人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验 (1)

1、人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案 2012级师范2班第3组组员：吴婵 胡颖月 央珍 杨基伟 杨青松 宋海燕 田金梅（组长）一、实验目的掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。二、实验原理人的1ml外周血约含有1×10*63×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mo

2、l/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype a

3、nalysis）。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。 染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1） 相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100% （2）臂指数=长臂/短臂 （反映着丝粒位置的指数） （3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数

4、） 人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。其中22对是男女共有的染色体，一对为男女所不同的性染色体，男XY,女XX。根据丹佛（1960），伦敦（1963）和芝加哥（1966）会议提出的标准，即按照染色体长度依次减小和着丝粒位置以及其他特征，把人类体细胞染色体分为七个组群，各自特征简括于表1。 表1 人染色体组型及其特征组别染色体序号形态，大小着丝粒位置次缢痕随体鉴别程度A 13 最大M常见一号无可鉴定B 45 次大Sm  无不易C 612+X 中等Sm 常见九号无难鉴定D 1315 中等S他偶见13号 有难鉴定E 1618 较小16m,17m

5、,18sm常见16号无可鉴定F 1920 次小M  无不易G2122+Y最小St有，Y无难鉴定三、实验材料和试剂1、材料 人的静脉外周血（组内选取男女生各一名，取血样） 2、试剂 完全RPMI-l640培养液（含双抗，小牛血清），肝素溶液（医院采血时已加）,PHA（植物血球凝集素）溶液母液10mg/mL，75%乙醇,秋水仙素溶液母液50ug/mL,Giemsa染液，0.075mol/LKCl溶液，Carnoy固定液，磷酸缓冲液PH6.8；纯酒精，冰乙酸等3、器材 恒温培养箱,离心机,分析天平,显微镜,超净工作台,移液枪，离心管（8个）,培养瓶（4个）,试管架,量桶（10ml

6、，2个）,烧杯（50ml和25ml各一个）,酒精灯,染缸，胶头滴管（7个），玻璃棒（2根），载玻片（8片）等。 四、实验方法和步骤 （一）各种试剂及培养基的配制 (1)完全RPMI-1640培养基的配制（老师已配好）：称取RPMI-l640培养粉9.8g溶于1,000mL蒸馏水中,经G6型号细菌过滤漏斗中0.22um的滤膜抽滤后，加入小牛血清lmL,肝素3滴（0.03ml）, 双抗5滴（0.05ml）,NaHCO3调pH至7.27.4，备用。(2)PHA(植物血球凝集素)溶液：老师提供10mg/ml的母液(3)肝素溶液：医院采血时已加(4)秋水仙素溶液：老师提供50ug/ml的母液(5)低渗液

7、的配制：称取0.2795gKCl溶于50mL双蒸馏水中,配制成溶液浓度为0.075mol/L的低渗液50ml。 (6)固定液的配制：9ml纯酒精+3ml冰乙酸。(7)Giemsa（吉姆斯）染液 （全班统一配制）Giemsa原液：Giemsa粉剂0.8g，甘油50ml，甲醇50ml配制方法：先少量甘油加入研钵中，将Giemsa粉剂在研钵中充分研磨（40min），再倒入剩余甘油，并在56温箱中保温2h，然后加入甲醇，混合摇匀，用有色玻璃瓶密封保存备用。Giemsa稀释液：临用时，取Giemsa原液1份加9份磷酸缓冲液（老师提供0.2mol/l的母液，用时稀释一倍）稀释。（二）实验操作步骤 实验前准

8、备：器具消毒灭菌药品配制Giemsa:1份原液，9份PH为7.4的磷酸缓冲液卡诺氏固定液：甲醇：冰醋酸=3:1（24h内使用）培养基添加0.0795ml浓度为10mg/ml的PHA母液载玻片冰冻处理超近工作台消毒灭菌操作人员消毒实验过程：1.培养基配制将4个洁净的培养瓶分别贴上标签“男1”、“男2”和“女1”、“女2”在超净工作台上各取5ml事先准备好的完全RPMI-1640培养液（含双抗和小牛血清）于培养瓶中，再用移液枪各自加入PHA 0.075ml,贴上封口膜。加入PHA。2 采血接种到校医院采静脉血3-4ml，用肝素湿润管壁存放。用移液枪向含有5ml培养基的培养瓶中加入0.3ml全血，接

9、种过后再次用酒精棉消毒瓶塞，并在外面用封口膜密封好，轻轻摇匀。3.培养将培养瓶置于37度培养箱中培养72h，终止培养前3-4h加入秋水仙素0.076ml，使最终浓度在0.7ug/ml。培养过程中注意观察，有血凝块时要尽量摇散。4.收集细胞将培养瓶从温箱中取出，用吸管轻轻吹打，使细胞混合均匀。以1000rpm/min离心8分钟，去掉上清液。5.低渗处理用滴管1向离心管中加入1ml0.075mol/ml的KCL溶液，轻轻吹打使细胞重悬。补加6mlKCL溶液，37度低渗处理20分钟。低渗过程中可吹打一次，帮助低渗完全。6.预固定用滴管2沿管壁慢慢加入1ml卡诺氏固定液（现配现用），轻轻吹打均匀，以1

10、000rpm/min离心8分钟，去掉上清液。7.固定用滴管2沿管壁加入6ml卡诺氏固定液，用吸管轻轻吹打，使细胞分散（可先加少许吹打后再加剩余的）。固定20分钟，离心去掉上清液。8.再固定重复第七步9.滴片在沉淀物中加入0.2-0.5ml固定液，用吸管吹打使细胞重悬，用镊子取预先冰冻的干净载玻片，迅速滴上2滴细胞悬液（1.5米-1.8米），立即用嘴向同一方向吹气，使细胞分散均匀，在酒精灯上过火4-5次，置于烘箱中烘干。10.染色滴有细胞悬液的载玻片置于染色板上，置于染缸中染色20分钟。用自来水浸泡去浮色。11.镜检在低倍镜下找到中期分裂相细胞，转用高倍镜。在油镜下拍照记录染色体分散适度，长度适

11、中的分裂相。五、实验结果剪贴男女核型各一套并做相应分析。附；实验结果参考 一. 常规染色体核型分析 1根据染A组染色体：包括1色体的形态、大小及着丝粒的位置，将染色体分为七组：3号染色体。长度最长，1号和3号染色体为中央着丝粒，2号染色体为亚中央着丝粒染色体。 B组染色体：包括45号染色体，长度次于A组；亚中央着丝粒染色体，短臂较短。C组染色体：包括612号和X染色体，中等长度，亚中央着丝粒染色体。D组染色体：包括1315号染色体，具有近端着丝粒和随体。 E组染色体：包括1618号染色体，16号染色体着丝粒在 3/8处，17号和 18号染色体着丝粒约在 1/4处。 F组染色体：包括19号和20

12、号染色体，中央着丝粒。 G组染色体：包括21号、22号和Y染色体，是染色体组中最小的，为近端着丝粒的染色体。21号和22号染色体具有随体。 2.核型分析配对方法参考： A组（No13）：最大，着丝粒在中部或几乎在中部。 No1：中央着丝粒；No2：着丝粒接近中部； No3： 中央着丝粒。 B组（No45）：2对大的亚中着丝粒染色体。 C组（No612+X）：中等大小的亚中着丝粒染色体。No6、7、9和11 ：着丝粒更接近于中部；No9 ：长臂有较显著的次缢痕。X：大小介于No7和No8之间。 D组（No1315）：中等大小，近端着丝粒染色体，它们的一个重要的形态特征是随体。E组（No1618）

13、：No16：最大，中央着丝粒；No17：中等大小，亚中着丝粒，短臂看得很清楚；No18：最小，其短臂很小。 F组（No1920）：小的中央着丝粒染色体。 G组（No2122 +Y）：最小，近端着丝粒。在No21和22染色体的短臂上可见到随体，且No22比No21要大些。 Y 染色体：形态和大小跟G 组染色体相似。有以下几个特征：呈现异固缩状态；它的两条染色单体一般不作分叉状，几乎是平行的；在许多细胞中，在其长臂上可见到次缢痕；一般来说，它比第21、22染色体要长一些；没有随体；长臂的端部模糊不清，呈“细毛状”。六、注意事项（一）细胞培养技术1、在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，

14、并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力做到最大限度的无菌，防止污染。2、无菌操作的要领和要求1）培养前准备  为做好培养前用品的充分准备工作，根据实验内容的要求收集好已消毒的所需用品，清点无误后置于超净工作台内，这样可避免操作开始后由于用品不全、往反取物而增加污染机会。2）超净工作台消毒  打开紫外线杀菌灯照射消毒20-30分钟，然后关闭紫外灯打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台内可保持无菌环境。为防止培养细胞和培养液等受到紫外线照射，消毒前应予先放在带盖容器内或在操作时随手携入。3）洗手 

15、 操作时因整个前臂要伸入超净工作台内，所以洗手时，一定要洗刷到肘部，然后用0.2% 新洁尔灭擦洗或用75%酒精棉球擦试。4）火焰消毒  在超净工作台无菌环境中操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作如安装吸管橡皮头、打开或加盖瓶塞、使用吸管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进行。注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长。烧过的用具都要待冷却后再接触细胞，否则会烧焦形成炭膜，再用时会把有害物质带入培养液中。5）操作  进行培养操作时动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动增加污染机会。不能用手触及器皿的消毒部分。如已接触，要用火焰烧灼消毒或更换。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理

16、布局。原则上是右手使用方便的用品放在右侧，左手使用方便的用品放在左侧；酒精灯置于中央。培养液等不要过早开瓶，打开的培养液和培养用瓶等应保持斜位或平放，长时间开口直立，易增加落菌机会。吸取各种用液时均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或增加混淆不同细胞的机会。（二）操作1、接种的血样越新鲜越好，最好是在采血后24h内培养，如不能立刻培养，应置于4冰箱存放，避免保存时间过久，以免影响细胞的活力。培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻震荡，使凝块散开，继续放回37恒温箱内培养，最好每天轻轻震荡混匀一次。2、Giemsa为噻嗪类染料 ,其碱性成份天青 B与 DNA分子中的磷酸基结合 ,蛋白质在

17、一定的环境中 ,具有不同的嗜酸性和嗜硷性倾向 ,出现着色差异易于观察。因此染液PH值对着色效果有影响。当呈淡灰色带纹不显时 ,应调节染液 pH值7.07.2,复染 10min,可获得鲜亮的显色效果。3、在采血接种培养是，不要加入太多的肝素。肝素太多可能引起溶血、抑制淋巴细胞的转化和分裂。但肝素量也不应太少，以免发生凝血或培养物中出现纤维蛋白形成的膜状结构。这种膜状物一般在培养24小时左右出现，此时可在无菌条件下将它除去以免影响培养效果。4、 在普通培养箱内培养时，必须将培养瓶口盖紧，以免培养液的PH发生较大的变化。如果培养过程中，培养液酸化比较严重（培养液呈黄色时）将不利于细胞生长，此时可加入适量无菌的0.14%碳酸氢钠溶液调整或再加入23ml培养液来校正。培养箱的温度应控制在37+0.5，温度过高或过低都会影响细胞的生长。5、染色体标本质量不佳的原因。如果淋巴细胞转化试验表明培养物生长发育良好，但制成的标本质量不佳时，其原因可能为： 秋水仙素处理不当：一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系，如果处理时间太短，则标本中的分裂细胞就少，相反，如果处理时间太长，则标本中的分裂细胞虽多，但其染色体缩得太短，以致形态特征模糊，不容易观察。 低渗处理不当：低渗处理细胞时间过长，细胞膜往往过早破裂，以致分裂细胞或染色体丢失；如果处理时间不足时，细胞膨胀不够，则染色体分散不佳