸汽-空气混合物循环。蒸汽-空气 混合物程序在灭菌后，可以使用多种方法来冷却产品。最常用的方法是向灭菌器夹 套或盘管通冷却水，保持空气循环冷却。有些蒸汽-空气灭菌器通过在产品上方的喷 淋冷却水使其降温。过热水灭菌程序是用过热

49、水循环来灭菌已灌封容器的很有效的方法。最常用的 方法是通过泵将水从灭菌器底部（被灭菌品下方）打入喷淋球，不断喷淋和循环。 另一种循环过热水灭菌法是将产品完全浸没在水中灭菌。所有这类过热水循环的灭 菌程序都使用空气加压。在灭菌过程中，空气的加压是可以控制的。加压的最低值 由以下因素决定：采用的温度；保持产品期望特性所需的压力；及保持循环泵正常 运行所需的压力。过热水灭菌所用水的微生物水平是最重要的质量特性。水可以在 腔室中和装载一起灭菌；在单独的容器中灭菌，保持高的水温；或者通过化学处理， 来保持所要求的低的微生物水平。水循环为最终灭菌产品提供了有效的冷却方法， 因而提高了灭菌器的效率。1.5

50、因果分析法(鱼骨图分析法)10因果分析法(Causal Factor Analysis，CFA) 是通过因果图表现出来，因果图又称 特性要因图、鱼骨图或石川图。它是 1953 年在日本川琦制铁公司，由质量管理专家 石川馨最早使用的，是为了寻找产生某种质量问题的原因，发动大家谈看法，做分 析，将群众的意见反映在一张图上，就是因果图。用此图分析产生问题的原因，便 于集思广益。因为这种图反映的因果关系直观、醒目、条例分明，用起来比较方便， 效果好，所以得到了许多企业的重视。使用该法首先要分清因果地位；其次要注意 因果对应，任何结果由一定的原因引起，一定的原因产生一定的结果。因果常是相 互对应的，不能

51、混淆；最后，要循因导果，执果索因，从不同的方向用不同的思维 方式去进行因果分析，这也有利于发展多向性思维。1.5.1 鱼骨图定义问题的特性总是受到一些因素的影响，我们通过头脑风暴找出这些因素， 并将它们与特性值一起，按相互关联性整理而成的层次分明、条理清楚，并标 出重要因素的图形就叫特性要因图。因其形状如鱼骨，所以又叫鱼骨图(以下称 鱼骨图)，它是一种透过现象看本质的分析方法。同时鱼骨图也用在生产中来形 象地表示生产车间的流程。1.5.2 鱼骨图的三种类型鱼骨图基本结构1. 整理问题型鱼骨图(各要素与特性值间不存在原因关系，而是结构构成关系， 对问题进行结构化整理)2. 原因型鱼骨图(鱼头在右

52、，特性值通常以“为什么”来写)3. 对策型鱼骨图(鱼头在左，特性值通常以“如何提高/改善”来写)1.5.3 鱼骨图制作制作鱼骨图分两个步骤：分析问题原因/结构、绘制鱼骨图。1. 分析问题原因/结构。 A、针对问题点，选择层别方法（如人机料法环测量等）。 B、按头脑风暴分别对各层别类别找出所有可能原因（因素）。 C、将找出的各要素进行归类、整理，明确其从属关系。 D、分析选取重要因素。 E、检查各要素的描述方法，确保语法简明、意思明确。分析要点：a、确定大要因（大骨）时，现场作业一般从“人机料法环测”着手,管理类问题一 般从“人事时地物”层别，应视具体情况决定；b、大要因必须用中性词描述（不说明

53、好坏），中、小要因必须使用价值判断（如不良）；c、脑力激荡时，应尽可能多而全地找出所有可能原因，而不仅限于自己能完全掌控或正在执行的内容。对人的原因，宜从行动而非思想态度面着手分析；d、中要因跟特性值、小要因跟中要因间有直接的原因-问题关系，小要因应分析 至可以直接下对策；e、如果某种原因可同时归属于两种或两种以上因素，请以关联性最强者为准（必 要时考虑三现主义：即现时到现场看现物，通过相对条件的比较，找出相关性最强 的要因归类。）f、 选取重要原因时，不要超过 7 项，且应标识在最未端原因；2. 鱼骨图绘图过程 A、填写鱼头（按为什么不好的方式描述），画出主骨 B、画出大骨，填写大要因 C、

54、画出中骨、小骨，填写中小要因 D、用特殊符号标识重要因素要点：绘图时，应保证大骨与主骨成 60 度夹角，中骨与主骨平行1.5.4 鱼骨图使用步骤1. 查找要解决的问题；2. 把问题写在鱼骨的头上；3. 召集同事共同讨论问题出现的可能原因，尽可能多地找出问题；4. 把相同的问题分组，在鱼骨上标出；5. 根据不同问题征求大家的意见，总结出正确的原因；6. 拿出任何一个问题，研究为什么会产生这样的问题？7. 针对问题的答案再问为什么？这样至少深入五个层次（连续问五个问题）；8. 当深入到第五个层次后，认为无法继续进行时，列出这些问题的原因，而后列出至少 20 个解决方法。1.6 选题意义和目的由于尺

55、寸和结构的限制，大量的工艺设备无法使用灭菌柜灭菌，而整个系统的 在线灭菌可以将无菌操作（如连接）的工作大幅降低甚至消除，如配液罐和充填管 线的灭菌等。本论文所述的在线灭菌系统用于不同规格灌装罐的灭菌。该在线灭菌系统的设 计中，几乎在每一个低点处和支管末端均设计了排空口和疏水阀，并对灌装罐和管 路进行了良好的坡度设计，以确保蒸汽容易供应到各个使用点，并且及时排走空气 和蒸汽冷凝产生的冷凝水（见图1-1）。对于灭菌后的容器，通入除菌过滤的无油压 缩空气，清除系统残留的湿气，同时保持系统在使用前处于正压的保护状态。图 1-1其 SIP 工艺流程为：准备阶段泄漏测试升温阶段灭菌阶段干燥阶段加 压阶段结

56、束程序（见图 1-2）。图 1-2在对无菌灌装罐的灭菌测试过程中，位于无菌气体过滤器进气口的生物指示剂挑战性实验失败（见图 1-3）。图 1-3第 2 章 利用因果分析法（鱼骨图分析法）进行分析2.1 人员2.1.1 生物指示剂安装影响无菌过滤器作为灌装罐的一部分,是被反向灭菌的。洁净蒸汽通过插底管进入灌 装罐，一方面通过罐底的冷凝水排放口进行灭菌，另一方面通过无菌过滤器的出气 口进入滤芯内部，穿透滤芯对其进行灭菌，穿透滤芯的蒸汽一部分从顶部的冷凝水 排放口排出，另一部分进入无菌过滤器的进气口，沿着冷凝水排放口排出。挑战性 实验失败的生物指示剂正是处于这样一个离洁净蒸汽源最远，同时又是排出灭菌过 程中产生冷凝水的位置，所以这也是该位置被选择为最差条件的原因。因为此区域 空间狭小，生物指示剂的安装位置会影响到整个灭菌过程冷凝水的排出，从而增加 灭菌失败的风险。更为关键的是，因为空间狭小，最初的生物指示剂安装位置可能 会在接下来管路连接过程中发生变化。所以，这一原因被划分为高可能性。2.1.2检测人员污染发现生物指示剂失败的同时，实验室人员已经展开了实验室调查，分别从人、 机、料、法、环、测六个方面进行分析，因不在本论文讨论范围之内，所以不进行 赘述。调查结果显示生物指示剂失败并不是由实验室检测