《新编免疫组化》ppt课件

1、免疫细胞组织化学技术免疫细胞组织化学技术病理教研室病理教研室金晓明金晓明主要讲述内容：主要讲述内容：第一部分第一部分 免疫细胞化学的实际根免疫细胞化学的实际根底底第二部分第二部分 免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术第三部分第三部分 免疫酶细胞化学技术免疫酶细胞化学技术第四部分第四部分 免疫电子显微镜技术免疫电子显微镜技术第一部分第一部分 免疫细胞化学的实际根底免疫细胞化学的实际根底 免疫细胞化学是免疫学与细胞免疫细胞化学是免疫学与细胞化学相结合的一个分支学科，以免化学相结合的一个分支学科，以免疫学的抗原抗体反响为其实际根底。疫学的抗原抗体反响为其实际根底。第一节第一节 抗原抗原antig

2、enantigen一、抗原的概念一、抗原的概念 是一类在适宜的条件下，能激是一类在适宜的条件下，能激发机体免疫系统发生免疫应对，并能发机体免疫系统发生免疫应对，并能与免疫应对产生的效应物质在体内和与免疫应对产生的效应物质在体内和/ /或体外发生特异性结合反响的物质。或体外发生特异性结合反响的物质。抗原的性能：免疫原性抗原的性能：免疫原性 产生免疫应对产生免疫应对 反响原性反响原性 产生特异性反响产生特异性反响二、抗原决议簇二、抗原决议簇 是与相应抗体或淋巴细胞抗原识别受体相结是与相应抗体或淋巴细胞抗原识别受体相结合的部位，是决议和控制抗原特异性的特殊化学合的部位，是决议和控制抗原特异性的特殊化

3、学基团。基团。类型：功能性抗原决议簇类型：功能性抗原决议簇 隐蔽性抗原决议簇隐蔽性抗原决议簇 免疫优势决议簇免疫优势决议簇 线性或延续性决议簇线性或延续性决议簇 构象决议簇或不延续性决议簇构象决议簇或不延续性决议簇B 细胞所识别的是半抗原决议簇；细胞所识别的是半抗原决议簇；T细胞所识别的细胞所识别的是免疫原性决议簇或延续性决议簇。是免疫原性决议簇或延续性决议簇。三、抗原的性质与种类三、抗原的性质与种类一抗原的性质一抗原的性质1、抗原的异物性、抗原的异物性 机体能对进入体内的异种、异体的大分子物质机体能对进入体内的异种、异体的大分子物质产生免疫应对。该物质与机体的种系关系愈远，其产生免疫应对。该

4、物质与机体的种系关系愈远，其免疫原性愈强，机体的免疫反响也更强。免疫原性愈强，机体的免疫反响也更强。本身抗原；本身抗体本身抗原；本身抗体2、大分子胶体、大分子胶体 作为抗原，分子愈大，其免疫原性愈强作为抗原，分子愈大，其免疫原性愈强 3、抗原的特异性、抗原的特异性 各种抗原物质各有其特异的抗原决议簇，即一各种抗原物质各有其特异的抗原决议簇，即一种抗体只能与相应的抗原起反响而不能与其它抗原种抗体只能与相应的抗原起反响而不能与其它抗原反响。反响。二抗原的种类方法二抗原的种类方法 分类根据分类根据 种类种类单独存在时能否有免疫原性单独存在时能否有免疫原性 半抗原和完全半抗原和完全抗原抗原抗原来源抗原

5、来源 外源性抗原和外源性抗原和内源性抗原内源性抗原抗原与宿主关系抗原与宿主关系 异种抗原，同异种抗原，同种异体抗原，本身抗原种异体抗原，本身抗原B细胞产生抗体时能否需求细胞产生抗体时能否需求T细胞辅助细胞辅助 胸腺依赖抗原，胸腺依赖抗原，胸腺非依赖抗原胸腺非依赖抗原化学物质化学物质 蛋白质，多糖，蛋白质，多糖，脂蛋白，脂多糖，糖蛋白，脂蛋白，脂多糖，糖蛋白， 核酸等核酸等物理形状物理形状 颗粒性抗原，颗粒性抗原，可溶性抗原可溶性抗原产生方式产生方式 天然抗原，人天然抗原，人工合成抗原，基因工程抗原工合成抗原，基因工程抗原抗原特异性程度抗原特异性程度 特异性抗原，特异性抗原，共同抗原共同抗原完全

6、抗原：同时具有免疫原性和反响原性的物质。完全抗原：同时具有免疫原性和反响原性的物质。不完全抗原或半抗原：无免疫原性。不完全抗原或半抗原：无免疫原性。第二节第二节 抗体抗体antibodyantibody一、抗体的概念一、抗体的概念 机体遭到抗原刺激后，经过体液机体遭到抗原刺激后，经过体液免疫应对，免疫应对，B B淋巴细胞活化、增殖、分淋巴细胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反响的球蛋白。仅与该抗原发生特异性反响的球蛋白。二、抗体的性质和种类二、抗体的性质和种类一抗体的普通性质一抗体的普通性质 免疫球蛋白约等于抗体，分五类：免疫球

7、蛋白约等于抗体，分五类：IgG,IgM,IgA,IgD,IgEIgG,IgM,IgA,IgD,IgE二免疫原性和分类特性二免疫原性和分类特性 免疫球蛋白都是大分子蛋白质，具有免疫原性，课作为免疫球蛋白都是大分子蛋白质，具有免疫原性，课作为抗原。由于存在着轻链和重链，可变区和稳定区，因此，抗原。由于存在着轻链和重链，可变区和稳定区，因此，分子构造差别较大，免疫原性比较复杂。分子构造差别较大，免疫原性比较复杂。三抗体的种类三抗体的种类1、根据抗体的途径或来源不同分为、根据抗体的途径或来源不同分为免疫抗体；天然抗体；本身抗体免疫抗体；天然抗体；本身抗体2、根据抗原抗体在试管内能否出现肉眼反响分为、根

8、据抗原抗体在试管内能否出现肉眼反响分为完全抗体；不完全抗体完全抗体；不完全抗体三、抗原与抗体反响三、抗原与抗体反响 称为免疫学反响。称为免疫学反响。在体内进展称为免疫反响；在体外称为血清学反在体内进展称为免疫反响；在体外称为血清学反响响四、抗体构成的机制四、抗体构成的机制一免疫应对的产生一免疫应对的产生1、感应阶段识别及加工处置抗原阶段、感应阶段识别及加工处置抗原阶段2、反响阶段淋巴细胞增殖分化阶段、反响阶段淋巴细胞增殖分化阶段3、效应阶段发生免疫反响阶段、效应阶段发生免疫反响阶段二影响抗体产生的要素二影响抗体产生的要素1、抗原的质和量、抗原的质和量2、机体方面、机体方面3、佐剂的加强免疫作用

9、、佐剂的加强免疫作用第三节第三节 有关根本技术方法有关根本技术方法一、抗体的制备一、抗体的制备一抗体的制备方法一抗体的制备方法 能制备出具有很高特异性和敏感能制备出具有很高特异性和敏感性的高效价多克隆和单克隆抗体。性的高效价多克隆和单克隆抗体。1.1.多克隆抗体血清抗体：指机体接受抗原自动免疫或被动多克隆抗体血清抗体：指机体接受抗原自动免疫或被动免疫后从血清中分别提纯的抗体。免疫后从血清中分别提纯的抗体。2.2.单克隆抗体：是单克隆抗体：是19751975年由年由Kohlenh MilsteinKohlenh Milstein发明的一种新技发明的一种新技术。其原理是将体外培育的骨髓细胞和免疫的

10、脾细胞相交融，术。其原理是将体外培育的骨髓细胞和免疫的脾细胞相交融，产生杂交细胞。这种交融的杂交细胞既有骨髓细胞的无限生长产生杂交细胞。这种交融的杂交细胞既有骨髓细胞的无限生长才干，又有浆细胞分泌单一抗体的才干。将该免疫细胞纯化，才干，又有浆细胞分泌单一抗体的才干。将该免疫细胞纯化，成为单克隆系，就能产生大量专注的高纯度的抗体，即单克隆成为单克隆系，就能产生大量专注的高纯度的抗体，即单克隆抗体抗体monoclonal antibody, McAb)monoclonal antibody, McAb)单克隆抗体与多克隆抗体特性的比较单克隆抗体与多克隆抗体特性的比较 特性特性 多克隆多克隆 单克隆

11、单克隆组成组成 多种类抗体的混合物多种类抗体的混合物 单一种类的抗体单一种类的抗体 特异性特异性 低低 高高 针对多个抗原决议族针对多个抗原决议族 针对单一的抗原决议族针对单一的抗原决议族亲和力亲和力 平均亲和力较高平均亲和力较高 不定，较低不定，较低交叉反响交叉反响 高高 低低二抗体的配制方法二抗体的配制方法1、抗体储存、抗体储存2、抗体运用液的配制、抗体运用液的配制二、组织资料的处置二、组织资料的处置 尽量保管好抗原性不丧失、不分散、不被破尽量保管好抗原性不丧失、不分散、不被破坏坏三、免疫染色三、免疫染色1、加强特异性染色方法、加强特异性染色方法蛋白酶消化法；适宜的抗体稀释度；温育时间蛋白

12、酶消化法；适宜的抗体稀释度；温育时间2、减少或消除非特异性染色方法、减少或消除非特异性染色方法3、显色反响的控制、显色反响的控制4、复染、复染四、对照四、对照 阳性对照；阴性对照阳性对照；阴性对照五、结果的判别五、结果的判别一阳性细胞的染色特性一阳性细胞的染色特性1、分胞浆、细胞核、细胞膜外表阳性、分胞浆、细胞核、细胞膜外表阳性2、灶状和弥漫性、灶状和弥漫性3、非特异性的认知、非特异性的认知4、切片质量不佳出现的阳性要排除、切片质量不佳出现的阳性要排除二染色失败的几种缘由二染色失败的几种缘由第二部分第二部分免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术 Coons等等1941经过荧光标志经过荧光标志

13、抗体，并借助于荧光显微镜察看荧光抗体，并借助于荧光显微镜察看荧光的发光物质，而建立的该项技术。的发光物质，而建立的该项技术。 近年来，与激光技术、电子计算近年来，与激光技术、电子计算机、扫描电镜等技术的结合开展为定机、扫描电镜等技术的结合开展为定量免疫荧光技术。加之荧光激活细胞量免疫荧光技术。加之荧光激活细胞分类器的运用和激光共聚焦显微镜的分类器的运用和激光共聚焦显微镜的问世，开创了免疫荧光技术的新领域。问世，开创了免疫荧光技术的新领域。第一节第一节 原理原理一、根本原理一、根本原理 免疫荧光技术也是根据抗原抗体免疫荧光技术也是根据抗原抗体反响的原理，先将知的抗原或抗体标志反响的原理，先将知的

14、抗原或抗体标志上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体或抗原作为探针检测组织或光抗体或抗原作为探针检测组织或细胞内的相应抗原或抗体。细胞内的相应抗原或抗体。二、荧光产生的原理二、荧光产生的原理 分子都含有电子，电子载不断的分子都含有电子，电子载不断的运动着。运动着。 普通情况下，电子总是处于能量普通情况下，电子总是处于能量最低的能级即基态最低的能级即基态 在一定的条例下，电子可吸收能在一定的条例下，电子可吸收能量跃迁到较高的能量级即激发态，量跃迁到较高的能量级即激发态，这个过程叫激发。这个过程叫激发。二、荧光素二、荧光素1、荧光色素、荧光色素 可以产生荧光并能

15、作为染料的化合物称为可以产生荧光并能作为染料的化合物称为。特性：必需具备吸收激发光的光能并发射荧光；特性：必需具备吸收激发光的光能并发射荧光；具有吸收具有吸收 一定频率光能的生色团和能产生一定光亮一定频率光能的生色团和能产生一定光亮子的荧光子的荧光 团。团。2、用于标志抗体的荧光素必需具备以下条件：、用于标志抗体的荧光素必需具备以下条件：1应具有与蛋白质分子构成共价键的化学基因，结合后不应具有与蛋白质分子构成共价键的化学基因，结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物容易排除。易解离，而未结合的色素及其降解产物容易排除。2荧光效率高，与蛋白质结合荧光效率下降不多。荧光效率高，与蛋白质结合荧光效

16、率下降不多。3结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。4与蛋白质结合的方法简便而快速。与蛋白质结合的方法简便而快速。5荧光素容易溶解，溶解后不会与其它物质发生化学反响。荧光素容易溶解，溶解后不会与其它物质发生化学反响。6荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能明晰荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能明晰判别结果。判别结果。3、荧光素的类型、荧光素的类型1异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素fluorescien isothocyanate, FITC)2四甲基异硫氰酸罗达明四甲基异硫氰酸罗达明tetraethyl rhodamin

17、e isothocyanate, TRITC)3四乙基罗达明四乙基罗达明tetraethyl rhodamine, RB200)4其它其它三、免疫荧光染色方法三、免疫荧光染色方法1、直接法：用知特异性抗体与荧光素结合，制、直接法：用知特异性抗体与荧光素结合，制成特异成特异 性荧光抗体，直接用于细胞和组织抗原性荧光抗体，直接用于细胞和组织抗原的检查。的检查。优点：特异性高优点：特异性高缺陷：一种荧光缺陷：一种荧光 抗体只能抗体只能 检测一种检测一种 抗原。抗原。2、间接法：用特异性的抗体、间接法：用特异性的抗体1抗与细胞或组织标本反抗与细胞或组织标本反响，随后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用

18、间接荧响，随后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体光抗体2抗与结合再抗原上的抗体结合，构成抗原抗与结合再抗原上的抗体结合，构成抗原 抗体抗体 荧光抗体的复合物。荧光抗体的复合物。优点：荧光亮度加强，优点：荧光亮度加强， 提高了敏感度提高了敏感度四、非特异性染色的消除方法四、非特异性染色的消除方法1、非特异性染色的主要要素、非特异性染色的主要要素1部分荧光素未与蛋白质结合，构成聚合物和衍化部分荧光素未与蛋白质结合，构成聚合物和衍化物而不能被透析除去。物而不能被透析除去。2抗体以外的血清蛋白与荧光素结合构成荧光素脲抗体以外的血清蛋白与荧光素结合构成荧光素脲蛋白，可与组织成分非特异结合。

19、蛋白，可与组织成分非特异结合。3组织内类属抗原的存在。组织内类属抗原的存在。4从组织中难以提纯抗原性物质。从组织中难以提纯抗原性物质。5抗体分子上标志的荧光素太多。抗体分子上标志的荧光素太多。6荧光素不纯，标本固定不当。荧光素不纯，标本固定不当。7细胞和组织内某些物质自发荧光。细胞和组织内某些物质自发荧光。8染色时间过长，温度过高，冲洗不够或标本枯燥。染色时间过长，温度过高，冲洗不够或标本枯燥。2、消除的方法、消除的方法1衬染法可抑制自发荧光衬染法可抑制自发荧光2胰蛋白酶消化可抑制非特异性荧光胰蛋白酶消化可抑制非特异性荧光3吸收用小属肝粉消除组织非特异性荧光的染色吸收用小属肝粉消除组织非特异性

20、荧光的染色4用正常非免疫血清去除自发荧光和非特异性用正常非免疫血清去除自发荧光和非特异性荧光荧光5提高抗体和荧光抗体的质量提高抗体和荧光抗体的质量五、荧光显微镜及检测方法五、荧光显微镜及检测方法略略六、染色标本的保管六、染色标本的保管 原那么上应立刻再荧光显微镜下察看，拍照，原那么上应立刻再荧光显微镜下察看，拍照，此时荧光最强。此时荧光最强。 用缓冲甘油封片，保管在用缓冲甘油封片，保管在4中，过夜后特中，过夜后特异性荧光强度减弱异性荧光强度减弱25，保管，保管1周后减弱周后减弱60。Nikon荧光显微镜荧光显微镜肾活检直接法肾活检直接法肾活检直接法肾活检直接法肾活检直接法肾活检直接法低倍视野低

21、倍视野肾活检直接法，表达弱肾活检直接法，表达弱肾活检直接法肾活检直接法肾活检直接法肾活检直接法左图：表达在细胞左图：表达在细胞核核FITC右图：表达在胞膜右图：表达在胞膜左图：左图：DAPI 染色染色染核染核右图：胃胃粘粘膜膜上上皮皮细细胞，胞，胞胞浆浆胞胞膜膜阳阳性性血血管管内内弹弹力力膜膜阳阳性性胃胃腺腺癌癌第三部分第三部分免疫酶细胞化学技术免疫酶细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术是免疫组免疫酶细胞化学技术是免疫组织化学中最常见的方法之一，它是织化学中最常见的方法之一，它是在抗原抗体特异性反响存在的前提在抗原抗体特异性反响存在的前提条件下，借助于酶学细胞化学手段，条件下，借助于酶学细胞化学手

22、段，检测某种物质抗原检测某种物质抗原/抗体组织细抗体组织细胞内存在部位的一门新技术。胞内存在部位的一门新技术。第一节第一节 免疫组织化学的根本技术免疫组织化学的根本技术一、取材一、取材1.1.实验动物实验动物 麻醉麻醉 处死，锋利刀片切成大小处死，锋利刀片切成大小适中，厚度适中，厚度3mm3mm4mm4mm。 小型实验动物：灌注流固定后小型实验动物：灌注流固定后取材取材 生理盐水和生理盐水和4 4多聚多聚甲醛甲醛 2.2.人体资料人体资料 活检组织、手术标本、细胞和组织活检组织、手术标本、细胞和组织二、固定二、固定 原那么是坚持组织形状良好和被检测抗原的前提原那么是坚持组织形状良好和被检测抗原

23、的前提下，应采用下，应采用浓度最低的固定剂和最短的固定时间，固定时间普通浓度最低的固定剂和最短的固定时间，固定时间普通为为1 112h12h。1.1.常用的固定剂常用的固定剂1 1甲醛缓冲液甲醛缓冲液 广泛运用于病理标本的固定，甲醛在很好地维护广泛运用于病理标本的固定，甲醛在很好地维护组织形状构造完好的同时也有效地保管某些抗原。由组织形状构造完好的同时也有效地保管某些抗原。由于甲醛的交联作用会影响被固定细胞膜的通透性不利于甲醛的交联作用会影响被固定细胞膜的通透性不利于染色时抗体的浸透，因此染色前常用酶进展消化以于染色时抗体的浸透，因此染色前常用酶进展消化以使抗原决议簇充分暴露，固定时间不直超越

24、使抗原决议簇充分暴露，固定时间不直超越24h24h。2 24 4多聚甲醛磷酸缓冲液多聚甲醛磷酸缓冲液 广泛运用于光镜细胞化学研讨。广泛运用于光镜细胞化学研讨。3 3戊二醛多聚甲醛缓冲液戊二醛多聚甲醛缓冲液 适用于光镜、电镜免疫组织化学研讨。适用于光镜、电镜免疫组织化学研讨。4 4其它其它 如如PLPPLP液过碘酸液过碘酸 赖赖AAAA多聚甲醛固定液、丙酮及醇多聚甲醛固定液、丙酮及醇 类、锇酸等。类、锇酸等。2.2.固定本卷须知固定本卷须知1 1固定液的选择规范：固定液的选择规范：A. A. 组织形状构造保管良好。组织形状构造保管良好。 B. B. 最大限制保管抗原的抗原性。最大限制保管抗原的抗

25、原性。2 2组织块的大小：组织块的大小：1.5cm1.5cm1.5cm1.5cm0.5cm0.5cm为宜。为宜。3 3固定时间：与组织块大小成正比，与固定液浓度成反比。固定时间：与组织块大小成正比，与固定液浓度成反比。4 4温度：普通在室温下进展，电镜标本和固定时间较长时温度：普通在室温下进展，电镜标本和固定时间较长时 可放置在可放置在44冰箱。冰箱。5 5固定后处置：充分冲洗，除去多余固定剂。固定后处置：充分冲洗，除去多余固定剂。三、包埋三、包埋 1. 1.石蜡包埋石蜡包埋 2. 2.冷冻包埋冷冻包埋 3. 3.环氧树脂包理环氧树脂包理四、切片四、切片 1. 1.载玻片的处置载玻片的处置1

26、1清洗清洗 2 2涂胶防止脱片。常用粘附剂：涂胶防止脱片。常用粘附剂：明胶：铬矾明胶和甲醛明胶。树脂胶：也称白胶。明胶：铬矾明胶和甲醛明胶。树脂胶：也称白胶。 多聚赖氨酸多聚赖氨酸PLLPLL。商品化粘附剂。商品化粘附剂。2.2.切片类型切片类型l l石蜡切片石蜡切片 厚约厚约3 3 5m 5m，放置，放置3737温箱烘烤过夜，以减少脱片。温箱烘烤过夜，以减少脱片。2 2冷冻切片：冷冻切片：2m2m。3 3振动切片：特点是组织经固定后不需包埋，只需用振动切片：特点是组织经固定后不需包埋，只需用胶水粘在载物台上即可切片。切片较厚，可将阳性部位作胶水粘在载物台上即可切片。切片较厚，可将阳性部位作电

27、镜包埋。神经组织运用较多。电镜包埋。神经组织运用较多。第二节第二节 免疫组化染色过程中根本技术免疫组化染色过程中根本技术一、蛋白酶消化技术一、蛋白酶消化技术 进展固定时，抗原决议簇有能够被进展固定时，抗原决议簇有能够被固定剂所封锁，因此在抗原抗体反响前，固定剂所封锁，因此在抗原抗体反响前，常用蛋白酶处置组织切片，使抗原决议常用蛋白酶处置组织切片，使抗原决议簇充分暴显露来，并使组织的通透性增簇充分暴显露来，并使组织的通透性增高，以利抗原抗体最大限制地结合加强高，以利抗原抗体最大限制地结合加强特异性染色。特异性染色。1.1.常用的消化酶常用的消化酶 胰蛋白酶、胃蛋白酶胰蛋白酶、胃蛋白酶2.2.消化

28、时间消化时间 因组织而异，普通为因组织而异，普通为5 530min30min，消，消化时间不宜太长，以免损伤组织形状，化时间不宜太长，以免损伤组织形状，破坏抗原决议族。消化终了后要充分洗破坏抗原决议族。消化终了后要充分洗涤，以除去残留的蛋白酶。涤，以除去残留的蛋白酶。3.3.非特异染色的控制非特异染色的控制 非特异染色或背景染色是指在免疫组化染色过程中凡不属非特异染色或背景染色是指在免疫组化染色过程中凡不属于特异性抗原抗体反响所出现的染色。于特异性抗原抗体反响所出现的染色。1 1缘由分析缘由分析组织方面：主要有组织的自发荧光、内源性过氧化物酶或碱组织方面：主要有组织的自发荧光、内源性过氧化物酶

29、或碱 性磷酸酶、内源性生物素等性磷酸酶、内源性生物素等. .试剂方面：因抗体不纯、标志的酶和荧光不纯或标志过量等。试剂方面：因抗体不纯、标志的酶和荧光不纯或标志过量等。2 2消除方法消除方法 加加1 1抗前加正常血清抗前加正常血清101030min30min，以封锁组织中带电荷的基，以封锁组织中带电荷的基因，防止与因，防止与1 1抗的非特异性结合。抗的非特异性结合。 减少非特异性染色：减少非特异性染色：a.a.免疫酶组化染色时，在加免疫酶组化染色时，在加1 1抗前，用抗前，用0.3%0.3%的的H2O2H2O2甲醇溶液将组甲醇溶液将组织切片处置织切片处置30min30min3%3%的的H2O2

30、H2O2甲醇溶液处置甲醇溶液处置5 510min10min。b.b.免疫荧光染色时，可用免疫荧光染色时，可用0.010.010.050.05伊文思蓝稀释荧光抗体。伊文思蓝稀释荧光抗体。二、对照二、对照 阳性对照片：用知抗原为阳性的标本作对照阳性对照片：用知抗原为阳性的标本作对照 阴性对照片：确认不含己知抗原的标本作对照阴性对照片：确认不含己知抗原的标本作对照三、抗体的分装、稀释、滴加及保管三、抗体的分装、稀释、滴加及保管1.1.抗体的分装抗体的分装 不能用完的抗体分装在小的不能用完的抗体分装在小的EPEP管内，保管在管内，保管在-20-20-40-40的低温冰箱中持用可坚持数年有效。的低温冰箱

31、中持用可坚持数年有效。2.2.抗体稀释抗体稀释 常用常用0.01MPBS0.01MPBS磷酸缓冲溶液或磷酸缓冲溶液或BSABSA牛血洁白牛血洁白蛋白蛋白3.3.滴加滴加 滴加抗体要充分覆盖组织切片，普通加滴加抗体要充分覆盖组织切片，普通加 30 3050L,50L,最好在滴加前，用蜡笔或特制的组化笔在组织最好在滴加前，用蜡笔或特制的组化笔在组织周围画一圈周围画一圈, ,以防溶液的分散。以防溶液的分散。4.4.保管保管 未用完的抗体可在低温冰箱或冻干保管，已稀释未未用完的抗体可在低温冰箱或冻干保管，已稀释未用完的抗体最好在一周内用完，不宜长期保管。用完的抗体最好在一周内用完，不宜长期保管。 四、

32、免疫酶组织化学技术和酶标抗体技术四、免疫酶组织化学技术和酶标抗体技术1.1.免疫酶染色原理免疫酶染色原理 用酶作为标志物，可分为直接法、间接法、补体用酶作为标志物，可分为直接法、间接法、补体法、免法、免疫酶桥法、免疫酶双桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶疫酶桥法、免疫酶双桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法法PAPPAP法和双法和双PAPPAP法等。法等。1 1直接法原理：用酶直接标志在特异性直接法原理：用酶直接标志在特异性1 1抗上，与抗上，与标本中的标本中的 抗原结合，让酶催化底物反响产生有色产物，抗原结合，让酶催化底物反响产生有色产物，沉淀在抗沉淀在抗 原抗体反响部位，即可在镜下对标本的抗原进原抗体

33、反响部位，即可在镜下对标本的抗原进展检测。展检测。优点：简便、快速、特异性强；缺陷：敏感性差。优点：简便、快速、特异性强；缺陷：敏感性差。 2 2间接法原理：先用标志的特异性间接法原理：先用标志的特异性1 1抗与标本中相应抗原抗与标本中相应抗原结合，再用酶标志的抗球蛋白抗体结合，再用酶标志的抗球蛋白抗体2 2抗孵育，然后再加抗孵育，然后再加 酶的底物，显示抗原抗体抗原抗体复合物存在的部酶的底物，显示抗原抗体抗原抗体复合物存在的部 位，以对抗原进展检测。位，以对抗原进展检测。如：如：1 1抗是由兔产生的多克隆抗体抗是由兔产生的多克隆抗体, ,那么那么2 2抗常用羊抗兔抗常用羊抗兔IgGIgG；

34、1 1抗是由鼠产生的单克隆抗体抗是由鼠产生的单克隆抗体, ,那么那么2 2抗常用羊或马抗鼠抗常用羊或马抗鼠IgGIgG。以上两种方法称为酶标抗体法以上两种方法称为酶标抗体法3 3非酶标志的抗体酶法：是以酶为抗原免疫动物，产生非酶标志的抗体酶法：是以酶为抗原免疫动物，产生抗酶的抗体。经过酶与抗体的特异性结合进展标志。该方法抗酶的抗体。经过酶与抗体的特异性结合进展标志。该方法适用于石蜡包埋的组织切片。适用于石蜡包埋的组织切片。常用的有常用的有PAPPAP、sABCsABC、LsABLsAB法附图表阐明法附图表阐明酶标识特异抗体酶标识特异抗体酶标识二次抗体酶标识二次抗体生物素生物素 HRPALPAL

35、P2.2.常用的酶种类常用的酶种类 底物底物 沉淀颜色沉淀颜色HRP A.3,3HRP A.3,3氨基联苯胺氨基联苯胺DABDABH2O2 H2O2 深褐色深褐色 B.5 B.5氨基水杨酸氨基水杨酸 H2O2 H2O2 棕色棕色ALP A.ALP A.苯酚磷酸盐重氮盐红色苯酚磷酸盐重氮盐红色 B.P B.P校际酚磷酸盐黄色校际酚磷酸盐黄色酸性磷酸酶酸性磷酸酶 Gomoui Gomoui液液葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 D D葡萄糖葡萄糖MTTMTT酚嗪磷酸酚嗪磷酸 甲酯化合物甲酯化合物 蓝色蓝色第三节第三节 免疫组化的实践操作免疫组化的实践操作1.1.实验预备必需器材实验预备必需器材 1 1实验台

36、：光线充足，方便操作。实验台：光线充足，方便操作。 2 2潮湿盒：放置抗原抗体反响过程中潮湿盒：放置抗原抗体反响过程中反响，防止枯燥。反响，防止枯燥。 3 3微量移液器：微量移液器：1 120l,2020l,20200l,100200l,1001000l1000l。 4 4其它：滤纸、纱布、吸头、其它：滤纸、纱布、吸头、EPEP管、管、染缸、提篮等。染缸、提篮等。2.2.试剂药品试剂药品 1 1缓冲液：缓冲液：PBS,0.01 MPBS,0.01 M磷酸缓冲液磷酸缓冲液pH7.2pH7.2 TBS,0.05 M Tris TBS,0.05 M Tris盐酸缓盐酸缓冲液冲液pH7.6pH7.6

37、2 2抗体稀释液抗体稀释液: 1: 1BSABSA或或0.01 MPBS0.01 MPBS 3 310102 2抗免疫动物的正常血清抗免疫动物的正常血清 4 4DBADBAH2O2H2O2显色液显色液 5 5核复染液：苏木素或甲基绿核复染液：苏木素或甲基绿 3.sABC法的操作过程根本原理：sABCstrepto-avidin-biotin peroxidase complex链球菌抗生物素卵白蛋生物素过氧化物酶复合物生物素(biotin):是一种分子量为244da的小分子的维生素。 抗生物素(avidin):是一种糖蛋白，分子量为68KDa。 生物素与抗生物素有很强的亲和力，两者一旦结合就很

38、难解离。同时生物素与抗生物素都有与其它示踪剂如荧光素，胶体金和过氧化物酶等相结合的才干。所以生物素-抗生物素系统具有灵敏度高、特异性强及方便快速等显着优点。附根本操作步骤第四节第四节 本卷须知及结果断定本卷须知及结果断定 要想得到理想的结果，组织细胞形要想得到理想的结果，组织细胞形状的保管、抗原性的保管、充分的显示状的保管、抗原性的保管、充分的显示是非常必要的。要满足这些条件，取材、是非常必要的。要满足这些条件，取材、固定、切片厚度、操作过程、抗体浓度固定、切片厚度、操作过程、抗体浓度及特异性的选择、操作前蛋白酶的消化、及特异性的选择、操作前蛋白酶的消化、抗原修复及显色等各程序的操作不当均抗原

39、修复及显色等各程序的操作不当均可导致不称心结果的产生。可导致不称心结果的产生。1. 取材固定取材固定 标本要尽能够新颖，取材固定要及时，固定液要新标本要尽能够新颖，取材固定要及时，固定液要新 鲜鲜充足，防止组织破坏和抗原性的失活。充足，防止组织破坏和抗原性的失活。2. 切片切片 切片不宜过厚，普通切片不宜过厚，普通4m左右。切片不宜过大，载玻左右。切片不宜过大，载玻片要涂粘附剂，以防脱片。切好的切片暂放片要涂粘附剂，以防脱片。切好的切片暂放37温箱保温箱保管。管。3.3.脱蜡脱蜡 脱蜡一定要彻底，新颖二甲苯脱蜡一定要彻底，新颖二甲苯 5min 5min3 3。4.4.蛋白酶消化蛋白酶消化 由于

40、组织在固定时抗原决议簇能够被固定剂所封锁，因此由于组织在固定时抗原决议簇能够被固定剂所封锁，因此在抗原抗体反响前常用蛋白酶处置组织切片根据在抗原抗体反响前常用蛋白酶处置组织切片根据1 1抗要求，抗要求，使抗原决议簇充分暴显露来，并使组织通透性增高，使抗体充使抗原决议簇充分暴显露来，并使组织通透性增高，使抗体充分结合抗原，加强特异性染色。普通用分结合抗原，加强特异性染色。普通用0.1%0.1%胰蛋白酶或胃蛋白胰蛋白酶或胃蛋白酶消化酶消化5 530min30min。5.5.抗原修复抗原修复 普通在柠檬酸钠抗原修复液内，微波炉，普通在柠檬酸钠抗原修复液内，微波炉，85859595，10min10mi

41、n左右。左右。6.6.抗体的选择抗体的选择 选择抗体时要留意是用于冰冻切片还是用于石蜡切片的抗选择抗体时要留意是用于冰冻切片还是用于石蜡切片的抗体，或是二者均可；其次要看抗体阐明，是单抗还是多抗；适体，或是二者均可；其次要看抗体阐明，是单抗还是多抗；适用于哪些组织；抗体来源于哪种动物，由此来选择用于哪些组织；抗体来源于哪种动物，由此来选择2 2抗；还有抗；还有抗体的稀度在实验前根据预实验选择最正确浓度。抗体的稀度在实验前根据预实验选择最正确浓度。7.7.特异性确实定特异性确实定 阴性对照不加阴性对照不加1 1抗，用抗，用PBSPBS或或TBSTBS替代替代 阳性对照知确定阳性的组织或买阳性对照

42、片阳性对照知确定阳性的组织或买阳性对照片显色：留意显色：留意H2O2H2O2的浓度，必需在显示前参与的浓度，必需在显示前参与H2O2H2O2均匀搅拌，最均匀搅拌，最正确显色时间在正确显色时间在3 35min5min，过短或过长都不会出现称心的效果。，过短或过长都不会出现称心的效果。 9. 9.复染复染 普通用苏木素普通用苏木素30s30s1min1min，过长复染将掩盖免疫组化的染色，过长复染将掩盖免疫组化的染色效果。效果。10.10.结果断定结果断定 判别能否阳性或阴性，要排除假阳性或假阴性结果。也要学判别能否阳性或阴性，要排除假阳性或假阴性结果。也要学会判别特异性染色和非特异性染色。呈色深

43、浅可反映抗原存在的会判别特异性染色和非特异性染色。呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的根据。数量，可作为定性、定位和定量的根据。 有关阳性结果的定量判别，常规的方法是根据呈色深浅和阳有关阳性结果的定量判别，常规的方法是根据呈色深浅和阳性细胞数量分类计算，以性细胞数量分类计算，以- -,+,+,+,+,+,+等分级和计数统计。等分级和计数统计。以下用图片阐明以下用图片阐明胃癌淋巴结转移胃癌淋巴结转移cerbB-2cerbB-2癌基因表达癌基因表达sABCsABC法法胃癌，胃癌，P53P53抑癌基因表达，抑癌基因表达， sABC sABC法法胃癌胃癌CerbB-2CerbB-2的

44、表达，的表达， sABC sABC法法胃癌胃癌cerbB-2cerbB-2的淋巴管侵袭，的淋巴管侵袭， sABC sABC法法胃淋巴组织反响胃淋巴组织反响性增生，性增生，CD20/CD43CD20/CD43检测检测sABCsABC法法胃组织中的反响性增生的淋巴组织，胃组织中的反响性增生的淋巴组织，CD43CD43表达，表达， sABC sABC法法IgANIgAN，TGFs2TGFs2表达，主要在近曲肾小管内，表达，主要在近曲肾小管内， sABC sABC法法IgAN, TGFs2IgAN, TGFs2的表达，的表达，sABCsABC法法IgANIgAN，bFGFbFGF的表达，的表达， sA

45、BC sABC法法IgAN, PDGFIgAN, PDGF的表达，的表达， sABC sABC法法骨骼肌营养不良，骨骼肌营养不良，myosinmyosin蛋白表达，蛋白表达， sABC sABC法法第五节第五节 免疫组织化学在病理诊断中的免疫组织化学在病理诊断中的运用范围运用范围1.1.肿瘤诊断肿瘤诊断 未分化恶性肿瘤性质断定；圆形、未分化恶性肿瘤性质断定；圆形、梭形、多形性肿瘤细梭形、多形性肿瘤细胞鉴别；转移肿瘤的原发部位确实定。胞鉴别；转移肿瘤的原发部位确实定。2.2.淋巴瘤的诊断淋巴瘤的诊断 鉴定反响性增生疾病与淋巴瘤；各鉴定反响性增生疾病与淋巴瘤；各种淋巴瘤的分型。种淋巴瘤的分型。3.

46、3.内分泌肿瘤的诊断检测肿瘤分泌的内分泌肿瘤的诊断检测肿瘤分泌的激素激素) )4.4.软组织肿瘤；神经系统肿瘤软组织肿瘤；神经系统肿瘤5.小活检组织病理检查能明确显示瘤细胞存在与否小活检组织病理检查能明确显示瘤细胞存在与否)6.微小癌、微小转移灶淋巴结和骨髓微小癌、微小转移灶淋巴结和骨髓)7.细针穿刺细胞学诊断细针穿刺细胞学诊断)8.部分肿瘤来源分类部分肿瘤来源分类9.乳腺癌激素受体检测乳腺癌激素受体检测ER，PR)10.肿瘤基因产物肿瘤基因产物p53,cerb-B2,ALK,CDs)11.增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原Ki-67，PCNA)断定肿瘤的预后断定肿瘤的预后12.病因诊断病因诊断HB

47、V，HCV，EBV，CMV，HIV等等)第六节第六节 免疫组织化学在病理诊断中存免疫组织化学在病理诊断中存在的缺乏在的缺乏1.1.与分子生物学等技术相比，范围有限与分子生物学等技术相比，范围有限2.2.并非一切肿瘤均可以做免疫组化，因并非一切肿瘤均可以做免疫组化，因常无相应的抗体常无相应的抗体3.3.相当多的肿瘤缺乏特异性抗原的表达，相当多的肿瘤缺乏特异性抗原的表达，同一种抗体，常同一种抗体，常 常可表达多种肿瘤常可表达多种肿瘤4.4.免疫组织化学规范化问题免疫组织化学规范化问题第四部分第四部分 免疫电子显微镜技术免疫电子显微镜技术一、免疫电镜技术一、免疫电镜技术(immunoelection

48、 microscopy) 是利用抗原和抗体特异性结合的是利用抗原和抗体特异性结合的原理，在超微构造程度定位、定性原理，在超微构造程度定位、定性及半定量显示抗原的技术方法。从及半定量显示抗原的技术方法。从细胞超微构造程度研讨和察看抗原细胞超微构造程度研讨和察看抗原抗体的免疫反响，必需使抗体带上抗体的免疫反响，必需使抗体带上具有高电子密度的标志物，这样才具有高电子密度的标志物，这样才干在电镜下察看反响分结果。干在电镜下察看反响分结果。 到目前为止，已有三种标志技术：到目前为止，已有三种标志技术： (1)铁蛋白标志技术铁蛋白标志技术 (2)酶标志技术酶标志技术 (3)胶体金标志技术胶体金标志技术二、

49、免疫金标志技术二、免疫金标志技术immunogold staining immunogold staining technique)technique) 用胶体形状的金颗粒，作为抗体的标志物，制用胶体形状的金颗粒，作为抗体的标志物，制成免疫胶体金来研讨抗原抗体的反响。在光镜下，成免疫胶体金来研讨抗原抗体的反响。在光镜下，胶体金呈鲜红色。电镜下，金颗粒电子密度大，有胶体金呈鲜红色。电镜下，金颗粒电子密度大，有利于超微构造的察看。利于超微构造的察看。 根据抗体特异性结合的原理，在亚细胞程度定根据抗体特异性结合的原理，在亚细胞程度定性定位。对抗体加以标志，构成高电子密度区，在性定位。对抗体加以标志，

50、构成高电子密度区，在电镜下察看反响过程。在对细胞内抗原定性研讨中，电镜下察看反响过程。在对细胞内抗原定性研讨中，还可用不同的金颗粒标志同一细胞内不同的抗原。还可用不同的金颗粒标志同一细胞内不同的抗原。进展多重标志。进展多重标志。 三、免疫电镜的根本技术方法三、免疫电镜的根本技术方法1.1.标本的处置标本的处置(1)(1)取材取材: :各种培育细胞和分别的血细胞应随用随取；各种培育细胞和分别的血细胞应随用随取；游离的培游离的培 养细胞可先进展离心；贴壁细胞可在载玻片养细胞可先进展离心；贴壁细胞可在载玻片上固定，上固定， 也可用胰蛋白酶将细胞消化下来；取组织块也可用胰蛋白酶将细胞消化下来；取组织块

51、时应做到时应做到 越快越好，最好在没有停顿血流前取材。越快越好，最好在没有停顿血流前取材。 2 2固定固定 固定液的选择：固定液的选择： 既要保管细胞的超微构造，又要尽能够的保管抗原的活性。既要保管细胞的超微构造，又要尽能够的保管抗原的活性。A.A.多聚甲醛加低浓度的戊二醛固定液多聚甲醛加低浓度的戊二醛固定液PGPG固定液固定液B.B.过碘酸盐赖氨酸多聚甲醛混合固定液过碘酸盐赖氨酸多聚甲醛混合固定液 PLP PLP固定液固定液C.C.苦味酸多聚甲醛戊二醛固定液苦味酸多聚甲醛戊二醛固定液PAPGPAPG固定液固定液) ) 固定方法与时间：固定方法与时间：A.A.血管灌注固定最好方法血管灌注固定最

52、好方法B.B.浸泡固定浸泡固定C.C.微波固定微波固定2.2.根本技术方法根本技术方法1 1包埋前免疫电镜技术包埋前免疫电镜技术 是指先对标本进展免疫标志，然后进展包埋、切片、是指先对标本进展免疫标志，然后进展包埋、切片、察看。察看。2 2包埋后免疫电镜技术包埋后免疫电镜技术 是指组织标本经固定及树脂包埋，制形成超薄切片后再是指组织标本经固定及树脂包埋，制形成超薄切片后再进展免疫化学染色方法。进展免疫化学染色方法。详见包埋前和包埋后电镜技术的比较详见包埋前和包埋后电镜技术的比较包埋前与包埋后的比较包埋前与包埋后的比较包埋前包埋前包埋后包埋后优点优点缺点缺点修正修正未经锇酸固定、脱水、树脂包埋未

53、经锇酸固定、脱水、树脂包埋及高温聚合的过程，标记的阳性及高温聚合的过程，标记的阳性率高，提高电镜的检出率。率高，提高电镜的检出率。免疫染色完毕后用戊二醛与锇酸免疫染色完毕后用戊二醛与锇酸作后固定，可使抗原抗体结合的作后固定，可使抗原抗体结合的更加牢固，并有利于膜结构的保更加牢固，并有利于膜结构的保存。存。标记前细胞内抗原受到标记抗体标记前细胞内抗原受到标记抗体的穿透性限制（因是组织块）的穿透性限制（因是组织块）制作厚切片；增加细胞膜的通透制作厚切片；增加细胞膜的通透性性具有阳性结果重复性高、方法简具有阳性结果重复性高、方法简便可靠的优点，可对同一组织块便可靠的优点，可对同一组织块的连续切片作各

54、种对照染色，能的连续切片作各种对照染色，能十分准确的解释染色结果，而且十分准确的解释染色结果，而且还能在同一张切片上进行多重免还能在同一张切片上进行多重免疫染色。疫染色。抗原在脱水、浸透及树脂包埋过抗原在脱水、浸透及树脂包埋过程中可能被破坏，使免疫染色的程中可能被破坏，使免疫染色的阳性率下降。阳性率下降。细胞膜保存差（锇酸作用）细胞膜保存差（锇酸作用）固定液选择苦味酸固定液选择苦味酸(保护细胞膜保护细胞膜)包埋剂协作低温树脂包埋剂协作低温树脂肝细胞内肝细胞内的内质网的内质网和核膜，和核膜，可见可见G-6-PG-6-P酶阳性反酶阳性反响产物。响产物。( (32000)32000)肝细胞。箭头指线

55、粒体，线粒体嵴、内膜基质侧呈现琥珀酸肝细胞。箭头指线粒体，线粒体嵴、内膜基质侧呈现琥珀酸脱氢酶阳性反响颗粒脱氢酶阳性反响颗粒3600036000 。IgAN, TGFs2IgAN, TGFs2的表达，免疫金银法的表达，免疫金银法IgAN, TGFs2IgAN, TGFs2的表达，免疫金银法的表达，免疫金银法K4MK4M低温包埋剂和紫外线低温包埋机结合的低温包埋剂和紫外线低温包埋机结合的免疫电镜法免疫电镜法 实验结果引见实验结果引见 免疫电镜技术是从超微构造程度能显示抗原和抗体结合免疫电镜技术是从超微构造程度能显示抗原和抗体结合后在细胞微细构造程度的定位，这一技术已成为目前生物医后在细胞微细构造

56、程度的定位，这一技术已成为目前生物医学领域的一项重要研讨手段。但是，由于免疫电镜技术因多学领域的一项重要研讨手段。但是，由于免疫电镜技术因多种缘由呵斥的反复性差或技术的不稳定性，加之目前电镜包种缘由呵斥的反复性差或技术的不稳定性，加之目前电镜包埋所采用的是环氧树脂埋所采用的是环氧树脂618618或或812812，都需高温聚合，这样可使，都需高温聚合，这样可使多种抗原活性减低或丧失。本研讨组选用了多种抗原活性减低或丧失。本研讨组选用了Lowicryls K4MLowicryls K4M低低温包埋剂和紫外线低温包埋机温包埋剂和紫外线低温包埋机SPI#17020SPI#17020，对免疫电镜察，对免

57、疫电镜察看的标本进展了处置，目的是更好的保管被检测组织中抗原看的标本进展了处置，目的是更好的保管被检测组织中抗原的活性，提高检出率。现将一些不成熟的阅历和存在的问题的活性，提高检出率。现将一些不成熟的阅历和存在的问题进展一下总结。进展一下总结。 一、紫外线低温包埋机一、紫外线低温包埋机SPI#17020 SPI#17020 SPI#17020是美国特殊研制的低温包埋机，它最主要的特是美国特殊研制的低温包埋机，它最主要的特点是采用数字化温度控制，点是采用数字化温度控制， 通常采用干冰制冷，也可以运用通常采用干冰制冷，也可以运用液氮制冷，温度可以控制在液氮制冷，温度可以控制在-10-10-37-3

58、7之间。经过温度控之间。经过温度控制风扇可以使机内的温度控制在某一恒定温度，继续长达制风扇可以使机内的温度控制在某一恒定温度，继续长达3636小时，完全可以满足低温脱水、浸透和包埋所需的时间。它小时，完全可以满足低温脱水、浸透和包埋所需的时间。它占地面范围小，但机内空间较大，可以同时放入占地面范围小，但机内空间较大，可以同时放入7272个包埋胶个包埋胶囊。而且机箱上方有两个封锁起来的波长为囊。而且机箱上方有两个封锁起来的波长为360nm360nm的紫外灯，的紫外灯，低温暖室温下的紫外线聚合都可以在包埋机中进展。低温暖室温下的紫外线聚合都可以在包埋机中进展。 总之，紫外线低温包埋机是很理想的低温

59、脱水、浸透、总之，紫外线低温包埋机是很理想的低温脱水、浸透、聚合的机器。聚合的机器。 二、Lowicryls K4M 低温包埋剂 Lowicryls K4M是丙烯酸盐和甲基丙烯酸盐化学物质，其特点是能在低温下坚持低粘度，能很快渗入组织以及具有在波长360nm的紫外光照射下聚合的才干，它的光聚协作用与温度无关，而且Lowicryls K4M具有亲水性，因此它能较好地坚持组织构造和抗原性，减少背景染色。三、方法三、方法1.1.包埋剂的配制包埋剂的配制 商品提供的商品提供的Lowicrys K4MLowicrys K4M包埋剂由三个部分包埋剂由三个部分组成：单体，交联剂和引发剂。调整单体和交联组成：

60、单体，交联剂和引发剂。调整单体和交联剂的比例，添加交联剂的量，组织块的硬度添加。剂的比例，添加交联剂的量，组织块的硬度添加。中等硬度的组织块，其配制比例如下：中等硬度的组织块，其配制比例如下： 1 1Lowicryls K4MLowicryls K4M：单体：单体 17.30g 17.30g；交联剂；交联剂2.70g2.70g；引发剂；引发剂0.10g0.10g。可量取后，注入棕色的玻。可量取后，注入棕色的玻璃容器避光，用玻璃棒轻搅璃容器避光，用玻璃棒轻搅3 35 5分钟。勿过分搅分钟。勿过分搅拌，以防空气的气泡进入包埋剂中。拌，以防空气的气泡进入包埋剂中。2 2Lowicryls K4MLo