醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究

1、第2章 醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究第2章 醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.1 引言醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属30，又名醋酸细菌。醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.60.8×1.03.0 m。醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长31。醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机

2、酸，而且还有醇类32。本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。2.2 实验材料与方法2.2.1材料与仪器分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.a。表2.2.1.a 主要仪器设备 tab 2.2.1.a main instrument equipment主要仪器型号厂家生化培养箱双目生物显微镜分析天平手提式不锈钢蒸汽灭菌锅超净工作台精密数字式酸度计pyx-250s-abme（ba/e3）bs224sdsx-280bsw-cj-1fdphs-3c长沙科技科力仪器德国莱卡北

3、京化丰上海南鹏上海科技试验试剂： 葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、caco3、(nh4)2so4、k2hpo4、kh2po4、mgso4·7h2o、fecl3、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。2.2.2培养基33-37表2.2.1. 培养基成分表tab 2.2.1.medium composition名称葡萄糖酵母膏无水乙醇(v/v)琼脂caco3备注基础发酵培养基1%1%3%ph 4. 5分离培养1%1%3%2%2%ph自然斜面保藏培养基1%1%3%2%1%ph自然液体保藏培养基1%1%1%ph自然改进后的斜面液体保藏培养基1%1%3%2%1%ph自然发酵培

4、养基1%1%7%ph 4. 5horyer-frateur培养基3%ph自然gyc培养基10%5%2%2. 5%ph自然高糖培养基30%1%2%2%ph自然生酮培养基3%2%甘油3%产5-酮基葡萄糖酸盐培养基3%1%2%2%ph自然氧化乙酸培养基1%1%2%乙酸钙1% ph 7.2氧化乳酸培养基1%1%2%乳酸钙2% ph7.0-7.2乙醇培养基1%3%2%ph自然注：培养基在斜面保藏培养基上，30培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基其他成分有(nh4)2so40.1%，k2hpo40.1%， kh2po40. 01%，0.025%，fec

5、l30. 0005%；以上培养基均以121灭菌20 min。2.2.3醋酸菌的分离纯化2.2.3.1 分离纯化实验称取醋醅样品5g，液态增殖培养48h后，按照浓度梯度10-6、10-7和10-8，涂布在分离培养基上，培养2d后，挑取平板上单个透明圈大的菌落。连续在平板上培养3次，观察其菌落形态是否一致，选取透明圈又大又清晰的单菌落，转接并保藏于4的冰箱。2.2.3.2 革兰氏染色实验将上述活化后的菌株，接种于新鲜的培养基培养24 h，制作水晶镜片进行革兰氏染色。2.2.3.3 产醋酸定性实验38取活化好的斜面菌种，分别接种于基础培养基中，并加入3% (v/v) 的无水乙醇， 32震荡培养60

6、h，取少量除去菌体的培养液，用naoh溶液（2.5 mol/l）调节ph至7.0，加入56滴5% fecl3溶液，产醋酸细菌会形成红褐色沉淀。根据2.2.3.3试验和2.2.3.4试验结果，筛选出革兰氏阴性且产醋酸的细菌39为醋酸菌。2.2.3.4 醋酸定量实验经过初步筛选后，把所得菌株接种至发酵培养基中，在32、140 r/min恒温震荡培养60 h后，检测其发酵液中总酸，每株平行3组。醋酸定量测定40：精确吸取发酵液2 ml至250 ml三角瓶中，并加入蒸馏水50 ml，滴加12 滴0. 5%的酒精酚酞溶液，用已标定过的0.1 mol/l naoh溶液滴定至微粉色。产酸量(g/l)=(v-

7、v0)×cnaoh×60/样品毫升数；式中：v=发酵液样品滴定耗用的naoh毫升数；v0=以空白培养基为对照滴定耗用的naoh毫升数；cnaoh=naoh溶液的浓度(mol/l)； 60为醋酸分子量。2.2.3.5耐酒精能力实验初筛所得的菌株，分别接种到含有无水乙醇的基础培养基中培养，无水乙醇体积分数从5%到14%，每个梯度相差1%，32恒温培养3d，观察其是否生长，筛选出耐酒精性能好的菌株。2.2.3.6 传代稳定性实验41将上述所筛选出的菌株，每隔一个月，转接纯化后的菌株，连续转接培养7代，并测定其酸度，来判断、筛选，传代最稳定和产醋酸最高的菌株。2.2.3.7 不同保

8、藏方法保藏醋酸菌的存活期限实验43将传代相对稳定性的菌株，分别按照培养基2.2.2中的、转接，待斜面上菌苔丰厚，保藏于24的冰箱内，每隔三个月再次转接，并观察其存活情况。2.2.4 菌种鉴定实验44-452.2.4.1 培养实验观察通过平板培养，观察菌落形态特征，并挑取单个菌落制做水晶片，革兰氏染色，同时在1000倍光学显微镜下观察其细胞形态、大小和排列特征。2.2.4.2 培养特征实验观察所选菌株在平板上培养的情况；观察所选菌株是否能在高糖培养基上生长；观察所选菌株是否能在hoyer-frateur培养基上生长。2.2.4.3 生理生化实验46接触酶的试验：在长势旺盛的平板上，滴加3%的h2

9、o2，观察有无气泡产生。以铵盐为唯一氮源的生长试验：观察在培养基2.2.2中中生长情况。gyc培养基产色素试验：观察在培养基2.2.2中上能否生成棕色的水溶性色素。生酮试验(甘油生成二羟丙酮的试验)：在培养基2.2.2中上，将费林液注满平板，观察菌落周围是否有红色沉淀出现。 产5-酮基葡萄糖酸盐试验：在培养基2.2.2中上，32培养24 h后，观察菌落周围是否有白色不透圈。葡萄糖产酸试验：观察培养基指示剂是否变色。产纤维素试验：在含糖培养基上向菌落上滴加lugol碘液和60%硫酸液，观察菌落周围变化情况。氧化乙酸的能力试验：在培养基2.2.2中上，32培养48 h，观察菌落周围是否出现乳白色的

10、晕圈。氧化乳酸的力试验：在培养基2.2.2中上，32培养48 h，观察菌落周是否出现乳白色的晕圈。在以乙醇为唯一碳源的培养基上，观察其能否生长。2.2.5 发酵条件实验发酵温度单因素实验以培养温度为梯度，26、28、30、32、34、36，将筛选所得的菌种，分别接种于装有100ml醋酸菌发酵培养基的500ml三角瓶中，置于180r/min的恒温摇床培养72h，以产酸量和醋酸菌数来确定最佳生长条件。将筛选所得的菌种，分别接种于分离平板上，观察出现透明圈的时间，确定最快产酸时间。2.3 结果与分析2.3.1 分离筛选分离纯化：从分离平板中挑选出107个单菌落菌株。初步筛选：通过醋酸菌分离培养基筛选

11、，选出44个单菌落产酸菌株。复筛：又经革兰氏染色和醋酸定性试验，淘汰了革兰阳性及不产醋酸的菌株，选出4株醋酸菌株。产酸定量试验，筛选出产酸量大最快的菌株，结果见下图2.3.2.a 图2.3.1.a 4株醋酸菌产酸量测定fig 2.3.1.a four strains in determination of acid acetic acid bacteria耐酒精能力试验，筛选出耐酒精性能好菌株，结果见下图2.3.2.b 图2.3.1.b 4株醋酸菌耐酒精测定fig 2.3.1.b 4 of acetic acid bacteria resistant to alcohol determinat

12、ion然后继续对2株性能较好菌株进行传代培养，确定其传代的稳定性。每一代产酸量见下表2.3.1.a。 表2.3.1.a 4珠醋酸菌传代培养每代产醋酸的测定(g/l)tab 2.3.1.a 4 strains acetic acid bacteria in each generation nestin) cultivating the determination of acetate(g/l)菌株号x1x2x3x41代38.230.931.341.82代39.431.531.543.43代38.330.430.142.34代37.427.326.340.65代35.127.922.738.76代

13、30.624.119.536.97代28.421.814.735.5由表2.3.1.a可以看出，每代发酵培养中，菌株x4的醋酸产量最高，并在传代培养过程中产量稳定，故选该菌株为目的菌株。存活期限试验：把x4菌株接入三种斜面保藏培养基，每隔三个月接种到各方法所用的培养基上。观察其存活情况，见表2.3.1.b：表2.3.1.b 三种方法保藏醋酸菌的存活时间tab 2.3.1.b three methods of acetic acid bacteria survival time of biomaterial时间/月 3691215182124斜面法液体法改进斜面注： “+”表示生长； “+”表示

14、生长良好；”表示不生长。从2.3.1.b看可以出，普通斜面保减法保藏的保藏时间小于3个月；而液体保藏法的保藏时间大于18个月；但改进后的斜面液体保藏法，能在20个月内都保持生长良好，且保藏的时间可达24个月。醋酸菌所产的酸，是造成醋酸菌保藏时间受到限制的原因之一。随着保藏时间的延长，尽管醋酸菌能抵抗一定的酸，但一直处在酸性环境中，醋酸菌会被自己产的酸所杀灭。因此，在菌种生长的很健壮后又加入碳酸钙和液体培养基，既降低了氧气的含量，又中和了产生的醋酸，使其在生长和保护方面较液体保藏更加先进了一步，保藏效果也更好。2.3.2 分析鉴定结果2.3.2.1 菌株x4形态特征显微镜下细胞呈椭圆或短杆状，无

15、芽孢，单个或成对、成链排列。 2.3.2.2 x4培养特征x4在基础平板培养基上生长旺盛，形成灰白色圆形菌落，表面光滑、凸起，边缘整齐，培养48h能产酸，使caco3溶解形成明显的透明圈。继续培养能氧化乙酸产生co2和h2o，菌落周围出现乳白色透明圈。在斜面培养基上生长良好，培养2 d产酸。能在12% (v/v)乙醇的培养基上和30%葡萄糖培养基上生长，但在hoyer-frateur培养液中不生长，也不产色素。液体培养摇瓶产酸较快，静止培养时在液面形成少量菌膜，产酸较慢。平板菌落形态见下图2.3.2.a：图2.3.2.a x4菌落形态图fig 2.3.2.a x4 colony morphol

16、ogy diagram2.3.2.3 生理生化实验结果接触酶试验阳性，试验说明x4为好氧菌，所以迅速形成大量气泡。在hoyer-frateur培养液中不生长。在gyc培养基不产生水溶性棕色色素。生酮试验结果为阴性，无红色沉淀出现。不产生5-酮基葡萄糖酸盐。产葡萄糖产酸试验结果为阳性。产纤维素试验结果为阴性。氧化乙酸试验为阳性，试验说明x4可以氧化乙酸钙，产生co2和水，co2又和钙结合成乳白色的晕圈。氧化乳酸试验为阳性，试验说明x4可以氧化乳酸，产生co2和水， co2又和钙结合成乳白色的晕圈。以乙醇为唯一碳源的培养基生长试验试验说明x4可以在以乙醇为唯一碳源的培养基生长。2.3.3 分析鉴定

17、结果在以上生理生化试验的基础上，查阅伯杰细菌鉴定手册(第8版)和常见细菌系统鉴定手册进行鉴定分析。根据表2.3.3.a可以看出，x4氧化醋酸和乳酸成co2和h2o，所以x4为醋酸杆菌属，而不是葡糖杆菌属和假单胞菌属。表2.3.3.a 葡糖杆菌、醋酸菌属、假单胞菌属比较表tab 2.3.3.a glucnobacter、acetobacter、pseudomonas comparison table生理生化特征葡糖杆菌属醋酸菌属假单胞菌属鞭毛运动作用极生或没有周身或没有极生于ph4.5可生长+-氧化：ph4.5时氧化乙醇成醋酸+(m)a+(s)-醋酸氧化成co2-+d乳酸氧化成co2-+葡萄糖氧

18、化成葡萄糖酸+dd静止细胞氧化氨基酸-+krebs循环（三羧酸循环）-+产生5-酮基葡萄糖酸产生+d-生酮作用+d-醌类： q10+-q9-+水解： 乳糖和淀粉-d明胶-/w-d呈绿色或荧光色素-d注：此表引用伯杰氏手册第326页；a、m.中等；s.强；w.弱。根据表2.3.3.b比较出，根据接触酶试验、甘油生酮试验、产纤维素试验和以乙醇为唯一碳源生长试验结果区别于其他菌株，所以判断x4为巴氏醋杆菌罗旺亚种 (a· lovaniensis)，并进行相同试验，得出结论x1为巴氏醋杆菌埃斯群亚种(a·estunensis)。表2.3.3.b 各类醋酸菌特征表tab 2.3.3.

19、b all kinds of acetic acid bacteria features list醋化醋杆菌巴氏醋杆菌过氧化醋杆菌a1a2a3a4b1b2b3b4b5c醋化醋杆菌亚种醋化醋杆菌奥尔兰亚种醋化醋杆菌木质亚种醋化醋杆菌液化亚种巴氏醋杆菌巴氏亚种巴氏醋杆菌罗旺亚种巴氏醋杆菌埃斯群亚种巴氏醋杆菌攀升亚种巴氏醋杆菌奇异亚种过氧化醋杆菌接触酶（+）（+）（+）（+）（+）（+）（+）（+）（-）（-）在甘油或赤鲜醇中生酮+a+a+a+a-b-b-b-b-形成5-酮葡萄糖酸盐（+）（+）（+）（+）-形成2-酮葡萄糖酸盐（+）（+）（+）（+）d-葡萄糖酸盐+（+）+-在乙醇上生长+-（-）

20、+（-）+-+产生：纤维素-+-+-吡喃酮-+-褐色素-+-g+c，克分子/%59-6560-6162-636455-626255-5661-64注：此表引用伯杰氏手册第365页；a.中度到强；b.阴性或很弱；( ).通常为阳性或阴性。2.3.4 发酵条件实验结果培养72h后，分别检测各个温度下产酸量和总菌数，结果见下图2.3.4.a和表2.3.4.b：注：方型为x4菌株；柱型为x1。图2.3.4.a 不同温度下产酸量fig 2.3.4.a production of acid at different temperatures表2.3.4.b 不同温度下醋酸菌数量(108cfu/ml)tab 2.3.4.b number of different temperature acetic acid bacteria2628